BTG2基因在肺腺癌抑癌治疗中的应用的制作方法

btg2基因在肺腺癌抑癌治疗中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种用于治疗非小细胞肺癌的生物标志物，具体涉及btg2基因在肺腺癌抑癌治疗中的应用，属于分子生物学和肺癌防治技术领域。


背景技术：

2.肺癌是最常见的癌症类型之一。约85％的肺癌病例属于非小细胞肺癌的诊断范围。肺腺癌是非小细胞肺癌最普遍的一种，其发病率高，预后较差。约85％患者诊断为晚期或转移性疾病，是导致肺腺癌预后不良的重要因素。因此，探究灵敏、特异的早期肺腺癌生物标志物和有效的治疗靶点，是当前研究的迫切需要。
3.b细胞易位基因2(btg2)是抗增殖基因btg/tob家族中的一员，在多种物种高度保守，参与细胞生长调控。btg2在脾脏、胸腺、肺、胃、大肠等多种器官和组织中均有表达，在肺、肠、胰腺、前列腺等正常组织中呈现高表达。研究表明，btg2可抑制细胞生长，促进细胞凋亡或抑制细胞增殖，在肿瘤的发生、发展中可能作为一种抗增殖基因发挥作用。
4.因此，btg2可能作为抑癌基因成为治疗肺腺癌的新的辅助手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的是：克服现有技术中存在的不足，提供btg2基因在肺腺癌抑癌治疗中的应用，通过生物学实验得出btg2基因的过表达导致肺腺癌细胞的细胞周期停滞，表明btg2基因在肺腺癌中可能发挥抑癌基因的作用，因此btg2基因有望作为肺腺癌生物标志物、治疗靶点应用于肺腺癌治疗。
6.为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：btg2基因在肺腺癌抑癌治疗中的应用。
7.btg2基因的mrna表达应用在肺腺癌预后相关性分析中。
8.所述btg2基因的mrna在肺腺癌组织中的表达低于正常肺组织，预后相关性分析中btg2基因在肺腺癌患者中高表达者的总体生存率优于低表达者。
9.btg2蛋白在肺腺癌a549细胞中低表达。
10.btg2基因的过表达应用在肺腺癌细胞周期抑制中，并呈现g1期抑制。
11.btg2基因过表达的a549细胞内多个显著低表达的基因与细胞周期信号通路相关，相关基因为r-has-1640170。
12.所述btg2基因可能通过抑制细胞周期的进展发挥抑癌基因的作用，有望作为肺腺癌生物标志物、治疗靶点应用于肺腺癌治疗。
13.本发明的有益效果是：
14.1)本发明经生物信息学分析得出btg2基因的mrna在肺腺癌组织中的表达低于正常肺组织；预后相关性分析中btg2基因在肺腺癌患者中高表达者的总体生存率优于低表达者，可将btg2基因的mrna表达应用在肺腺癌预后相关性分析中。
15.2)本发明经生物学实验得出btg2蛋白在肺腺癌a549细胞中低表达，btg2基因过表
达的a549细胞内出现细胞周期g1期抑制；且btg2基因过表达的a549细胞内表达下调的基因与细胞周期信号通路相关，以上结果表明btg2在肺腺癌中可能发挥抑癌基因的作用，因此可将btg2基因应用在肺腺癌细胞周期抑制中。
附图说明
16.图1为本发明中采用生物信息学技术分析肺腺癌中btg2基因的表达；
17.图2为本发明中采用生物信息学技术分析luad患者生存率与btg2之间的相关性；
18.图3为本发明中长度为477bp的btg2基因的编码序列；
19.图4为本发明中单克隆挑取法建立的btg2基因高表达细胞株；
20.图5为本发明中btg2基因过表达的a549细胞内显著低表达的基因与细胞周期信号通路的相关性；
21.图6为本发明中btg2基因过表达的a549细胞周期的检测结果。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
23.下列实施例中涉及到的材料和方法如下：
24.1、肺腺癌组织中btg2基因的mrna表达与预后的相关性分析的材料与方法：
25.11)从tcga数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中获得人类肺腺癌样本和正常组织相关的转录组数据；
26.12)利用rstudio软件的deseq2包和edger包，对数据库中的594个肺腺癌病人转录组数据标准化；
27.13)采用limma包对标准化的肺腺癌病人转录组数据进行差异基因表达分析，设置差异显著基因的阈值为：p《0.05且|log2 fold change|≥1.0；
28.14)利用survival包和survminer包，对肺腺癌病人的生存期进行分析，生成kaplan-meier生存曲线，并通过long-rank检验进行预后相关性分析。
29.实验结果：
30.对tcga数据库肝癌数据样本的分析结果表明，如图1所示，btg2基因在肺腺癌组织中的表达显著低于正常肺组织。
31.如图2所示，预后分析发现，btg2基因在肺腺癌患者中高表达者预后明显优于低表达者。
32.2、稳定细胞株的建立，实验材料与方法：
33.21)细胞系及培养：肺腺癌a549细胞生长在含有10％胎牛血清的1640培养基中，在37℃和5％co2的培养箱中培养；
34.22)btg2过表达质粒的构建：将长度为477bp的btg2基因编码通过限制性内切酶ecori和xhoi克隆至pcdna3.1+质粒中，btg2基因的编码序列如图3所示；
35.23)细胞转染：利用脂质体lipofectamine 2000将过表达质粒转染入a549细胞中，用嘌呤霉素筛选稳定表达btg2的细胞株，收获各细胞株后提取蛋白，利用western blot实验检测btg2蛋白的表达情况。
36.实验结果：
37.western blot实验结果显示，btg2蛋白在a549细胞低表达，如图4所示，a549 btg2-1细胞株内btg2表达水平良好，选择此细胞株开展后续的实验，a549 btg2-5细胞株内btg2表达水平低，作为对照组。
38.3、过表达btg2对肺腺癌细胞功能的影响，材料与方法：
39.利用上述构建的稳定表达btg2的a549细胞进行如下实验：
40.31)对过表达btg2的a549细胞及对照组进行转录组测序分析，设置差异显著基因的阈值为：p《0.05且|log2 fold change|≥1.0；
41.32)细胞周期检测：流式细胞术检测btg2过表达对a549细胞周期的影响。
42.实验结果：
43.a549细胞过表达btg2后，胞内差异表达基因go/kegg分析显示，如图5所示，btg2过表达后a549细胞内表达下调的基因与细胞周期信号通路相关，所述btg2基因过表达的a549细胞内显著低表达的基因涉及r-has-1640170。
44.如图6所示，细胞周期检测结果，过表达btg2后，a549细胞周期在g1期出现停滞，该实验进一步证实了btg2过表达会抑制a549细胞周期的过程。
45.上述结果表明，通过生物信息技术分析得出btg2基因在肺腺癌组织、细胞中低表达且与预后不良相关，通过生物学实验得出btg2基因的过表达导致a549细胞周期在g1期出现停滞，且btg2基因过表达的a549细胞内多个显著低表达的基因与细胞周期信号通路相关，涉及基因为r-has-1640170，因此btg2基因可能通过抑制细胞周期的进展发挥抑癌基因的作用，有望作为肺腺癌生物标志物、治疗靶点应用于肺腺癌治疗。
46.因此btg2基因在肺腺癌细胞周期抑制中的应用，能够为后期制作新型肺腺癌诊断的生物标志物、治疗靶点和治疗肺腺癌药物提供理论基础。
47.以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。