一种用于实时检测超高速taq dna聚合酶酶活的组合物及方法
技术领域
1.本发明涉及dna聚合酶技术领域，具体为taq dna聚合酶的酶活检测方法。
背景技术：2.taq dna聚合酶是重组表达的一种耐热稳定聚合酶，来源于重组大肠杆菌，含有从thermus aquaticus细菌克隆的全长taq dna聚合酶基因在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化得到，分子质量为90kda，温度为55℃-110℃时催化dna的复制，74℃-75℃为最适温度，具有5
’‑3’
聚合酶活性和5
’‑3’
核酸外切酶活性。
3.taq dna聚合酶是从水生栖热菌thermus aquaticus(taq)中分离出的具有热稳定性的dna聚合酶。由于其自身的热稳定性，广泛应用于pcr反应中。
4.活性定义：1活性单位(u)指在72℃30min内，将10nmol脱氧核苷酸掺入酸不溶性物质所需的酶量。研发一种超高速taq dna聚合酶的酶活检测的新方法，用以推动该类工具酶的产业化，对于taq dna聚合酶的生产和实际使用具有重要的意义。
5.酶活性测定常用的方法有终点法和动力学方法两类。终点法是测定完成一定量反应所需要时间，动力学方法是测定一定时间内所起的化学反应量。
6.一、生物发光技术检测taq dna聚合酶活性的测定方法：
7.(1)原理：在dna聚合酶催化dna分子的聚合过程中伴随着焦磷酸(ppi)的生成，利用atp硫酰化酶将焦磷酸定量转化成atp，再利用虫荧光素酶系统发光检测atp的量，从而确定ppi的量，以pcr反应体系中ppi的量来反映taq酶的活性。
8.(2)方法：atp发光检测试剂盒的预处理:在商品化的atp发光检测试剂盒中,为了增强发光的稳定性，加入了微量的焦磷酸，因此不能直接使用atp发光试剂盒来检测焦磷酸。为了消除试剂中原有的焦磷酸，首先用低浓度的焦磷酸酶处理atp发光检测试剂盒，每1000μl混合发光液中加入0.04u焦磷酸酶,混匀,室温下放置45-60min。
9.焦磷酸的测定：在室温(25℃)条件下,取10μl含焦磷酸的样品于发光管中,分别加入80μl ph 7.75的tris缓冲液、10μl浓度为50μmol/l的aps及0.2u atp硫酰化酶, 混匀,使样品中的焦磷酸转化为atp。向发光管中加入100μl发光工作液,混匀,放入发光检测仪中,记录6s积分发光强度。分别取不同量的焦磷酸标准液,测定6s积分发光强度,绘制焦磷酸标准曲线。
10.聚合酶活性的表示方法：
11.选择任一pcr扩增反应进行30个循环，分别加入1u的不同种类(或者不同保存时间、不同批次)的taq酶，反应完成后按(2)的方法检测pcr产物中焦磷酸的含量，根据焦磷酸的含量比较聚合酶的活性。
12.(3)计算方法：
13.酶活性比＝焦磷酸量(使用不同保存时间的(taq dna聚合酶)/焦磷量(使用已知活性的标准taq dna聚合酶)
×
100％
14.结论：
15.不同保存时间taq酶的活性
[0016][0017]
该方法操作比较简便、灵敏度较高。测定taq酶的活性获得较好的结果，但是该方法并不能得到酶活的最终数据。
[0018]
二、荧光定量pcr检测taq酶活性
[0019]
原理：随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。在荧光信号指数扩增阶段，pcr产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在这个阶段可以进行定量分析。
[0020]
方法：用不同浓度质粒标准品建立实时荧光定量pcr标准曲线并检测该方法的灵敏性和重复性。在相同体系将taq酶热启动后在不同的温度下进行定时测试其反应扩增量及其灵敏度。
[0021]
结论：实时荧光定量pcr具有较好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性，但是taq 酶活性的变化不仅影响荧光定量pcr系统的检测极限，而且影响荧光定量pcr系统测量的准确性。pcr的特异性也会随taq酶活性的变化而降低。
[0022]
taq dna聚合酶国家标准，标准号gb/t 35542-2017
[0023]
现有技术方案的缺陷：
[0024]
不能精准的测量聚合酶活性的准确数值，无法准确的评价批次间的taq dna聚合酶的批间差，无法做到原材料的严格的质检控制，无法准确衡量ivd试剂盒的原材料的优劣。
[0025]
现有的技术方案耗时较长，无法快速的知道taq dna聚合酶的活力浓度。
