一种三倍体牡蛎倍性鉴定及其遗传物质来源的分析方法与流程

1.本发明属于分子细胞遗传学领域，具体的涉及一种三倍体牡蛎倍性鉴定及其遗传物质来源的分析方法。


背景技术：

2.染色体是遗传物质的载体，研究物种染色体数量及组成，不仅可以进行物种的染色体倍性鉴定，也有助于确定物种的培育方式，遗传物质的分子鉴定还可以进一步确定子代父本和母本的遗传信息，对资源的开发利用和遗传育种都有重要的指导意义。牡蛎一般富含糖原、氨基酸、牛磺酸等活性元素，是一种天然的具有食补作用的海珍品。三倍体牡蛎相比二倍体生长快、个体大、品质更高。三倍体长牡蛎于上世纪80年代中期在美国诱导、培育并且养殖成功。之后我国在此项研究也取得了很大的进展，牡蛎三倍体产业化的发展十分迅速，已形成了一定的生产规模。三倍体牡蛎生产方式主要有两种：传统上是在人工授精过程中，利用不同方法(比如化学试剂细胞松弛素b和6-二甲基氨基嘌呤)处理受精卵，抑制第二极体排放来生产三倍体牡蛎，这种人工诱导三倍体牡蛎所用药品有毒性、程序复杂、诱导率低且不稳定，无法进行规模化生产；目前市面上销售的主要是通过四倍体牡蛎父本和二倍体牡蛎母本杂交生产100％的三倍体，不需要药物和任何处理。用四倍体和二倍体杂交生产的三倍体牡蛎，比人工诱导的三倍体牡蛎杂合度高，更为健壮。
3.近年来，我国牡蛎三倍体苗种生产和销售的规模迅速扩大，山东乳山和荣成一带三倍体牡蛎养殖规模非常大，据统计，2021年仅乳山的牡蛎三倍体苗种总数约达6亿片，每片苗出成贝预计1.5～2kg，亩产约为3000kg，产量可观。然而2021年7～9月夏季高温期间河北秦皇岛和江苏连云港养殖的三倍体牡蛎出现了大规模死亡现象，不少三倍体牡蛎养殖户遭遇绝产境地，经济损失严重。最初调研推测是夏季高温水污染引起的病害问题，但同一海区相邻的不同来源的三倍体牡蛎死亡率和生长情况截然不同，同时投入海中养殖的牡蛎，有的生长快，有的生长慢；有的全军覆没，有的基本没有死亡情况。遭受损失的养殖户对三倍体牡蛎苗种的品质产生了怀疑，纷纷要求做染色体倍性检测。异源三倍体牡蛎，一般都是巨牡蛎属的一个物种四倍体父本和另一个物种二倍体母本杂交而来，不仅具有三倍体牡蛎生长快抗逆性强的优势，还有明显的杂交优势。由此看来，牡蛎三倍体苗种生产方式决定了苗种的品质。因此，迫切需要一种简易便捷的三倍体牡蛎遗传物质组成鉴定的方法来帮助牡蛎养殖户确定三倍体牡蛎的品质，也为牡蛎消费者确定食用安全性。
4.多倍体的倍性检验方法主要包括染色体制片计数法、显微荧光法和流式细胞仪法等。其中染色体计数是最常用且最准确检查倍性的一种方法，过去染色体制备及分析流程比较麻烦，要获得好的分裂相并分析出结果需要花费大量的时间，我们对染色体制备技术和分析流程进行改良和简化之后，能快速完成单个个体的染色体制备和倍性分析。显微荧光法是通过显微荧光测定细胞核的dna量，由于三倍体细胞核的dna量为二倍体的1.5倍，根据比较来判断倍数，这种方法的装置是由荧光显微镜和显微测光装置组成，dna经荧光色素dapi(4，6-diamidino-2-phenylindole)染色后放于荧光显微镜下，通过测光装置测定从细
胞核中发出的荧光强弱，从而判断是二倍体还是多倍体(弭忠祥，杨受宝，张宸豪.贝类染色体组工程的研究.水产科学，2004,23(6)：38-40)。利用流式细胞仪大量、快速地检测贝类多倍体的诱导率，可能是最简便的一种方法(丁君，张国范，常亚青.流式细胞术(fcm)在贝类倍性检测中的应用.大连水产学院学报，2000，15(4)：259-263)。流式细胞仪每秒钟可测定细胞数达1000～1500个，可以保证获得生物体细胞的群体特征，得到统计学上的意义，而且每个细胞只要带100～3000个荧光分子就可被检测出，具有高的灵敏度及分辨率。显微荧光法和流式细胞仪法都需要专业性很强的操作，还需要较昂贵的仪器设备，且都无法鉴别体细胞中多1到数条染色体或少1到多条染色体的非整倍体，这两种检测方法都无法排除遗传缺陷的风险，因此都无法准确鉴别牡蛎的品质。
