一种新型靶向CD33单域抗体的开发的制作方法

本发明涉及生物医药领域。具体地说，本发明涉及抗cd33单域抗体。

背景技术：

1、cd33是髓系细胞分化抗原，分子量为67kd，主要分布在髓系血细胞，特别是在分化的早期阶段。cd33在90％以上的急性髓系白血病患者都有表达。在造血干细胞表面没有表达,在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达,因此cd33成为髓系白血病治疗的良好靶点,目前已有多款针对cd33靶点的抗体药物，例如，吉妥单抗(吉妥珠单抗)是一种靶向cd33的免疫偶联物，常被用于治疗急性髓系白血病(aml)。吉妥单抗在于cd33抗原结合时，它可以被吸收进细胞，然后在癌细胞内释放卡其霉素将其杀死，由于多达90％的aml患者都存在cd33抗原，使得吉妥单抗具有良好的适用性。

2、本发明拟开发一种新型的单域抗体，后期可以开发成cd33-car-t或adc药物，靶向治疗aml。

3、目前cd33抗体药物用的抗体大部分是单克隆抗体。然而，单克隆抗体可能存在分子量较大，具有一定免疫原性等问题，并且其组织穿透力、溶解度和稳定性均有待提升。

4、因此，本领域有需要开发一种新型的靶向cd33的药物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种针对cd33的单域抗体及其应用。

2、在本发明的第一方面，提供了一种抗cd33单域抗体，所述的抗cd33单域抗体的vhh链的互补决定区cdr的氨基酸序列为选自下组的一种或多种：

3、(1)seq id no:5所示的cdr1、seq id no:6所示的cdr2、和seq id no:7所示的cdr3；

4、(2)seq id no:8所示的cdr1、seq id no:9所示的cdr2、和seq id no:10所示的cdr3；

5、(3)seq id no:5所示的cdr1、seq id no:11所示的cdr2、和seq id no:12所示的cdr3；和

6、(4)seq id no:13所示的cdr1、seq id no:14所示的cdr2、和seq id no:15所示的cdr3。

7、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体能够与cd33特异性结合。

8、在另一优选例中，所述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与cd33特异性结合能力的衍生序列。

9、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体的vhh链的互补决定区cdr的氨基酸序列为seq id no:5所示的cdr1、seq id no:6所示的cdr2、和seq id no:7所示的cdr3。

10、在另一优选例中，所述抗cd33单域抗体还包括框架区fr。

11、在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。

12、在另一优选例中，所述的框架区fr1、fr2、fr3和fr4具有衍生自seq id no:1、2、3或4的序列。

13、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体的vhh链具有选自seq id no:1、2、3或4所示的氨基酸序列。

14、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体的vhh链具有seq id no:1所示的氨基酸序列。

15、在另一优选例中，所述的抗cd33的单域抗体包括单体、二价体(二价抗体)、和/或多价抗体。

16、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体包括人源化抗体、骆驼源抗体、嵌合抗体。

17、在本发明的第二方面，提供了一种抗cd33的抗体，所述抗体包括一个或多个如本发明第一方面所述的抗cd33的单域抗体的vhh链。

18、在另一优选例中，所述的抗cd33单域抗体的vhh链的氨基酸序列选自seq id no:1、2、3或4所示的序列。

19、在另一优选例中，所述的抗cd33的抗体包括单体、二价体(二价抗体)、和/或多价抗体。

20、在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、或如本发明第二方面所述的抗体。

21、在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的抗cd33单域抗体的核酸分子。本发明的核酸可为rna、dna或cdna。

22、在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

23、在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：dna、rna、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

24、在另一优选例中，所述的表达载体为lenti-higg1-fc2质粒。

25、在本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的表达载体，或其基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。

26、在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。

27、在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。

28、在另一优选例中，所述的宿主细胞为293f细胞。

29、在本发明的第六方面，提供了一种产生抗cd33单域抗体的方法，包括步骤：

30、(a)在适合产生单域抗体的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗cd33单域抗体的培养物；