[0026]
目前行业内还没用统一的酶活测定方法，导致各个生产企业只能依据公司内部企业标准来定义酶活，导致下游ivd原料筛选时，对于不同公司的酶活之间没有可比性。
[0027]
基于目前的现状，酶活测定方法研发就迫在眉睫。
技术实现要素：[0028]
基于上述情况，我们公开了一种实时检测超高速taq dna聚合酶的酶活检测的方法，解决上述技术问题。
[0029]
本发明旨在通过生物信息学和基于定向进化理论对酶活中心进行分析，根据酶活
检测定义，建立绝对定量测活和相对定量测活2种理想测活的模型，精确定量分子酶和工具酶的酶活，实验方法偏差＜10％；
[0030]
解决的主要问题：基于双链dna结合染料能特异嵌入双链dna发出荧光的原理，开发了一种实时监测dna聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化实验时检测聚合酶的活性，该方法不需要对dna进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速的聚合酶活性实时监测新方法，为研究抗体肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。
[0031]
本文旨在基于引物延伸反应和双链dna结合染料实现了聚合酶活性的实时研究，操作简便、快捷、成本低，用此方法我们可以实时监测dna聚合酶的活性，即采用等温延伸的方法，而非pcr扩增的方式，可以精确测得聚合酶的活力浓度，是一种高通量96孔的检测方法，通过等温延伸实验，检测聚合酶活力浓度，用标准对照酶的信号增加值和酶量作标准曲线，计算待测酶的活力浓度，可以代替聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳测酶活。
[0032]
本发明运用高精度和高灵敏度的酶活检测仪器：例如lightcylcer roche 480荧光定量pcr仪、abi 7500荧光定量pcr仪、biotek多细胞微孔板检测系统(cytation 1酶标仪) 对建立的理想模型的相关参数和反应条件进行充分优化和验证，要求建立酶活测试的标准曲线，要求r2＞0.98，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％。
[0033]
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0034]
一种用于实时检测超高速taq dna聚合酶酶活的组合物，包括1份10倍的等温延伸测活缓冲液、终浓度为5mm的mgcl2、去rna酶水、终浓度为0.4um引物m13r、 1.6份sybr green i、终浓度为0.2nm的dntps、终浓度为10ng/ul m13ssdna；
[0035]
所述10倍的等温延伸测活缓冲液包括：去rna酶水、终浓度为200mm的tris8.0、终浓度为100mm的kcl、终浓度为10mm的dtt、终浓度为1mm的edta、0.5％的ca630、 0.5％的tween 20、终浓度为1mg/ml的bsa；
[0036]
所述m13ssdna的序列如seq id no.1所示；
[0037]
所述引物m13r的序列如seq id no.2所示。
[0038]
一种用于实时检测超高速taq dna聚合酶酶活的检测方法，包括以下步骤：
[0039]
在同一反应过程中，将对照酶或待测酶与所述实时检测超高速taq dna聚合酶酶活的组合物混合，获得以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值δrn；
[0040]
以对照酶不同浓度梯度为横坐标，对照酶的δrn为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线y＝kx+b；
[0041]
待测酶的酶活x＝[(待测酶的δrn-b)
÷
k]*n；
[0042]
式中，待测酶的δrn为在同一反应过程中，待测酶与所述超高速taq dna聚合酶酶活的组合物混合，获得以反应速率稳定后的某一时间的信号值与起始信号值的差值δrn， k为以对照酶不同浓度梯度为横坐标，对照酶的δrn为纵坐标建立标准曲线，获得标准曲线的斜率，n为待测酶的稀释倍数。
[0043]
当建立标准曲线的对照酶的酶活单位为mu，计算得到的待测酶的酶活单位也为mu，如最终获得的待测酶的酶活以u为单位计算，则对应的公式变为：
[0044]
待测酶的酶活x(单位为u)＝[(待测酶的δrn-b)
÷
k]
÷
c*n；