5.wang和guo(haiyan wang and ximing guo.identification of crassostrea ariakensis and related oysters by multiplex species-specific pcr.journal of shellfish research，2008，27(3)：481-487)建立了一种采用coi基因多重pcr方式，能快速鉴定巨牡蛎属5个种，分别是近江牡蛎(c.ariakensis)、香港巨牡蛎(c.hongkongensis)、葡萄牙牡蛎(c.angulata)、长牡蛎(c.gigas)和熊本牡蛎(c.sikamea)，而这几种牡蛎均开展过三倍体或四倍体的诱导研究，其遗传物质均有可能出现在市售的三倍体牡蛎体内，这为我们奠定了物种鉴定的技术基础。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题在于提供一种简易的三倍体牡蛎倍性鉴定及其遗传物质来源的分析方法，所述通过对现有牡蛎染色体制备和分析流程的改进，设计一个单个个体染色体制备流程，以最经济却又最便捷的方法制备出大量的分散较好的中期分裂相染色体，进行染色体倍性分析；同时设计5个巨牡蛎属物种coi基因多重pcr技术来鉴定三倍体牡蛎的父本及母本。利用本发明方法能满足快速准确鉴定三倍体牡蛎种质的需求，制备出单个个体的大量的中期分裂相染色体可满足倍性分析、原位杂交分析等有关染色体研究的需求，分子标记进一步确定三倍体的父本及母本，操作步骤简单，鉴定结果精确，能有效检测出非整倍体等遗传缺陷的个体。
7.本发明具体的包括以下四个步骤和操作方法：
8.一种三倍体牡蛎倍性鉴定及其遗传物质来源的分析方法，所述方法包括：1)单个个体三倍体牡蛎中期分裂相染色体标本制备；2)体细胞染色体众数分析；3)多重特异性pcr；4)三倍体牡蛎遗传物质来源分析；
9.所述的单个个体三倍体牡蛎中期分裂相染色体标本制备：取牡蛎鳃组织制备染色体样本，其余软体组织用于分子鉴定；
10.进一步，所述的个体中期分裂相染色体标本制备，包括以下5个步骤：
①
预低渗和秋水仙素处理，把剖取的取活性良好的单个个体的牡蛎鳃组织或稚贝软体组织放入含有0.04％秋水仙素的50％灭菌海水中处理30min；
②
低渗：将预低渗和秋水仙素处理后的组织放入0.075mol/l kcl溶液中低渗30～45min；
③
固定：取出低渗的组织，放入冰箱预冷的卡诺氏固定液中充分固定，所述的卡诺氏固定液是指3份无水乙醇和1份冰醋酸的混合液，所述的充分固定，是指每15min换一次固定液，共换4次；
④
解离：取3～5根鳃丝放入1ml 50％冰醋酸溶液中，静置4℃冰箱中，使鳃丝细胞游离到解离液中，约10min；
⑤
制片：用吸管轻轻
吹打解离液数次后，采用热滴片的方式进行制片，单个个体制备3张载玻片的标本，每张载玻片滴3滴样品；
⑥
染色：热滴片自然晾干后用市售的10％giemsa染色约25min，自来水细流冲洗掉染液后，制片斜倚自然晾干；
11.所述的染色体众数分析，单个个体的制片标本在低倍镜下找到中期分裂相之后，用油镜进行拍照，统计染色体数量，如此连续观察若干个分裂相，有半数以上染色体数目一致，即为这个个体的染色体众数；
12.所述的多重特异性pcr，首先取单个个体的组织进行总dna提取；然后利用coi-1 forward,coi-2 reverse两种通用外部引物和5种特异性内部引物(表1)(引自：wang&guo，2008)对线粒体coi的部分序列进行扩增；
13.表1多重特异性pcr引物
[0014][0015]
注：表格中各物种引物的3’末端未参照wang&guo(2008)引入错配核苷酸，也能特异性扩增。
[0016]
多重特异性pcr反应体系：10
×
pcr buffer 2.5μl；
[0017]
mgcl 2μl；
[0018]
dntp 1.5μl；
[0019]
外部通用引物0.9μl；
[0020]
内部特异性引物0.6μl；
[0021]
