一种长双歧杆菌SYSU-02及其应用

一种长双歧杆菌sysu-02及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种长双歧杆菌sysu-02及其应用。


背景技术：

2.肠道作为人体重要的消化器官，不仅起着分解、吸收食物的作用，同时也行使着重要的免疫功能。乳酸杆菌和双歧杆菌是常驻于人体肠道的益生菌。人类胃肠道普遍存在着数以亿计长期定植的微生物，在正常情况下这些微生物与人体形成良好的共生关系，能够帮助人体消化食物、维持免疫屏障；但如果这些微生物群系出现紊乱，则会导致炎症性或感染性疾病的发生。
3.铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是环境中普遍存在的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌，容易感染免疫力低下的人群，是重症监护室感染第二常见的病原菌，也是呼吸机相关性肺炎常见的致病因素。表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)是滋生于生物体表皮上的一种革兰氏阳性球菌，存在于人的皮肤、鼻腔及肠道中，侵袭力不强，但极易发生耐药突变，在一定条件下可引起化脓性感染。
4.溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是一种慢性非特异性肠道炎性病变引起的炎症性肠病(ibd)，病因和发病机制尚不明确，病程漫长，常反复发作。其发病率逐年上升，目前尚缺乏特异性的治疗方法，已成为近些年消化领域的研究热点。
5.双歧杆菌(bifidobacterium longum)是一类使用历史悠久、应用范围广泛的益生菌，普遍存在于人和哺乳动物的肠道内，且常用于发酵食品的生产中。双歧杆菌属主要包括长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌等，双歧杆菌具有多种益生功能，如调节宿主免疫应答、降低炎症反应、调节肠道菌群、预防腹泻等。因此，筛选以及开发新的功能性双歧杆菌菌株具有很大的研究意义和应用价值。
6.双歧杆菌菌株有着丰富的多样性，其中不乏有潜在开发价值的菌株，基于现状，从富含双歧杆菌的基质中分离或者筛选出具有缓解或治疗溃疡性结肠炎，或者具有抑制铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌等人体病原菌功能的双歧杆菌具有非常重要的应用价值和现实意义。