[0045]
式中c＝1000为u和mu的换算系数，1u＝1000mu。
[0046]
优选的，所述反应速率稳定后的某一时间为31分钟或者11分钟。
[0047]
优选的，所述反应条件为：72℃，30秒，62循环。
[0048]
优选的，所述对照酶或待测酶与所述实时检测超高速taq dna聚合酶酶活的组合物混合体积比为1:4。
[0049]
本发明的一种实时检测超高速taq dna聚合酶的酶活检测的方法，不管是激活活力的taq dna聚合酶，还是未激活活力的taq dna聚合酶的酶活检测都适用。
[0050]
本发明的技术原理如下：
[0051]
基于双链dna结合染料能特异嵌入双链dna发出荧光的原理，开发了一种实时监测dna聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响，该方法不需要对dna进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速的聚合酶活性实时监测新方法，为研究抗体肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。
[0052]
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：
[0053]
1、与传统的分析聚合酶活性的方法相比，该方法不需要放射性同位素标记和变性聚丙烯胺凝胶电泳，操作简单方便；
[0054]
2、与现有的荧光分析方法相比较，该方法不需要对反应底物进行直接荧光标记及生物化学修饰，检测成本低；
[0055]
3、此方法可实时分析聚合酶的活性，与终点分析法相比，更加真实地反映了聚合反应动态过程信息；
[0056]
4、此方法操作简单、检测时间快捷，最快可10分钟之内测定酶活结果；
[0057]
5、此方法可方便快捷地研究药物对聚合酶的影响作用，为以聚合酶为靶标的新药的开发和筛选提供一种新的手段和方法。
[0058]
6、以taq酶为标样，采用等温延伸的方法；建立酶活测试的标准曲线，可以实现r2 ＞0.98，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％；
[0059]
7、适用性广，不管是激活活力的taq dna聚合酶，还是未激活活力的taq dna聚合酶的酶活检测都适用；
[0060]
8、检测时间短：10-30min；
[0061]
9、可以采用单条引物延伸，延伸温度为72℃。
附图说明
[0062]
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0063]
图1是实例一neb对照酶taq的不同酶活和荧光值的对应曲线图；
[0064]
图2是实例二荧光定量pcr仪测定数据第一次图谱：对照酶图；
[0065]
图3是实例二荧光定量pcr仪测定数据第二次图谱：对照酶图；
[0066]
图4是实例二荧光定量pcr仪测定数据第一次图谱：待测hs-taq图一；
[0067]
图5是实例二荧光定量pcr仪测定数据第一次图谱：待测hs-taq图二；
[0068]
图6是实例二荧光定量pcr仪测定数据第一次图谱：待测hs-taq图三；
[0069]
图7是实例二荧光定量pcr仪测定数据第二次图谱：待测hs-taq图一；
[0070]
图8是实例二荧光定量pcr仪测定数据第二次图谱：待测hs-taq图二；
[0071]
图9是实例二荧光定量pcr仪测定数据第二次图谱：待测hs-taq图三；
[0072]
图10是实例二第一次线性拟合曲线图；
[0073]
图11是实例二第二次线性拟合曲线图；
[0074]
图12是实例三荧光定量pcr仪测定数据对照酶图；
[0075]
图13是实例三荧光定量pcr仪测定数据待测酶图；
[0076]
图14是实例三标准曲线线形图一；
[0077]
图15是实例三荧光定量pcr仪测定数据对照酶图一；
[0078]
图16是实例三荧光定量pcr仪测定数据待测酶图；
[0079]
图17是实例三标准曲线线形图二；
[0080]
图18是实例三荧光定量pcr仪测定数据对照酶图二；
[0081]
图19是实例三荧光定量pcr仪测定数据待测酶图二；
[0082]
图20是实例三标准曲线线形图三；
[0083]
图21是实例四荧光定量pcr仪测定数据第一组图谱：对照酶图；
[0084]
图22是实例四荧光定量pcr仪测定数据第一组图谱：待测酶a-fast taq图一；
[0085]
图23是实例四荧光定量pcr仪测定数据第一组图谱：待测酶a-fast taq图二；