模板dna 0.5μl；
[0022]
tap酶0.2μl；
[0023]
ddh2o定容至25μl。
[0024]
pcr扩增coⅰ反应程序：
[0025]
[0026]
多重pcr琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统检测电泳结果；
[0027]
所述的三倍体牡蛎遗传物质来源分析，正常的三倍体染色体众数为30条，多一两条或数条，以及少一两条或数条均为非整倍体，属于遗传缺陷的个体；对于群体的染色体倍性分析，从群体中随机抽检10个个体，单个个体进行染色体众数统计，来确定群体中三倍体率；多重pcr琼脂糖电泳数据读取，183bp是近江牡蛎的特异性条带，222bp是葡萄牙牡蛎的特异性条带，269bp是长牡蛎的特异性条带，387bp是香港巨牡蛎的特异性条带，546bp是熊本牡蛎的特异性条带，697bp是牡蛎通用coi特异性条带；根据marker确定特异性条带的大小即可判断三倍体遗传物质的来源，再根据同一个体的泳道中特异性条带数及亮度来判别四倍体父本和二倍体母本，同一泳道中除了牡蛎通用特异性条带外，有另外两条特异性条带的，亮度高的为四倍体父本，亮度低的为二倍体母本；同一泳道除了牡蛎通用特异性条带外，另外仅一条特异性条带且亮度与通用特异性条带亮度相同，则四倍体父本和二倍体母本均为同一个物种。
[0028]
本发明与已有技术相比的有益效果：
[0029]
1.本发明简化了牡蛎染色体制备步骤，缩短了牡蛎染色体制备及分析时间，整个流程仅需2～3小时。单个个体制备的染色体制片干净明晰，便于观察和计数。活体样本就地取材活性高，所取组织分裂旺盛，无需前期增加分裂相步骤。单个个体的染色体众数分析相比流式细胞仪检测结果精确到单条染色体，物种染色体倍性分析结果精确，能准确评估三倍体牡蛎遗传缺陷的风险。
[0030]
2.多重特异性pcr的分子鉴定，能进一步确定三倍体牡蛎的四倍体父本和二倍体母本，在染色体和分子水平上对三倍体牡蛎进行遗传物质组成、染色体倍性、亲贝鉴定等分析，染色体制备及倍性分析与多重特异性pcr的分子鉴定可结合使用，也可单独开展，分析结果均有助于指导三倍体育种亲贝选择和牡蛎养殖户对苗种的选择。
附图说明
[0031]
图1异源三倍体多重特异性pcr胶图；
[0032]
图2同源三倍体多重特异性pcr胶图；
[0033]
图3实施例3牡蛎染色体倍性(含三倍体、非整倍体和二倍体)；
具体实施方式
[0034]
下面通过具体实施例结合附图对本发明进行详细说明，以下是最佳实施例具体操作工艺过程，本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0035]
实施例1：
[0036]
2021年10月26日，乳山市深海生物科技有限公司于洪军总经理送来2批三倍体牡蛎，要求检测染色体倍性，一批壳高11～15cm大个体，一批壳高8～11cm小个体，我们随机挑选小个体10枚，大个体3枚进行染色体制备及分析，同时对对应的10枚小个体进行多重特异性pcr分子鉴定分析。
[0037]
完成上述操作过程具体操作如下：
[0038]
三倍体牡蛎遗传物质组成快速鉴定的方法，其步骤包括：1)单个个体三倍体牡蛎中期分裂相染色体标本制备；2)体细胞染色体众数分析；3)多重特异性pcr；4)三倍体牡蛎
遗传物质组成分析；
[0039]
将牡蛎用自来水快速冲刷干净壳表的浮泥，投入洁净的海水中暂养，海水温度为室温，准备好染色体制备器械、试剂和样品冻存的液氮。随机选取活性良好的个体，分别剖取约0.5cm长的鳃组织为染色体制备样本，去除消化腺之后其余软体组织液氮冻存供分子鉴定分析；然后进行单个个体中期分裂相染色体标本制备，步骤依次为：
①
用含0.04％秋水仙素50％海水处理30min；
②
0.075mol/l kcl溶液低渗30min；
③
用冰箱预冷的卡诺氏固定液中充分固定，每15min换一次固定液，共换4次；
④
取3～5根鳃丝放入1ml 50％冰醋酸溶液中解离约10min；
⑤