技术实现要素：

7.为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种长双歧杆菌sysu-02。
8.本发明的第二个目的是提供上述长双歧杆菌sysu-02的应用。
9.本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：
10.一种长双歧杆菌sysu-02，所述长双歧杆菌sysu-02于2020年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.20651。
11.本发明从健康的3月龄广州婴儿粪便中筛分出了一种sysu-02菌株，通过16s rdna基因测序和在genbank中的分析比对，发现其16s rdna序列如seq id no.1所示，且该菌株
与bifidobacterium longum strain kctc 3128的同源性为99.57％，确认为同种不同株的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)，经革兰氏染色表明其为革兰氏阳性“y”或“v”字型杆菌，其菌落呈圆形，乳脂色，表面湿润，边缘整齐，最后将其命名为bifidobacteriumlongum sysu-02。该菌株于2020年9月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.20651。
12.经与本地区多个婴儿及青少年分离株进行序列比对，发现菌株sysu-02为中国人体内共有的菌株。该菌株与起源于欧美的菌株相比，从安全性、顺应性和定植能力等方面而言更适合国人。
13.本发明还提供了含有上述长双歧杆菌sysu-02的菌剂。
14.本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：
15.长双歧杆菌sysu-02或其菌剂在制备防治细菌性疾病的药物中的应用，所述细菌包括铜绿假单胞菌和表皮葡萄球菌。
16.经研究发现，菌株sysu-02对表皮葡萄球菌atcc 12228和铜绿假单胞菌atcc 27853具有显著的抑菌效果，可添加到漱口水、鼻喷雾剂或洗手液等抑菌清洁产品中，或制备成鼻腔喷雾剂、口腔和表皮清洁剂等形式，应用于防治表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌引起的疾病。
17.长双歧杆菌sysu-02或其菌剂在制备防治结肠炎的产品中的应用，所述结肠炎为急性溃疡性结肠炎，所述产品包括但不限于食品、保健品和药物。
18.经研究发现，菌株sysu-02对由dss引起的急性溃疡性结肠炎有良好的预防和缓解作用，可应用于溃疡性结肠炎(uc)的防治或治疗中。目前常用的uc治疗药物如抗生素、单克隆抗体存在肝毒性、价格昂贵等缺点，不宜长期使用。而本发明的长双歧杆菌由于其本身的益生菌特性，作为溃疡性结肠炎的预防或辅助治疗药物具有成本较低、顺应性好、无毒副作用等优点。
19.本发明还提供一种双歧杆菌冻干微胶囊，所述微胶囊以长双歧杆菌sysu-02为芯材，以壳聚糖-菊粉-海藻酸钙为壁材制备而成。
20.作为本发明的一个优选实施方式，上述的双歧杆菌冻干微胶囊的制备方法包括以下步骤：
21.s1、双歧杆菌sysu-02经活化后用液体培养基培养至对数生长期，并收集菌液；
22.s2、将步骤s1的菌液接种于发酵罐中进行高密度扩大培养，得到高活菌数的长双歧杆菌发酵液，离心得到菌泥经重悬得到菌悬液；
23.s3、将步骤s2的菌悬液与海藻酸钙的菊粉溶液混匀后加入到cacl2溶液中，经静置固化后获得长双歧杆菌-菊粉-海藻酸钙微胶囊；
24.s4、将步骤s3的微胶囊加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，经包衣、静置分离、预冻及冷冻干燥后得到双歧杆菌冻干微胶囊。
25.本发明使用冻干技术和微囊化技术生产的长双歧杆菌-壳聚糖-菊粉-海藻酸钙冻干微胶囊，能够有效增强双歧杆菌的抗逆性，并可大大提高该菌株在产品中的抗逆性及稳定性，增加其到达人体肠道定植并发挥功效的机会。
26.优选地，步骤s3中，所述菌悬液与海藻酸钙的菊粉溶液的体积比为1:1-3。
27.优选地，步骤s3中，菌悬液-菊粉溶液的混合液与cacl2溶液的体积比为1:10-30。
28.优选地，所述海藻酸钙的菊粉溶液的制备方法为：首先将菊粉溶于水中，溶解后再加入海藻酸钙粉末，最后经溶解和灭菌即得，所述海藻酸钙的质量浓度为1-3％，所述菊粉的质量浓度为10-20％。
29.优选地，所述cacl2溶液的摩尔浓度为0.1-0.3m。
30.优选地，所述壳聚糖盐酸盐溶液中，壳聚糖的质量浓度为8-12％。
31.优选地，双歧杆菌sysu-02的培养条件为37℃厌氧培养，所用培养基为mrs培养基。
32.优选地，步骤s4所述包衣为70-200rpm包衣1-3h。
33.优选地，将菌悬液与海藻酸钙的菊粉溶液的混合液加入到cacl2溶液中时，采用逐滴加入的方式进行。进一步地，所述逐滴加入采用挤压法进行。
34.具体地，所述挤压法所使用的仪器为点胶机，点胶针头型号为23g，调整气流压力约为32psi，滴距约为36cm。
35.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
36.本发明公开了一种长双歧杆菌sysu-02，于2020年9月14日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.20651。抑菌圈实验和mic实验表明，该菌株对致病性表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有抑制作用，可添加于鼻腔、口腔或皮肤清洁产品中。动物实验证明，该菌株能够减轻急性溃疡性结肠炎的严重程度，对肠道有良好的保护作用。同时，本发明还采用微胶囊化技术和冷冻干燥技术构建活菌数不低于1.0
×
109cfu/g的长双歧杆菌-壳聚糖-菊粉-海藻酸钙微胶囊，在维持较高冻干存活率的基础上提高了双歧杆菌制剂的抗逆性和室温储存稳定性，保证了长双歧杆菌在生产、运输、储存过程中的存活率。该长双歧杆菌的冻干微胶囊在涉及预防、治疗肠炎等疾病的功能性食品、保健品或药品中具有极高的应用价值。
附图说明
37.图1为长双歧杆菌sysu-02在mrs平板上的菌落形态；
38.图2为长双歧杆菌sysu-02的菌体形态；
39.图3为长双歧杆菌sysu-02的抑菌圈实验图；
40.图4为各组小鼠大肠长度的对比图；
41.图5为各组小鼠的体重对比图(4％dss造模6d后)；
42.图6为各组小鼠的结肠病理组织切片图。
具体实施方式
43.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
44.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
45.实施例1长双歧杆菌sysu-02的筛分、鉴定
46.收集新鲜的3月龄健康母乳喂养的婴儿粪便(广州婴儿，排便后马上收集样本)溶
于适量的无菌生理盐水中，再用无菌生理盐水将样本稀释105倍，然后取20μl涂布于mrs固体培养基上，37℃、无氧条件下培养2-3d。
