重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体、制备方法及应用。


背景技术：

2.反转录酶(reverse transcriptase)是以rna为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补dna(cdna)的酶。逆转录酶(m-mlv)从moloney murine leukemiavirus分离出来，这个酶已经作了遗传性上的改变，即除去了与它联在一起的核糖核酸酶h活性(一种专门切割dna与rna杂交链上rna分子的酶)，这个酶应用于cdna的第一链合成和引物的延伸。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mrna为模板时，先合成单链dna(ssdna)，再在反转录酶和dna聚合酶ⅰ作用下，以单链dna为模板合成“发夹”型的双链dna(dsdna)，再由核酸酶s1切成二条单链的双链dna。
3.因此，反转录酶可用来把任何基因的mrna反转录成cdna拷贝，然后可大量扩增插入载体后的cdna。也可用来标记cdna作为放射性的分子探针。目前m-mlv逆转录酶可用于合成第一链cdna、制作cdna探针、rna转录、测序和rna的逆转录反应。该酶是通过点突变使rnaseh活性缺失，具有的dna聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高。
4.但是，目前缺失rnaseh活性的野生型的逆转录酶仍存在一定的缺陷，主要表现为对于大片段的cdna反转录能力差，并且热稳定性较差。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，提供一种新型重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，以期该突变体能够解决现有技术中，逆转录酶m-mlv对大片段的cdna反转录能力，以及热稳定性差的技术问题。
7.本发明的另一个目的在于，提供能够编码上述突变体的生物材料，以及应用所述生物材料制备上述突变体的方法，使得能够批量化生产纯度和活性达到市场要求的上述突变体产品。
8.本发明还有一个目的在于，将上述得到的突变体产品应用于新冠病毒sars-cov-2的反向pcr或者制备用于反向pcr新冠病毒sars-cov-2的产品，从而为新冠病毒sars-cov-2的药物开发、药物筛选以及科学研究提供充足的技术支持。
9.为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体是野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶经过至少一个氨基酸残基的替换获得的，所述野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶具有如seq id no.1所述的氨基酸序列。
11.在可选的实施方式中，所述突变体具有如seq id no.2所述的氨基酸序列。
12.第二方面，本发明提供生物材料，包括以下任一项：
13.(
ⅰ
)编码前述实施方式任一项所述突变体的核酸分子；
14.(
ⅱ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子的重组载体，所述重组载体的原始载体为pet22b；
15.(
ⅲ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子或(
ⅱ
)所述重组载体的转化体，所述转化体宿主选自大肠杆菌。
16.在可选的实施方式中，所述大肠杆菌选自e.coli rosetta或e.coli bl21。
17.第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述突变体的制备方法，所述制备方法包括构建野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，扩增得到线性重组表达载体dna，线性重组表达载体dna经定点突变后，使用同源重组酶进行环化得到突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，将突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体转化进宿主细菌，发酵培养后，破碎菌体，收集突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶。
18.在可选的实施方式中，使用两组引物对进行两个定点突变，其中第一引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；第二引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
19.在可选的实施方式中，所述扩增使用的正向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。
20.在可选的实施方式中，所述重组表达载体的原始载体为pet22b。
21.在可选实施方式中，所述同源重组酶为uvsxase，所述宿主细菌选自e.coli rosetta或e.coli bl21。
22.第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述突变体在sars-cov-2病毒qpcr，或制备sars-cov-2病毒qpcr产品中的应用。
23.在可选实施方式中，所述sars-cov-2病毒qpcr产品包括核苷酸序列如seq id no.9所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的负向引物。
24.本发明提供的重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，通过对野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶进行点突变分子改造，从而实现了该酶热稳定性的提高，而且还提高了本产品的反转录效率和对长片段cdna的反转录能力。此外，本发明还提供了能够表达上述突变体的重组表达载体，该重组表达载体转化进大肠杆菌后，能够高效表达上述突变体。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