[0086]
图24是实例四第一次线性拟合曲线图一；
[0087]
图25是实例四第一次待测酶a-fast taq酶活对照酶图；
[0088]
图26是实例四第一次待测酶a-fast taq酶活待测酶图一；
[0089]
图27是实例四第一次待测酶a-fast taq酶活待测酶图二；
[0090]
图28是实例四第一次线性拟合曲线图二。
具体实施方式
[0091]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0092]
现有的taq dna聚合酶活性的常规检测方法：
[0093]
1、生物发光技术
[0094]
(1)原理：在dna聚合酶催化dna分子的聚合过程中伴随着焦磷酸(ppi)的生成，利用atp硫酰化酶将焦磷酸定量转化成atp，再利用虫荧光素酶系统发光检测atp的量，从而确定ppi的量，以pcr反应体系中ppi的量来反映taq酶的活性。
[0095]
(2)方法：atp发光检测试剂盒的预处理:在商品化的atp发光检测试剂盒中,为了增强发光的稳定性，加入了微量的焦磷酸，因此不能直接使用atp发光试剂盒来检测焦磷酸。为了消除试剂中原有的焦磷酸，首先用低浓度的焦磷酸酶处理atp发光检测试剂盒，每1000μl混合发光液中加入0.04u焦磷酸酶,混匀,室温下放置45-60min。
[0096]
焦磷酸的测定：在室温(25℃)条件下,取10μl含焦磷酸的样品于发光管中,分别加
入80μl ph 7.75的tris缓冲液、10μl浓度为50μmol/l的aps及0.2u atp硫酰化酶, 混匀,使样品中的焦磷酸转化为atp。向发光管中加入100μl发光工作液,混匀,放入发光检测仪中,记录6s积分发光强度。分别取不同量的焦磷酸标准液,测定6s积分发光强度,绘制焦磷酸标准曲线。
[0097]
聚合酶活性的表示方法：
[0098]
选择任一pcr扩增反应进行30个循环，分别加入1u的不同种类(或者不同保存时间、不同批次)的taq酶，反应完成后按(2)的方法检测pcr产物中焦磷酸的含量，根据焦磷酸的含量比较聚合酶的活性。
[0099]
(3)计算方法：
[0100]
酶活性比＝焦磷酸量(使用不同保存时间的(taq dna聚合酶)/焦磷量(使用已知活性的标准taq dna聚合酶)
×
100％
[0101]
(4)结论：不同保存时间taq酶的活性
[0102][0103]
该方法操作比较简便、灵敏度较高。测定taq酶的活性获得较好的结果，但是该方法并不能得到酶活的最终数据。
[0104]
2、荧光定量pcr检测taq酶活性
[0105]
(1)原理：随着pcr反应的进行，pcr反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。在荧光信号指数扩增阶段，pcr产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在这个阶段可以进行定量分析。
[0106]
(2)方法：用不同浓度质粒标准品建立实时荧光定量pcr标准曲线并检测该方法的灵敏性和重复性。在相同体系将taq酶热启动后在不同的温度下进行定时测试其反应扩增量及其灵敏度。
[0107]
(3)结论：实时荧光定量pcr具有较好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性，但是taq酶活性的变化不仅影响荧光定量pcr系统的检测极限，而且影响荧光定量pcr系统测量的准确性。pcr的特异性也会随taq酶活性的变化而降低。
[0108]
3、taq dna聚合酶国家标准，标准号gb/t 35542-2017
[0109]
(1)仪器设备：全自动医用pcr分析系统；
[0110]
(2)试剂：
[0111]
发夹型寡核苷酸序列(t2)，序列为：
[0112]5’‑
tagcgaaggatgtgaacctaatccctgctcccgcggccgatctgccggccgcgggagca-3’[0113]
dntp包括dctp、datp、dttp、dgtp
[0114]
picogreen染料
[0115]
lambda dna标准品。
[0116]
(3)试剂溶液配制
[0117]1×
te溶液：10mm tris-hcl，1mm edta
·
2na，ph8.5(25℃)。
[0118]
pcr buffer：250mm tris-hcl，50mm(nh4)2so4，500mm kcl，1％(体积分数) triton x-100，ph8.5(25℃)。
[0119]
