茯苓荧光定量pcr检测试剂盒及鉴定方法
技术领域
1.本发明涉及真菌类中药检测技术领域，更具体地说，是一种茯苓dna荧光定量pcr检测试剂盒及鉴定方法。
背景技术：2.茯苓为多孔菌科真菌茯苓poria cocos(schw.)wolf的干燥菌核，是中国延用千年的传统中药，可与多种中药相互配伍，且不分季节，不管寒、温、风、湿等疾病，都能发挥其独特功效，其化学成分有三萜类、多糖类、甾体、脂肪酸、蛋白质、腺嘌呤、卵磷脂、氨基酸以及钙、镁、铁、钾等无机元素，研究表明其有调节免疫功能、抗肿瘤、抗炎等多方面药理作用，还有保肝、抗衰老、降血糖等作用，作为药食两用真菌类药材，是人们馈赠亲友的佳品。
3.茯苓是我国珍贵的中药资源，具有利湿、宁心和免疫调节等功效，可用于医治水肿、尿少、脾胃不和等症，因此被广泛用于保健食品和医药等领域，是开发前景广阔的药食两用真菌类药材。茯苓常常生于山坡或林下，主产地为皖、鄂、豫、滇，其中以滇质量最佳。茯苓因其独特的药理作用，临床配伍率极高并且在保健品市场备受人们追捧，因此茯苓市场乱象丛生，大量与其形态相似易混淆的伪品充斥市场，目前市场上最常见的伪品有猪苓、葛根、天花粉和山药，这些药材虽然外观相似，但功效显著不同，这些伪品的出现会导致药材的药理作用降低从而影响临床用药有效性，不仅严重损害并阻碍了茯苓产业的健康发展，还严重威胁着人们的身体健康，亟待建立一种高效、简便、快速的方法鉴别茯苓真伪。
4.2015年《中国药典》一部规定茯苓的鉴定方法为性状鉴定、显微鉴定与薄层鉴定，这些分析方法都是对物种的表型进行分析，易受生长环境、发育阶段、采收季节、加工炮制等因素影响，具有很大的变异性和可塑性，主观性强、操作繁琐，而且仪器昂贵，需要专业人士进行操作与判断，难以满足市场及有关部门机构快速鉴别的需要，因此，建立一种有效的茯苓鉴定方法尤为重要。随着分子生物学技术的不断发展，从分子水平出发，利用生物信息学及分子生物学技术对茯苓进行鉴定，国内外文献未见报道。
5.本发明人遵循真核生物核糖体的rna(rdna)作为遗传信息的载体，是研究植物的系统发育及分类的理想对象，其中核糖体内转录间隔区(its)序列是更精确的标记，其结构是高度重复的串联单位，各位点间协同进化，常用于物种鉴定和系统进化研究，其中its1作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。选择its1作为分子遗传学标记，建立荧光定量pcr反应，为茯苓真伪鉴别提供了一条新的途径。
6.荧光定量pcr(qpcr)是在建立pcr反应体系时增添染料或者探针，通过持续记录荧光信号强度变化反应dna浓度的变化，从而实现定性或定量鉴别。qpcr采用完全闭管检测，无须pcr后处理，避免了交叉污染和假阳性，整个试验所需仪器设备较少，检测时间短，由于采用仪器检测器检测扩增反应的荧光,放大了反应信号，由仪器判读试验结果，灵敏度较高。该方法具有特异性强、准确性高、检测范围宽和操作简单等特点，目前在临床疾病诊断、食品安全、中药鉴定等方面已有广泛应用。
技术实现要素：7.本发明的目的是在茯苓内转录间隔区序列的基因组文库基础上，采用生物信息学技术对茯苓内转录间隔区序列的基因组进行筛选，设计可有效地区分茯苓、猪苓、葛根、天花粉和山药的特异性dna序列，利用荧光定量pcr技术在反应体系中加入特异性引物，针对目的模板扩增目的片段。使用方便的荧光定量pcr检测方法，具有节省时间、降低成本和提高效率的特点，并提供简便、快速、检测结果可靠的鉴定方法。
8.本发明的目的是由以下技术方案来实现的：
9.一种茯苓荧光定量pcr检测试剂盒,其特征是，它包含：
10.(a)鉴定反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，待检样本dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
11.(b)阳性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，茯苓dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
12.(c)阴性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，余为双蒸馏水。
13.茯苓荧光定量pcr鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：
14.(1)设计一对茯苓荧光定量pcr引物：
15.引物(茯苓，扩增长度101bp)
16.forward primer：5
′
gcaccgtctacagccatcttcc3
′
17.reverse primer：5
′
cctccccacgccccaataaatg 3
′
18.(2)人工合成核糖体内转录间隔区1(its1)特异寡核苷酸引物，采用abi3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法合成；
19.(3)建立反应体系
20.分别将待测样品基因组dna加入荧光定量pcr检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各100μl加入反应管中，反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中按下列程序进行:
21.95℃预变性10min，95℃15s，64℃30s，72℃30s，40个循环，溶解曲线60-95℃，数据采集；
22.(4)结果判定
23.根据确定的反应体系及反应条件，将反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中进行荧光定量pcr扩增反应，通过检测荧光染料的信号有无及ct值对茯苓真假进行判定。