26.图1为本发明实施例1提供的突变型m-mlv的突变位点示意图；
27.图2为本发明实施例1中m-mlv点突变pcr实验结果；
28.图3为本发明实施例2和实施例3表达的突变型m-mlv的sds-page结果；
29.图4为本发明实验例1中不同温度条件下逆转录cdna产量。
具体实施方式
30.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
31.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
33.在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供一种重组鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体是野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶经过至少一个氨基酸残基的替换获得的，所述野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶具有如seq id no.1所述的氨基酸序列。
34.应当理解的，本发明所述的野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶包括重组鼠白血病病毒自然表达的逆转录酶，也可以包括现有技术中针对该酶具有的与本发明目的改进不同的其他缺陷进行改进后得到的逆转录酶，例如，现有技术中为了使野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶得rnase酶活性丧失，而进行简单突变后得到的氨基酸序列，由于其未对该酶的热稳定性和长片段反转录能力造成影响，也可以作为本发明的改进材料，因为也应当被认为属于本发明所述的野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的涵盖范围。本发明上述seq id no.1仅应当被理解为示例，因此，采用的开放式撰写方式，应当可以接受。
35.同时，本发明所述的“至少一个氨基酸残基的替换”是指以提高重组鼠白血病病毒逆转录酶热稳定性和长片段反转录能力为目的的氨基酸残基替换，凡是能够实现上述功能的氨基酸点突变，均应在本发明的保护范围内，由于上述突变不可穷举，本发明在下文及以具体实施例的方式给出了其中一种组合，该组合仅为示例，而不应当理解为对上述突变体的限缩。
36.在可选的实施方式中，所述突变体具有如seq id no.2所述的氨基酸序列。
37.应当理解的，对于能够提高重组鼠白血病病毒逆转录酶热稳定性和长片段逆转录能力的点突变数量繁巨，不可穷举，作为其中一个示例，本发明给出了上述seq id no.2所述的氨基酸序列所示g55a和f189l的点突变组合。
38.第二方面，本发明提供生物材料，包括以下任一项：
39.(
ⅰ
)编码前述实施方式任一项所述突变体的核酸分子；
40.(
ⅱ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子的重组载体，所述重组载体的原始载体为pet22b；
41.(
ⅲ
)含有(
ⅰ
)所述核酸分子或(
ⅱ
)所述重组载体的转化体，所述转化体宿主选自大肠杆菌。
42.在可选的实施方式中，所述大肠杆菌选自e.coli rosetta或e.coli bl21。
43.可以理解的，由于碱基密码子氨基酸残基之间的对应关系，上述核酸分子的序列不限于一种，凡是能够编码上述突变体的核酸分子均应理解为上述核酸分子的保护范围。
44.为了获得上述突变体，本发明通过同源模型分析建获得的野生型重组m-mlv三维
结构，而后通过点突变技术对重组之后的野生型m-mlv的进行定点突变。然后，选择合适的载体构建获得重组载体突变体，最后再将正确突变的重组表达载体转化入大肠杆菌进行蛋白表达。
45.结合上述突变体的获取方法，第三方面，本发明提供前述实施方式任一项所述突变体的制备方法，所述制备方法包括构建野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，扩增得到线性重组表达载体dna，线性重组表达载体dna经定点突变后，使用同源重组酶进行环化得到突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体，将突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的重组表达载体转化进宿主细菌，发酵培养后，破碎菌体，收集突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶。
46.在可选的实施方式中，使用两组引物对进行两个定点突变，其中第一引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；第二引物对的正向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示。
47.在可选的实施方式中，所述扩增使用的正向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示。
48.在可选的实施方式中，所述重组表达载体的原始载体为pet22b。
49.在可选实施方式中，所述同源重组酶为uvsxase，所述宿主细菌选自e.coli rosetta或e.coli bl21。
50.第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述突变体在sars-cov-2病毒qpcr，或制备sars-cov-2病毒qpcr产品中的应用。
51.在可选实施方式中，所述sars-cov-2病毒qpcr产品包括核苷酸序列如seq id no.9所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.10所示的负向引物。
52.下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
53.实施例1
54.本实施例模拟了野生型重组m-mlv的三维结构，其氨基酸序列如seqid no.1所示，确定了两个突变点为g55a和f189l。并将突变后的重组m-mlv突变体和载体pet22b形成的重组表达载体转化进大肠杆菌，而后筛选获得阳性大肠杆菌用于重组m-mlv突变体的表达，具体步骤如下：
55.(1)将野生型重组m-mlv的氨基酸序列通过swiss-model软件进行建模，获取其三维结构，并确定g55a和f189l两个突变靶位点，点突变位点如图1所示。