lambda dna预染液：以8.5ul：1.0ul：0.5ul的比例分别量取纯化水、10
×
pcr buffer 和picogreen染料加入ep管，在漩涡混匀器上振荡混匀1min后在微型离心机上离心数秒，储存于2℃-8℃。
[0120]
mgcl2溶液：25mm mgcl2
·
6h2o。
[0121]
酶稀释缓冲液：10mm tris-hcl，0.1mm edta
·
2na，1mm dtt，50％(体积分数) 甘油，ph8.5(25℃)。
[0122]
t2溶液：将发夹型寡核苷酸序列(t2)干粉按照合成单上的说明稀释到100um，储存于-20℃，使用是从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上振荡混匀10s，在微型离型机上离心数秒。
[0123]
dntp混合液：将dntp中的dctp、datp、dttp、dgtp等体积进行混合，于漩涡混匀器上振荡混匀10s，在微型离型机上离心数秒，配成25mm each dntp混合液。
[0124]
lambda dna标准品溶液：使用1
×
te溶液将lambda dna标准品进行4倍连续梯度稀释，得到100ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.25ug/ml、3.125ug/ml、1.5625ug/ml 和0.78125ug/ml 8个浓度梯度溶液，以相同体积的1
×
te溶液作为背景对照。各梯度溶液和背景对照分别加入等体积的预染液，于漩涡混匀器上振荡混匀10s，在微型离型机上离心数秒，以20ul/管分装于pcr八连管内，每个梯度3个重复，盖紧管盖，在微型离型机上离心数秒后备用。
[0125]
taq dna聚合酶稀释溶液：根据标定酶比活力，使用酶稀释缓冲液对taq dna聚合酶进行适当稀释(如标定浓度为5000u/ml，即5u/ul，则可2倍稀释，得到2
×
、4
×
、 8
×
、16
×
的梯度稀释液)，该步骤应在冰上进行。
[0126]
(4)实验步骤
[0127]
聚合反应液的配制与分装
[0128]
在ep管中按照表1的比例配制聚合反应液(冰上配制)，聚合反应液配制完成后，于漩涡混匀器上振荡混匀10s，在微型离型机上离心数秒。
[0129]
总体积＝[3
×
(n+1)+1]
×
v1
[0130]
式中：
[0131]
3——重复次数；
[0132]
n——taq dna聚合酶稀释梯度；
[0133]
1——前1个“1”表示空白对照数，后一个“1”表示预留损失数量；
[0134]
v1——1个反应用量。
[0135]
聚合反应液组分规格1个反应用量/ul纯化水/15.2pcr buffer10
×
2.0mgcl2溶液25mm2.0t2溶液100um0.1
dntp混合液25mm each0.2picogreen/0.5
[0136]
聚合反应液配比：
[0137]
在聚合反应液平均分到n个(n为taq dna聚合酶稀释梯度)ep管中，分别计入1.3ul 的各浓度梯度的taq dna聚合酶稀释梯度和空白对照(酶稀释缓冲液)，在漩涡混匀器上振荡混匀10s，在微型离型机上离心数秒。各管混合液以20ul/管。分装于pcr八连管内，每管混合液3个重复，盖紧管盖，在微型离型机上离心数秒后备用。
[0138]
(5)运行程序
[0139]
在全自动医用pcr分析系统上设置如下温度程序：
[0140]
74℃16s
[0141]
荧光采集通道：sybr
[0142]
120cycles
[0143]
将装有lambda dna标准品和聚合反应液的pcr八连管于全自动医用pcr分析系统中，启动温度程序，开始聚合反应。
[0144]
本发明的具体实施过程如下：
[0145]
仪器：lc480 pcr仪或者7500pcr仪、移液器、离心机、混匀震荡器。
[0146]
试剂：neb对照酶taq(约5u/μl)、待测酶溶液、1
×
等温延伸测活buffer、10
×
等温延伸测活buffer、mgcl2(250mm)、灭菌水、引物m13r(100um)、sybr green i (100
×
)、dntps(25mm each)、m13ssdna。
[0147]
neb对照酶taq(货号#m0323l)，待测酶为译酶(苏州译酶生物科技有限公司)的 taq商品化酶。
[0148]
10
×
等温延伸测活buffer组成见下表：
[0149][0150][0151]
将10
×
等温延伸测活buffer分均分0.5ml/管，置于-20℃长期保存，有效期1个月，每次使用1管。
[0152]
