RASSF1基因的甲基化检测试剂和方法与流程

本发明涉及rassf1基因的甲基化检试剂和方法。

背景技术：

1、目前，主流的cfdna甲基化检测方法是基于重亚硫酸盐转化的方法。但是，该方法存在许多不足：1、经转化的dna样本需要经受低ph、高温、高浓度的重亚硫酸盐等，这些条件会导致dna大量降解，导致所需的cfdna起始用量较大；2、重亚硫酸盐处理不彻底会导致未甲基化的胞嘧啶转化不完全，出现假阳性的结果；3、未甲基化的胞嘧啶约占人基因组总胞嘧啶数的95％，将未甲基化的胞嘧啶全部转换为尿嘧啶则会严重降低序列复杂性，在对多种靶标分子进行同时检测时，引物设计更困难，导致检测准确性降低，并且增加检测成本；4、重亚硫酸盐转化处理时间长、后续需要反复洗涤纯化、操作繁琐，耗费大量的人力和时间。

2、鉴于现有技术的上述缺陷，本领域需要一种无需重亚硫酸盐转化并且特异性好、灵敏度高的甲基化检测方法。

技术实现思路

1、发明人发现利用位点特异性切割核酸酶的核酸检测体系，可实现对微量cfdna的rassf1基因甲基化检测，无需重亚硫酸盐转化、特异性好、灵敏度高。

2、本发明第一方面提供一种寡核苷酸接头或其核酸类似物修饰变体，所述寡核苷酸接头从5’到3’包含结合序列和如下任一所示的靶标互补序列：seq id no:1第23-36位、seqid no:7第23-35位、seq id no:8第23-43位、seq id no:9第23-43位，所述结合序列包含与捕获寡核苷酸的3’末端序列至少部分相同的序列。

3、在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头还包括核酸延伸阻断修饰。

4、在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于寡核苷酸接头的3’端。

5、在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。

6、在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头的靶标互补序列用于和靶标分子结合。

7、在一个或多个实施方案中，所述靶标分子是选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、crispr-cas体系或错配修复酶中一种或多种酶的酶切产物。

8、在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自glai、fspei、mspji和lpnpi中的任意一种或两种或更多种。

9、在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头如seq id no:1、7-9中任一所示。

10、在一个或多个实施方案中，核酸类似物修饰位于靶标互补序列。优选地，所述核酸类似物包括选自以下的一种或多种：肽核酸、锁核酸、2'-o，4'-c-甲基化架桥rna、2'-甲氧基修饰碱基、2'-o-甲基rna或2'-氟代rna。

11、本发明第二方面还提供一种捕获寡核苷酸或其核酸类似物修饰变体，所述捕获寡核苷酸从5’到3’包括第一通用序列、折叠序列和结合捕获序列，其中，所述折叠序列具有如seq id no:2中第18-31位所示的序列，所述结合捕获序列与本文所述的寡核苷酸接头的结合序列至少部分相同，任选地，所述捕获寡核苷酸在折叠序列和结合捕获序列之间还包含第二通用序列。

12、在一个或多个实施方案中，第一通用序列如seq id no:2第1-17位所示。

13、在一个或多个实施方案中，第二通用序列如seq id no:2第32-48位所示。在一个或多个实施方案中，结合捕获序列如seq id no:2第49-70位所示

14、在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物修饰位于第一通用序列、折叠序列、第二通用序列或其组合。

15、在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物修饰能用于降低被修饰核酸与其配对核酸之间连接的稳定性。

16、在一个或多个实施方案中，所述核酸类似物包括脱氧尿嘧啶核苷(deoxyuridinedu)。

17、在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸的核酸类似物修饰变体如seq idno:10所示。

18、在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸还包括核酸延伸阻断修饰。

19、在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于折叠序列的3’端。

20、在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰位于第二通用序列的5’端。

21、在一个或多个实施方案中，所述核酸延伸阻断修饰包括选自以下的一种或多种：spacer、硫代基团、巯基、氨基或尿嘧啶碱基。

22、在一个或多个实施方案中，所述捕获寡核苷酸如seq id no:2或10所示。

23、本发明第三方面还提供一种核酸检测组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸和本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头。

24、在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括位点特异性切割核酸酶；优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。

25、在一个或多个实施方案中，所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、crispr-cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。

26、在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自glai、fspei、mspji和lpnpi中的任意一种或两种或更多种。

27、在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括：

28、(1)通用引物，所述通用引物(i)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同，或者(ii)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3’端序列与(a)或(b)相同：(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列，(b)(a)的部分序列；更优选地，通用引物从5’到3’包括以下序列：第二通用序列或其3’端部分序列和/或第一结合序列或其5’端部分序列；优选地，通用引物如seq id no:4所示；和/或

29、(2)特异引物，包含与第一通用序列相同或部分相同的序列；优选地，特异引物3’端序列与第一通用序列或其部分序列相同，或与折叠序列或其部分序列相同；优选地，特异引物如seq id no:3所示。

30、在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括探针。

31、在一个或多个实施方案中，所述探针标记有荧光基团和/或淬灭基团。

32、在一个或多个实施方案中，所述荧光基团标记在检测探针的5’端；所述淬灭基团标记在检测探针的3’端。

33、在一个或多个实施方案中，所述荧光基团包括fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的任意一种或多种；所述淬灭基团包括bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的任意一种或多种。