31、(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗cd33单域抗体；和

32、(c)任选地，对步骤(b)获得的抗cd33单域抗体进行纯化和/或修饰。

33、在本发明的第七方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：

34、(a)如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、或如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体；和

35、(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、酶、细胞因子、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或vlp，或其组合。

36、在另一优选例中，所述的放射性核素包括：

37、(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：tc-99m、ga-68、f-18、i-123、i-125、i-131、in-111、ga-67、cu-64、zr-89、c-11、lu-177、re-188，或其组合；和/或

38、(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：lu-177、y-90、ac-225、as-211、bi-212、bi-213、cs-137、cr-51、co-60、dy-165、er-169、fm-255、au-198、ho-166、i-125、i-131、ir-192、fe-59、pb-212、mo-99、pd-103、p-32、k-42、re-186、re-188、sm-153、ra223、ru-106、na24、sr89、tb-149、th-227、xe-133、yb-169、yb-177，或其组合。

39、在另一优选例中，所述偶联部分为可检测标记物。

40、在另一优选例中，所述的可检测标记物包括放射性核素、金纳米颗粒/纳米棒。

41、在另一优选例中，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il-2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt-心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶-样蛋白质(bphl))或任何形式的纳米颗粒。

42、在另一优选例中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体的vhh链。

43、在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体的vhh链。

44、在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体，如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备：

45、(1)预防和/或治疗cd33相关的疾病的药物；

46、(2)检测cd33的试剂。

47、在另一优选例中，所述的cd33相关疾病包括：癌症、自身免疫性疾病。

48、在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自下组：血液肿瘤、淋巴瘤、实体瘤、或其组合。

49、在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓系白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。

50、在另一优选例中，所述淋巴瘤选自下组：霍奇金淋巴瘤(hl)，弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡淋巴瘤(fl)、慢性淋巴细胞白细胞(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、边缘区淋巴瘤(mzl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、伯基特淋巴瘤(bl)以及其他复杂b细胞非霍奇金淋巴瘤。

51、在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

52、在另一优选例中，所述的cd33相关疾病为急性髓系白血病。

53、在另一优选例中，所示试剂为诊断试剂，较佳地，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

54、在另一优选例中，所述诊断试剂用于：检测样品中的cd33或其片段。

55、在另一优选例中，所述的药物的施用对象为人或非人哺乳动物(如啮齿类动物)。

56、在本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

57、(i)如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物；和

58、(ii)药学上可接受的载体。

59、在本发明的第十方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

60、(i)如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、或如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体；和

61、(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

62、在另一优选例中，所述的标签序列包括fc标签、ha标签和his标签。

63、在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合于cd33。

64、在本发明的第十一方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。

65、在本发明的第十二方面，提供了一种预防和/或治疗cd33相关疾病的方法，所述方法包括，给需要的对象施用如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物。

66、在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

67、在另一优选例中，所述的cd33相关疾病包括癌症或自身免疫性疾病。

68、在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测样品中cd33或其片段的方法，所述方法包括步骤：

69、(1)在体外，将所述样品与如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；

70、(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在cd33或其片段。

71、在另一优选例中，所述的检测包括诊断性的或非诊断性的。

72、在本发明的第十四方面，提供了一种针对cd33相关疾病的诊断方法，包括步骤：

73、(i)从诊断对象获取一样品，将所述的样品与如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体、或如本发明第七方面所述的免疫偶联物接触；和

74、(ii)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示所述的对象患有cd33相关疾病。

75、在本发明的第十五方面，提供了一种重组多肽的制备方法，所述的重组多肽是如本发明第一方面所述的抗cd33单域抗体、或如本发明第二方面所述的针对cd33的抗体，所述的方法包括：

76、(a)在适合表达的条件下，培养如本发明第五方面所述的宿主细胞；和

77、(b)从培养物中分离出所述的重组多肽。

78、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。