一种利用羰基还原酶合成泛酸或泛酸酯类化合物的方法

本发明属于生物制药和生物化工，具体涉及一种泛酸或泛酸酯类化合物的制备方法。

背景技术：

1、泛酸又称维生素b5，是一种水溶性b族维生素。泛酸广泛存在于自然界动植物中，人体肠内有益生菌也可以自行合成。泛酸是辅酶a的组成部分，参与体内蛋白质、脂肪、糖的新陈代谢，是大脑和神经必需的营养物质。泛酸可用于维生素b缺乏症及周围神经炎，以及手术后的肠绞痛，与维生素c合用治疗播散性红斑狼疮。具有制造抗体的功能，在维护头发、皮肤及血液健康方面亦扮演着重要角色。泛酸的主要存在形式为d-泛酸钙，广泛用于食品、医药及饲料添加剂。

2、目前，越来越多的生物技术被设计出来用于泛酸的合成，其中包括了多种合成策略来实现泛酸的合成。一种策略是可以通过生物合成的方法制备泛酸，通过培养微生物利用其代谢过程中可以产生的泛酸或泛解酸的特性生产泛酸。日本武田制药(ep 0590857a2)培养属于肠杆菌科的乃水杨酸和能生产d-泛解酸的微生物，积累d-泛解酸或其盐，然后加入β-丙氨酸制备d-泛酸。此方法微生物产生d-泛解酸时间较长，且最后产物的分离过程复杂，最终得到产品的最高浓度仅为65g/l，不利于工业化生产。

3、另一种策略是，通过合成中间体不对称氰醇，然后将其水解环化制得d-泛内酯，再与β-氨基丙酸反应制得泛酸。franz effenberger等人报道(tetrahedron:asymmetry.1995,6,271-282)将β-取代的新戊醛通过羟腈酶催化得到不对称的氰醇，在经过环化得到d-泛内酯。虽然经过改进，通过重结晶可以获得≥98％的ee值，但是该方法需使用剧毒的氢氰酸，对环境污染严重，不是一个理想的合成策略。另外，beate pscheidt等人(adv.synth.catal.2008,350,1943-1948)报道了有效且ph稳定的羟基腈裂解酶，并通过定点饱和突变进行了改造，虽然提高了选择性但是底物浓度较低。

4、目前报道较多的是微生物酶法拆分。德国巴斯夫公司(wo 0132890 a1)利用来自土壤杆菌属、假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、沙门氏菌属或埃希氏菌属的细菌，通过将外消旋的dl-泛内酯中的l-泛内酯进行水解，从而制备d-泛内酯。其底物浓度仅有6.4g/l(50mm)，且该方法拆分外消旋的dl-泛内酯理论收率仅为50％，虽然可以将剩余的l-泛内酯进行消旋化，但是额外的步骤经济性较差。louise haughton等人(tetrahedron:asymmetry.2000,11,1697-1701)利用脂肪酶对dl-泛内酯进行拆分，虽然能够得到较高ee值的产物，但是酶的用量很大，且仅有70％的转化率，同时考虑到回收不需要的醋酸盐所需的额外工艺操作，该方法不利于工业化生产。

5、另外，jiapao wang等人(tetrahedron:asymmetry.2000,11,1697-1701)通过基因组挖掘方法从genbank数据库中发现了一系列共轭聚酮还原酶(cprs)。在反应中，酮基泛内酯在5小时内以99％的转化率和>99％的ee值还原为d-泛内酯，但是该反应的底物浓度仅6.4g/l(50mm)，无法满足工业化需要。hiroyuki hata等人(agric.biol.chem.1987,51,3011～3016)报道了近平滑念珠菌ifo 0708或红酵母ifo 0920条件下，将酮基泛内酯不对称还原为d-泛内酯。虽然分别以94.4％和80.4％的ee值得到d-泛内酯，但是底物对酶有严重的抑制作用，只能分批将底物加入到反应体系中反应时间长，且底物浓度较低，未达到工业化生产的标准。kaoru nakamura等人(tetrahedron:asymmetry.1993,4,1253-1254)报道了面包酵母对酮基泛内酯的不对称还原，虽然加入了β-环糊精将73％的ee值提高到了93％，但是仅有31％的收率。

6、michihiko kataoka等人(appl.environ.microbiol.1990,56,3595-3597)发现马其顿念珠菌aku 4588以大于98％的ee值将羰基泛酸乙酯转化为d(+)-泛酸乙酯，底物浓度为80g/l。虽然该策略以大于98％的ee值得到泛酸乙酯，但是其底物浓度依旧较低，未达到工业化生产水平，且随着底物浓度增加到大于80g/l时产品的收率明显下降。基于该合成策略，本发明开发了一种新的工程菌能够几乎特异性的将羰基泛酸或酯转化为泛酸或泛酸酯，以高达98％的收率及大于99％的ee值获得泛酸。本发明为泛酸的工业化生产提供了一个有效策略。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种底物普适性广、高底物浓度、高效、高立体选择性、高收率的生物催化合成泛酸或泛酸酯类化合物的方法。