47.挑取平板上生长的各单菌落，重新涂布于新的mrs固体培养基上进行扩大培养，然后进行菌种保藏，同时使用细菌基因组dna提取试剂盒(北京天根)提取细菌dna，利用27f/1492r引物对其16s rdna片段进行pcr扩增、测序(上海生工)，将测序结果(seq id no：1)在genebank标准菌株库中进行比对，该菌株与bifidobacterium longum strain kctc3128的同源性为99.57％，确认其为同种不同株的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)。
48.将上述筛分出的长双歧杆菌(bifidobacterium longum)命名为sysu-02，并对其进行革兰氏染色和镜检，结果证明其为革兰氏阳性(g
+
)“y”或“v”字型杆菌，与长双歧杆菌的特征相符。用mrs固体培养基于37℃下绝对厌氧培养48h，发现其菌落呈圆形，乳脂色，表面湿润，边缘整齐(如图1、2所示)。
49.最后，将sysu-02菌株于2020年09月14日送去中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，经鉴定该菌株的保藏名称为bifidobacterium longum sysu-02，分类命名为长双歧杆菌(bifidobacterium longum)，保藏编号为cgmcc no.20651，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏中心于2020年09月14日完成检测，确定保藏的微生物存活。
50.16s rdna序列(1413bp，seq id no：1)
51.acacatgcaagtcgaacgggatccatcaggctttgcttggtggtgagagtggcgaacgggtgagtaatgcgtgaccgacctgccccatacaccggaatagctcctggaaacgggtggtaatgccggatgctccagttgatcgcatggtcttctgggaaagctttcgcggtatgggatggggtcgcgtcctatcagcttgacggcggggtaacggcccaccgtggcttcgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatggaggccttcgggttgtaaacctcttttatcggggagcaagcgagagtgagtttacccgttgaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagggctcgtaggcggttcgtcgcgtccggtgtgaaagtccatcgcttaacggtggatccgcgccgggtacgggcgggcttgagtgcggtaggggagactggaattcccggtgtaacggtggaatgtgtagatatcgggaagaacaccaatggcgaaggcaggtctctgggccgttactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtggatgctggatgtggggcccgttccacgggttccgtgtcggagctaacgcgttaagcatcccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagaaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgttcccgacggtcgtagagatacggcttcccttcggggcgggttcacaggtggtgcatggtcgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgccccgtgttgccagcggattatgccgggaactcacgggggaccgccggggttaactcggaggaaggtggggatgacgtcagatcatcatgccccttacgtccagggcttcacgcatgctacaatggccggtacaacgggatgcgacgcggcgacgcggagcggatccctgaaaaccggtctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaaggcggagtcgctagtaatcgcgaatcagcaacgtcgcggtgaatgcgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtgggcagcacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggatggagccgtctaagtagctccgg。
52.实施例2长双歧杆菌sysu-02的抑菌实验
53.将约105cfu的表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)atcc 12228和铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)atcc 27853涂布至lb固体培养基中，在平板中央放置
02冻干微胶囊的制备方法，以提高其稳定性。
71.具体制备方法包括以下步骤：
72.(1)将深冷于甘油管中的sysu-02单菌株解冻后，划线接种于mrs固体培养基上，37℃厌氧培养2d，然后再挑取平板上的单菌落接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧培养至对数生长期后作为发酵用的菌液。
73.(2)将发酵用的菌液接种于无氧发酵罐中进行高密度扩大培养(按照接种菌液量与mrs液体培养基的体积比1:100进行接种，37℃厌氧条件下静置发酵到od
600
在0.6-0.8之间)，得到高活菌数的长双歧杆菌发酵液，离心收集菌泥，加入适量(能够完全重悬菌体即可)的生理盐水(0.9％nacl(w/v))重新分散菌体后得到菌悬液。
74.(3)将上述菌悬液以1:2的体积比与海藻酸钙的菊粉溶液(2％(w/v))混合均匀，然后通过挤压法逐滴加入到0.1m的cacl2溶液中(菌悬液-菊粉溶液的混合液与cacl2溶液的体积比为1:10-30)，静置固化30min后获得长双歧杆菌-菊粉-海藻酸钙微胶囊。
75.其中，上述海藻酸钙的菊粉溶液的制备方法为：称取15g菊粉溶于100ml蒸馏水中，溶解后加入2g海藻酸钙粉末，搅拌溶解，灭菌备用。
76.所述挤压法所使用的仪器为点胶机，点胶针头型号为23g，调整气流压力约为32psi，滴距约为36cm。
77.(4)将上述微胶囊加入到10％的壳聚糖盐酸盐溶液(溶液完全没过微胶囊即可)中，100rpm包衣1h，静置分离约2h后置于-80℃预冻2h，再于-80℃冷冻干燥36h，得到壁材为壳聚糖-菊粉-海藻酸钙的双歧杆菌冻干微胶囊。
78.洗涤冻干微胶囊后，加入0.05m的柠檬酸钠解囊，测定其活菌数，计数结果为sysu-02的菌株数大于1.0
×
109cfu/g。
79.可将上述步骤所得的sysu-02冻干微胶囊添加或应用于益生菌类食品、保健品或药品中，以提高双歧杆菌的存活率和稳定性。
80.以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。