操作步骤：用作曲线的标准对照酶作8个梯度(酶量为 0/0.008/0.012/0.016/0.020/0.024/0.032/0.040u)，待测酶作4个梯度(酶量为 0.008/0.016/0.024u/0.040u)，每个反应体系体积为25μl(mix 20μl+酶/1
×
等温延伸测活buffer 5μl)，每个样品做3管重复。
[0153]
1、稀释酶溶液
[0154]
1.1稀释对照酶，见下表：
[0155][0156]
1.2稀释待测酶
[0157]
将待测酶用1
×
等温延伸测活buffer稀释到1.00u/μl，酶的取液体积≥5μl。再稀释到0.0016、0.0032、0.0048、0.0080u/μl，稀释操作同对照酶的稀释(见表1)。
[0158]
2、配制等温延伸反应mix(20μl/份)
[0159]
组成见下表，对照酶(需24份)和1批待测酶(需12份)共配制40管，震荡离心。
[0160]
等温延伸反应mix置于-20℃保存时，可长期保存；4℃保存时，应在12小时内使用。
[0161][0162][0163]
3、加样
[0164]
(1)使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。使用透明色96孔pcr板(r7500型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0165]
(2)先将5μl的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/μl)分装到对应的反应孔中，做三管重复，向每个反应孔中加入20μl的mix。其中酶终浓度为0时，加入5μl 的1
×
等温延伸测活buffer。
[0166]
(3)因为酶加到体系中反应就会开始，应控制加样完成到上机反应的时间，时间应小于5min；操作人员手部避免触碰反应管底部。
[0167]
4、封膜，震荡10s，2000rpm离心1min。
[0168]
5、等温延伸反应
[0169]
使用仪器lc480荧光定量pcr仪，参考《roche lc480 pcr仪作业指导书》，
[0170]
酶活检测：设定反应条件(72℃，30s)，62循环，反应体系设为25μl，荧光选择 sybr green i，每个循环收集一次信号，编辑反应孔的名称，保存文件并命名，开始反应。
mix，每个酶溶液的浓度梯度做3重复。
[0192]
(2)向每管分装等温延伸反应mix 20μl，然后向每管中加入对应的5μl稀释的酶。
[0193]
(3)封膜及等温延伸反应参照前述本发明的具体实施过程。
[0194]
6、数据处理
[0195]
(1)输出反应的信号值
[0196]
(2)选取第31min或者11min的rn值，减去起始信号值r1，得到δrn，计算δrn 平均值和标准偏差。
[0197]
(3)以对照酶每个浓度梯度的δrn平均值为x，对应的酶量mu为y，做单项式曲线，得到公式y＝kx+b，r2﹥0.98。
[0198]
(4)将待测酶的δrn平均值作为x带入公式中，计算得y即对应的酶量mu，再除以1000将酶量单位换算成u，然后除以理论酶量(u)，得到1u/μl待测酶的实际浓度 (u/μl)，计算其平均值。
[0199]
(5)将6.4得到的浓度平均值
×
稀释到1u/μl的稀释倍数，得到待测酶母液相对于 taq的浓度(u/μl)。
[0200]
实施例1：等温延伸测taq dna聚合酶酶活方法建立及酶活测定
[0201]
1、neb对照酶taq(5u/μl)
[0202][0203]
2、稀释待测酶：taq(20210104#1p1c1d1)0.5mg/ml,预估活力40u/μl
[0204][0205]
3、稀释待测酶：fast taq(20210119#1p2c1d1)0.5mg/ml,预估活力40u/μl
[0206]
[0207]
4、配制等温延伸反应mix(20μl/份)
[0208][0209][0210]
5、实验数据：标准曲线的建立：详见于图1。
[0211][0212]
6、实验待测酶酶活汇总数据如下：
[0213]
测量次数taq(20210104#1p1c1d1)fast taq(20210119#1p1c1d1)148.3541.18243.1842.84339.6236.52441.8735.20541.1742.31平均值(u/μl)42.8439.61std3.343.51rsd7.79％8.85％
[0214]
实施例2：等温延伸测化学修饰hs taq激活酶活
[0215]
1、为减小取样误差，稀释酶时，取样体积≥5μl。