2、本发明提供的泛酸或泛酸酯类化合物的方法，是利用来源于sporobolomycessalmonicolor的羰基还原酶催化不对称还原结构式(ii)所示化合物，生成结构式(i)所示的化合物；具体步骤为：

3、(a)制备含羰基还原酶基因的质粒与含葡萄糖脱氢酶基因gdh的质粒共表达的转化体；

4、(b)制备含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞；

5、(c)将上一步骤所得的含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞与化合物(ii)、溶剂、氢供体和辅因子混合，进行不对称还原反应，得到泛酸或泛酸酯类化合物(i)；其反应式为：

6、

7、式中，r为氢、c1-c8烷基、单取代或多取代芳基。

8、所述羰基还原酶(简称sscr)，其氨基酸序列如seq id no.1所示；或者具有与seqid no.1所示氨基酸序列同源性大于80％的氨基酸序列且保持催化活性的其它羰基还原酶。

9、本发明中，步骤(a)所述制备含羰基还原酶基因的质粒与含葡萄糖脱氢酶基因gdh的质粒共表达的转化体，主要包括以下步骤：通过将含羰基还原酶基因的表达质粒与含葡萄糖脱氢酶基因gdh的质粒共转化至合适的宿主细胞中，制得所述共表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达质粒稳定地自行复制，且其所携带的羰基还原酶基因可被有效表达。本发明优选宿主细胞为大肠杆菌bl21(de3)。工程菌含有表达载体pet28a-sscr。

10、其中所述的质粒转化方法为本领域常规方法，如热激法，电转法等，较佳的为热激法，热激法较佳的实施方式为：将质粒溶液与感受态细胞混合，42℃，热激45秒，然后冰浴2min，随后37℃复苏1h，涂布含卡那霉素及氯霉素的lb琼脂培养基平板，培养得到目标共表达转化体。

11、本发明中，步骤(b)所述制备含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞，包括以下步骤：将制备的含羰基还原酶基因的质粒与含葡萄糖脱氢酶基因gdh的质粒共表达的转化体，接种至含卡那霉素及氯霉素的的lb培养基上，摇床活化后，扩大培养至od600值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集双酶共表达重组大肠杆菌的全细胞。

12、作为优选，所述诱导剂为iptg,诱导剂的浓度为0.05-0.8mm。

13、作为优选，加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为：15-25℃，培养时间为8-24h。

14、本发明中，步骤(c)中，所述氢供体为葡萄糖，所述辅因子为nadp+/nadph；不对称还原反应的反应式进一步表示为：

15、

16、在整个反应过程中，一方面羰基还原酶sscr催化还原化合物(ii)生成立体异构纯的化合物(i)；另一方面，葡萄糖脱氢酶(gdh)将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗了氧化型辅酶因子nadp+，再生了还原型辅酶因子nadph，还原型辅酶因子nadph将提供氢给底物,自身又被氧化成氧化型辅酶因子nadp+,形成了一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。

17、所述不对称氧化还原反应中，所述化合物(ii)的浓度为1.0-300g/l，所述含羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞浓度为0.1g湿重/l-25g湿重/l，所述氢供体的浓度为5-750g/l，所述辅因子的浓度为0-0.5mm。

18、作为优选，所述不对称氧化还原反应的条件为：反应温度为20-40℃，反应体系ph为6.0-8.0。更优选，反应温度为20-30℃，反应体系ph为6.5-7.5，

19、所述不对称氧化还原反应中，溶剂为磷酸盐缓冲液与助溶剂的混合溶剂。所述缓冲液为磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，作为优选，所述缓冲液浓度为30-300mm，优选缓冲浓度为100-250mm。其中，助溶剂选自如下高介电常数溶剂：二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺，选自如下芳香族溶剂：苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯，或者选自如下非极性溶剂：正己烷、环己烷，或者选自如下极性溶剂：乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇。

20、作为优选，所述混合溶剂中磷酸盐缓冲液与助溶剂的体积比为90:10-70:30。

21、在整个反应过程中，待反应至nmr检测底物完全耗尽后，用等体积的二氯甲烷萃取3～4次，合并有机相，用饱和食盐水洗2次，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标产物。

22、与现有发明技术相比，本发明具有以下效果：

23、本发明构建含羰基还原酶sscr与葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞应用于催化还原化合物(ii)，为化合物(i)的生产提供了一种新的生物制备途径。相对于其它制备方法，本发明方法制备所得的含羰基还原酶sscr与葡萄糖脱氢酶gdh的全细胞具有对环境友好、操作简便、易于工业放大等优势，且能以底物普适性广、高底物浓度、高效、高立体选择性、高收率得到化合物(i)(收率高达98％，ee大于99％)。本发明为泛酸的工业化生产提供了一个有效策略。具有很好的工业应用前景。