56.(2)通过利用南京巨匠生物科技有限公司的定点突变试剂盒(cloneufo fast mutagenesis kit)对重组m-mlv核酸序列克隆，根据其使用说明书，对野生型重组m-mlv的重组表达载体pet-22b(+)/m-mlv的dna进行扩增，获得线性形式的重组表达载体dna，再利用同源重组酶uvsxase(南京巨匠生物科技有限公司)进行环化获得完整的突变型逆转录酶重组表达载体。采用如下定点突变引物对制作样本(1)将55位的gly突变成ala(seq id no.3和seq id no.4)，以及样本(2)将55位的gly突变成ala(seq id no.3和seq id no.4)，同时将189位的phe突变为leu(seq id no.5和seq id no.6)。pcr克隆条件为：94℃5min，95℃15s，58℃15s，72℃2min，72℃10min，10℃∞。pcr产物的凝胶电泳结果图2所示，由图2看
出，样本(1)中单独g55a点突变，以及样本(2)中g55a和f189l同时点突变前后，pcr产物凝胶电泳得到的条带大小相等，证明了pcr获得突变体线性载体大小正确。
57.表1实施例1中点突变所用引物对
[0058][0059]
实施例2
[0060]
本实施例将实施例1得到的突变型逆转录酶重组表达载体转化进大肠杆菌e.coli rosetta，得到转化菌株mut-1/e.coli rosetta，接种于20ml含100mg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养12h获得种子液。取100μl种子液接种于100ml含100mg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养至发酵液菌体浓度达到od600＝0.6时，加iptg至100mg/ml，16℃、180rpm进行低温诱导表达16h。
[0061]
而后将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液(50mmol/l pbs+0.3mol/l nacl+0.5％triton x-100)重悬菌体，细胞均质匀浆机破碎(700bar 5min)，4℃、9000rpm离心10min，收集上清液作为粗酶液。将处理得到的粗酶液按照ni-nta his tag kit说明书依次用含不同浓度咪唑(50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、200mmol/l)的洗脱液洗脱ni-nta柱，收集洗脱峰，得到突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶。
[0062]
实施例3
[0063]
本实施例也提供了一种突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶的制备方法，与实施例2的区别仅在于，将大肠杆菌e.coli rosetta替换为大肠杆菌e.coli bl21。
[0064]
本发明提供的经过大肠杆菌e.coli rosetta或大肠杆菌e.coli bl21表达的突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶，结果如图3所示，e.coli rosetta表达量高于e.coli bl21。
[0065]
实验例1
[0066]
本实验例考察温度对实施例2得到的突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶和野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶逆转录新冠病毒sars-cov-2rna获得cdna效果的影响。
[0067]
(1)rna的提取方法：采用南京巨匠生物科技有限公司的atgpure
tm
virus rna extraction kit(column)(rv301)试剂盒方法对市购新冠假病毒样本提取rna。
[0068]
(2)对所获得的rna进行纯度浓度检测合格之后，使用实施例2得到的突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶和野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶按下列条件进行逆转录反应获得cdna：
[0069]
在rnase-free离心管中配制如下混合液：
[0070]
[0071][0072]
*本实验中需要加入rnase抑制剂，可选用南京巨匠生物科技有限公司atg
tm
rnasin(atg#rc102)。
[0073]
程序如下：
[0074][0075]
而后，取10μl所获得的cdna样品，与使用野生型m-mlv(氨基酸序列如seq id no.1所示)得到的cdna样本共同跑1％琼脂糖核酸电泳。逆转录获得的cdna产量如图4所示，由图中可以看出，在不同反应温度下，突变体的cdna合成产量均要高于野生型，并且在65℃条件下都能有效扩增。
[0076]
实验例2
[0077]
本实验例考察实施例2得到的突变型重组鼠白血病病毒逆转录酶和野生型重组鼠白血病病毒逆转录酶的逆转录后获得cdna用于荧光定量qpcr反应的效果，以市购新冠假病毒n基因为检测对象，按照如下步骤进行检测：
[0078]
用不同温度下反转录获得的cdna模板，以新冠病毒n基因引物n-f和n-r按照南京巨匠生物科技有限公司atgstart
tm
plus qpcr sybr green master mix(q111)方法进行qpcr实验。
[0079]
新冠n基因引物：
[0080]
n-f：cagtaggggaacttctcctgctagaatggctgg(seq id no.7)；
[0081]
n-r：cctttaccagacattttgctctcaagctgg(seq id no.8)；
[0082]
反应buffer配置如下：
[0083][0084]
qpcr实验程序如下：
[0085][0086]
qpcr扩增结果如下：
[0087][0088]
由qpcr结果可以看出，突变体相较野生型在同一温度下，ct值更低，检测灵敏度更高，并且在65℃高温下仍然能够检测出模板，说明突变体逆转录酶具有更好的耐热性。
[0089]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。