24.本发明的茯苓荧光定量pcr检测试剂盒是利用茯苓内转录间隔区序列具有的种属特异性，能够准确同时区别茯苓、猪苓、葛根、天花粉和山药的特异性；鉴定方法具有简便、快速、检测结果可靠等优点。
附图说明
25.图1及图2为试剂盒检测茯苓鉴定结果示意图。
26.注：1：茯苓对照品；2：茯苓；3：猪苓；4：天花粉；5：葛根；6：山药；7：无菌双蒸水
27.图3及图4实施例一检测猪苓、葛根、天花粉和山药鉴定结果示意图。
28.注：1：阳性对照；2：猪苓；3：天花粉；4：葛根；5：山药；6：无菌双蒸水
具体实施方式：
29.下面利用实施例一对本发明作进一步描述。
30.一种茯苓荧光定量pcr检测试剂盒,其特征是，它包含：
31.(a)鉴定反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，待检样本dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
32.(b)阳性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，茯苓dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
33.(c)阴性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，余为双蒸馏水。
34.茯苓荧光定量pcr鉴定方法，其特征是，它包含下述步骤：
35.(1)设计一对茯苓荧光定量pcr引物：
36.引物(茯苓，扩增长度101bp)
37.forward primer：5
′
gcaccgtctacagccatcttcc3
′
38.reverse primer：5
′
cctccccacgccccaataaatg 3
′
39.(2)人工合成核糖体内转录间隔区1(its1)特异寡核苷酸引物，采用abi3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法合成；
40.(3)建立反应体系
41.分别将待测样品基因组dna加入荧光定量pcr检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各20μl加入反应管中，反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中按下列程序进行:
42.95℃预变性10min，95℃15s，64℃30s，72℃30s，40个循环，溶解曲线60-95℃，数据采集；
43.(4)结果判定
44.根据确定的反应体系及反应条件，将反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中进行荧光定量pcr扩增反应，通过检测荧光染料的信号有无及ct值对茯苓真假进行判定，判定方法如下：在空白对照无ct值且无扩增曲线条件下，若待测样品出现典型“s型”扩增曲线，且ct值小于31时，判定为茯苓正品，参照图1与图2。
45.实施例二对茯苓伪品药材进行鉴定
46.1.材料
47.标准品与对照品购自中国食品药品检定研究院与国家标准物质资源平台。5批次茯苓标准品、猪苓、葛根、天花粉、山药(批号：121117～201910、ycwkq20111201、121551～201805、121361～202004、121137～201807)
48.2.方法
49.2.1检测样本基因组dna提取采用改良ctab法提取样品基因组dna。
50.2.2pcr引物设计与合成
51.(1)设计一对茯苓特异寡核苷酸引物，如下引物
52.引物(茯苓，扩增长度101bp)
53.forward primer：5
′
gcaccgtctacagccatcttcc3
′
54.reverse primer：5
′
cctccccacgccccaataaatg 3
′
55.(2)人工合成核糖体内转录间隔区1(its1)特异寡核苷酸引物，采用abi3900高通量合成仪，固相亚磷酰胺三酯法合成；
56.2.3建立反应体系
57.(a)鉴定反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，待检样本dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
58.(b)阳性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，茯苓dna 0.2μl，余为双蒸馏水；
59.(c)阴性对照反应体系：总体系为20μl，其中2
×
realstar green power mixture 10μl，上下游引物0.2μl，余为双蒸馏水。
60.2.4确定反应程序
61.分别将待测样品基因组dna加入荧光定量pcr检测试剂盒的(a)鉴定反应体系、(b)阳性对照反应体系和(c)阴性对照反应体系的总体系各20μl加入反应管中，反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中按下列程序进行:
62.95℃预变性10min，95℃15s，64℃30s，72℃30s，40个循环，溶解曲线60-95℃，数据采集；
63.2.5结果判定
64.根据确定的反应体系及反应条件，将反应管置于pikoreal实时定量pcr仪中进行荧光定量pcr扩增反应，通过检测荧光染料的信号有无及ct值对茯苓真假进行判定，判定方法如下：在空白对照无ct值且无扩增曲线条件下，若待测样品出现典型“s型”扩增曲线，且ct值小于31时，判定为茯苓正品，参照图3与图4。