34、在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括dna聚合酶、dntp或mg2+中的任意一种或多种。

35、在一个或多个实施方案中，所述组合物或试剂盒还包括酶切缓冲液和/或pcr缓冲液。

36、本发明还提供一种核酸检测体系，其特征在于，所述体系包括1～100nm本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸、至少1nm(例如1～100nm，优选1-20nm)本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头、1～5u(优选1-2u)taq聚合酶、50～500μm(优选100～300μm)dntp、1～10mm(优选1～5mm)mgcl2和pcr缓冲液；

37、在一个或多个实施方案中，所述体系还包括100～800nm(优选100～400nm)通用引物。

38、在一个或多个实施方案中，所述体系还包括100～800nm(优选100～400nm)特异引物。

39、在一个或多个实施方案中，所述体系还包括100～600nm(优选100～300nm)探针。

40、在一个或多个实施方案中，所述体系还包括至少1u(例如，1～5u，优选1～2u)user酶。

41、在一个或多个实施方案中，所述通用引物、特异引物、探针如本文第三方面所述。

42、在一个或多个实施方案中，所述体系还包括1～20u(优选5～15u、1～10u)位点特异性切割核酸酶；优选核酸外切酶和/或核酸内切酶。

43、在一个或多个实施方案中，所述核酸内切酶选自甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶、限制性内切酶、切口酶、crispr-cas体系或错配修复酶中的任意一种或多种。

44、在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自glai、fspei、mspji和lpnpi中的任意一种或两种或更多种。

45、本发明第四方面还提供一种核酸扩增或检测方法，包括采用本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头延伸源自rassf1基因的靶标分子、和采用本文任一实施方案所述的捕获寡核苷酸结合经延伸的靶标分子的步骤。

46、在一个或多个实施方案中，所述靶标分子是经甲基化依赖型限制性内切酶、甲基化敏感性限制性内切酶或错配修复酶处理的3’端和5’端序列明确的dna酶切产物。在一个或多个实施方案中，所述甲基化依赖型限制性内切酶包括选自glai、fspei、mspji和lpnpi中的任意一种或两种或更多种。所述dna包括cfdna。

47、在一个或多个实施方案中，所述靶标分子如seq id no:6第3-55位核苷酸所示。

48、在一个或多个实施方案中，所述方法包括：

49、(1)靶标分子与寡核苷酸接头的靶标互补序列互补结合，

50、(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸，在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头互补的序列，获得延伸的靶标分子，

51、(3)延伸的靶标分子与捕获寡核苷酸的结合捕获序列互补结合，

52、(4)捕获寡核苷酸以延伸的靶标分子为模板进行延伸反应，在捕获寡核苷酸3’末端添加与延伸的靶标分子互补的序列，获得延伸的捕获寡核苷酸，

53、(5)延伸的捕获寡核苷酸通过延伸的序列与分子内的折叠序列结合，形成半发夹结构产物；

54、(6)半发夹结构产物进行延伸反应，在3’末端添加与分子内的第一通用序列互补的核苷酸，形成完整的发夹结构产物。

55、在一个或多个实施方案中，所述寡核苷酸接头如本文任一实施方案所述，所述捕获寡核苷酸如本文任一实施方案所述。

56、在一个或多个实施方案中，步骤(1)和(2)是：

57、(1)靶标分子与寡核苷酸接头的靶标互补序列互补结合，

58、(2)靶标分子以寡核苷酸接头为模板延伸，在靶标分子的3’末端添加与寡核苷酸接头的结合序列互补的序列，获得延伸的靶标分子。

59、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括基于特异引物的扩增和/或基于通用引物的扩增。

60、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：

61、(7)使用具有尿嘧啶切割功能的酶(例如user酶)处理完整的发夹结构产物，然后，采用通用引物和/或特异引物进行扩增，得到扩增产物，所述扩增任选还包含使用探针；或者

62、(7)以完整的发夹结构产物作为模板，采用通用引物和/或特异引物进行扩增，得到扩增产物，所述扩增任选还包含使用探针。

63、在一个或多个实施方案中，所述通用引物(i)包含与结合捕获序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3’端序列与结合捕获序列或其部分序列相同，或者(ii)包含与结合捕获序列和第二通用序列的串联序列相同或部分相同的序列；优选地，通用引物3’端序列与(a)或(b)相同：(a)结合捕获序列或第二通用序列或二者的串联序列，(b)(a)的部分序列。优选地，通用引物如seq id no:4所示。

64、在一个或多个实施方案中，所述特异引物包含与第一通用序列相同或部分相同的序列；优选地，其从5’到3’包括以下序列：第一通用序列或其3’端部分序列和折叠序列或其5’端部分序列。优选地，特异引物如seq id no:3所示。

65、在一个或多个实施方案中，探针如seq id no:5所示。

66、在一个或多个实施方案中，所述方法还任选包括：(8)检测探针信号。

67、本发明还提供本文任一实施方案所述的寡核苷酸接头、捕获寡核苷酸、组合物、试剂盒和/或体系在制备dna甲基化检测产品中的应用。

68、在一个或多个实施方案中，所述产品选自试剂盒、装置、计算机可读介质。