[0216]
2、配制激活反应体系(25μl)。
[0217]
3、以taq(5.0u/μl)作对照，对照酶和待测样品均做2管重复。将反应液混匀离心。
[0218]
4、酶的活力为5.0u/μl时，酶和1
×
taq storage buffer总体积为3μl，相当于稀释倍数为5倍(＝1*5)，激活体系里面终浓度为0.4u/μl；
[0219]
5、酶的活力为2.5u/μl时，酶和1
×
taq storage buffer总体积为5μl，相当于稀释倍数为2.5倍(＝0.5*5)，激活体系里面终浓度为0.4u/μl。
[0220]
6、酶的活力为其他数值，需调整稀释倍数(相当于稀释1u/μl的总倍数)，至激活体系里面终浓度为0.4u/μl。
[0221]
7、本次测量按照下列酶活测定：
[0222][0223][0224]
对照酶：激活体系mix组成：
[0225]
试剂浓度加入量μl终浓度tm buffer5
×
51
×1×
taq storage buffer1
×
1/对照酶5u/μl2*0.4u/μlnf水*/17*/
[0226]
待测酶：激活体系mix组成：
[0227]
试剂浓度加入量μl终浓度nf水*/9*/tm buffer5
×
51
×1×
taq storage buffer1
×
1/待测酶*1u/μl10*0.4u/μl
[0228]
将反应管置于9700型pcr仪中，进行激活处理。
[0229]
激活程序为(95℃，15min)将激活后的溶液置于4℃保存，24小时内使用。
[0230]
用1
×
等温延伸测活buffer将激活后的修饰酶由0.40u/ul被稀释至0.12u/μl。
[0231]
0.12u/μl＝15μl 0.4u/μl+35μl 1
×
等温延伸测活buffer
[0232]
待测酶：将重复的2管混为1管，分别稀释到0.008u/μl和0.012u/μl。
[0233]
对照酶：将重复的2管混为1管，混匀离心。
[0234]
稀释对照酶：neb对照酶taq(5.0u/μl)：
[0235]
酶量u酶浓度u/μl酶体积μl1
×
等温延伸测活buffer体积μl0.070.0147(0.12u/μl)530.060.0125(0.12u/μl)450.050.0105(0.12u/μl)550.040.0085(0.12u/μl)700.030.0065(0.12u/μl)950.020.0045(0.12u/μl)14500025
[0236]
稀释待测酶:
[0237]
酶量u酶浓度u/μl酶体积μl1
×
等温延伸测活buffer体积μl0.060.0125(0.12u/μl)45
0.040.0085(0.12u/μl)70
[0238]
配制等温延伸反应mix(20μl/份)：
[0239][0240]
8、加样
[0241]
使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0242]
先将5μl的稀释待测酶或对照酶(0-0.07u)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20μl的mix。其中酶终浓度为0时，加入5μl的1
×
等温延伸测活 buffer。
[0243]
封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)。
[0244]
荧光定量pcr设定程序：
[0245]
设定反应条件(72℃，30s)，22循环，反应体系设为25μl，荧光选择sybr green i。
[0246]
荧光定量pcr仪测定数据。
[0247]
详见于图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9。
[0248]
9、标准曲线的制定：
[0249]
(1)第一次信号值：
[0250][0251]
(2)第二次信号值：
[0252][0253][0254]
(3)第一次线性拟合曲线：详见于图10。
[0255]
(4)第二次线性拟合曲线：详见于图11。
[0256]
10、待测酶实验结果汇总分析：
[0257]
测量次数20200714#1p1m120191206#1p1m120210104#1p1c1m1第一次0.251.891.16第二次0.591.831.97第三次0.460.270.8第四次0.241.211.2第五次0.331.251.12第六次0.221.301.04平均值0.261.251.12std0.060.050.08cv22％4％7％