采用热滴片法制片，单个个体制备3张载玻片的标本，每张载玻片滴3滴样品；
⑥
热滴片自然晾干后用市售的10％giemsa染色30min，自来水细流冲洗掉染液后，制片斜倚自然晾干。
[0040]
单个个体的三张制片在10
×
或20
×
物镜和10
×
目镜的显微镜下观察，找到中期分裂相之后，在油镜下进行拍照，使用photoshop软件进行染色体数量统计。每个个体连续观察10个分裂相，有5个以上染色体数目都是30条，进而确定这批样品的染色体众数均为30条。
[0041]
我们对液氮冻存的组织进行总dna提取；利用coi-1 forward,coi-2 reverse两种通用外部引物和5种特异性内部引物(见表1)对线粒体coi的部分序列进行多重特异性pcr扩增；
[0042]
多重特异性pcr反应体系：10
×
pcr buffer 2.5μl；mgcl 2μl；dntp 1.5μl；外部通用引物0.9μl；内部特异性引物0.6μl；模板dna 0.5μl；tap酶0.2μl；ddh2o定容至25μl。
[0043]
pcr扩增coⅰ反应程序：
[0044][0045]
多重pcr琼脂糖电泳，1％平板琼脂糖凝胶，130v，电泳30min，凝胶成像系统检测电泳结果见图1。图中a1～10和b1～b10对应为相同个体，即随机选取的那10个个体，但反应体系不同；m为marker；其中269bp为长牡蛎coi特异性条带大小，546bp为熊本牡蛎coi特异性条带，697bp为牡蛎通用coi特异性条带大小，图中269bp长牡蛎coi特异性条带亮度较546bp熊本牡蛎coi特异性条带高得多。说明所有个体中都存在长牡蛎的基因，同时还存在熊本牡蛎的基因。最终鉴定该批次送检样品全部为异源三倍体牡蛎，其遗传物质组成父本是长牡蛎四倍体，母本是熊本牡蛎二倍体，与公司提供的父母本信息一致。
[0046]
实施例2：
[0047]
2021年6月2日，乳山市深海生物科技有限公司送来3种牡蛎样品，希望进行染色体倍性检测，所送检的样品量不多：长牡蛎成贝十余枚；三倍体牡蛎成贝约10枚，附扇贝壳的牡蛎稚贝数十粒，壳径0.5～1cm。我们从这3种牡蛎样品中随机抽检4个个体，分别制备中期
分裂相染色体，同时，我们还分别对三倍体个体进行多重特异性pcr分子标记分析，扩增结果见胶图2。
[0048]
检测结果表明，长牡蛎成贝样品中抽检的4个个体染色体众数均为20条，染色体倍性为二倍；牡蛎三倍体成贝中抽检的4个个体，染色体众数均为30条，染色体倍性为三倍；附三倍体壳的牡蛎稚贝抽检的4个个体，染色体众数均为30条，其染色体倍性亦为三倍。多重特异性pcr扩增结果表明同一泳道中仅1条特异性条带，条带大小为269bp，是长牡蛎coi特异性条带，未见其他牡蛎coi基因特异性条带。图中a1～a4为三倍体成贝；a5～a8为三倍体稚贝；m为marker；b1～b4为三倍体成贝，与a1～a4相对应；b5～b8为三倍体稚贝，与a5～a8相对应。最终鉴定该批次送检的三倍体牡蛎样品全部为同源三倍体牡蛎，即其遗传物质组成父本是长牡蛎四倍体，母本是长牡蛎二倍体，后经公司生产数据核实，该批次的三倍体牡蛎确实为同源三倍体。
[0049]
实施例3：
[0050]
2021年10月2日，乳山市某养殖公司自述有采购三倍体牡蛎苗种进行养殖的意愿，希望养殖前对意向采购的苗种进行染色体倍性检测。快递寄来30余枚牡蛎幼贝，壳高5～8cm，我们从中随机选取10个个体，一一制备染色体标本，10个个体分别命名为个体1、个体2、个体3、
……
、个体9、个体10。该批次样品中10个个体对应的中期分裂相染色体图及数据见图3。
[0051]
检测结果表明，所提供牡蛎样品中随机抽取的10个体中有6个个体的体细胞染色体数都是30条，为完整的三倍体；10个个体中个体4染色体众数为31，个体7和个体8的染色体众数为29，为非整倍体；个体6的染色体众数都是20，为二倍体。因此，该批次送检样品完整三倍体率为60％；非整倍体率为30％；二倍体率为10％，推测这批三倍体苗种有可能是人工诱导培育。