[0258]
实施例3：等温延伸测fast taq dna聚合酶的酶活
[0259]
1、稀释对照酶：neb对照酶taq(5u/μl)
[0260][0261]
2、稀释待测酶:fast taq(20210625#1p1c1d1)0.5mg/ml,预估活力40u/μl
[0262][0263]
3、配制等温延伸反应mix(20μl/份)
[0264]
[0265]
4、加样
[0266]
(1)使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管。
[0267]
(2)先将5ul的稀释待测酶或对照酶(0.0016至0.0080u/μl)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20ul的mix。其中酶终浓度为0时，加入5μl 的1
×
等温延伸测活buffer。
[0268]
(3)封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)。
[0269]
(4)荧光定量pcr设定程序：
[0270]
设定反应条件(72℃，30s)，62循环，反应体系设为25μl，荧光选择sybr green i。
[0271]
5、实验结果：
[0272]
荧光定量pcr仪测定数据，详见于图12、图13。
[0273]
6、标准曲线的制定：
[0274]
(1)标准曲线信号：
[0275]
荧光值1124.313111.94380.92364.23552.33637.25022.348-1.361荧光值2126.278106.62983.87867.89449.71736.19223.407-0.543荧光值3 113.60585.55365.25050.53136.13921.908-0.894酶量0.0400.0320.0240.0200.0160.0120.0080.000荧光值ave(t)125.296110.72683.45165.79350.86136.52722.554-0.933荧光值ave(t-0)126.228111.65884.38466.72651.79437.45923.4870.000std1.3903.6442.3441.8891.3400.6270.7710.410cv1.11％3.29％2.81％2.87％2.63％1.72％3.42％-43.97％
[0276]
(2)标准曲线线形图：详见于图14。
[0277]
(3)待测酶数据：
[0278][0279][0280]
7、1.fast taq酶第二次测试
[0281]
待测酶稀释倍数为30u，其他条件同上
[0282]
待测酶(1u/ul)＝5ul待测酶+145ul1*等温延伸buffer
[0283]
8、实验结果
[0284]
(1)荧光定量pcr仪测定数据，详见于图15、图16。
[0285]
(2)标准曲线的制定
[0286]
①
标准曲线信号：
[0287][0288]
②
标准曲线线形图：详见于图17。
[0289]
(3)待测酶数据：
[0290][0291][0292]
9、fast taq酶第三次测试
[0293]
待测酶稀释倍数为30u，其他条件同上
[0294]
待测酶(1u/ul)＝5ul待测酶+145ul1*等温延伸buffer
[0295]
10、实验结果
[0296]
(1)荧光定量pcr仪测定数据，详见于图18、图19。
[0297]
(2)标准曲线的制定
[0298]
①
标准曲线信号：
[0299][0300]
②
标准曲线线形图：详见于图20。
[0301]
(3)待测酶数据：
[0302][0303][0304]
fast taq待测酶实验汇总数据如下：
[0305]
测量次数k值fast taq 20210625#1p1c1d1酶活u/μl13329.1031.0423972.5031.2433781.8031.77平均值(u/μl)3694.4731.35std330.470.38cv8.95％1.20％
[0306]
实施例4：等温延伸测抗体修饰a-fast taq激活酶活
[0307]
1、激活：对照酶或待测酶激活活力，预估信息如下：
[0308][0309]
2、激活体系mix组成，见下表。
[0310]
为减小取样误差，稀释酶时，取样体积≥5μl。
[0311]
配制激活反应体系(25μl)。
[0312]
以neb taq(5u/μl)作对照，对照酶和待测样品均做2管重复。将反应液混匀离心。
[0313]
(1)酶的活力为10u/μl时，酶和1
×
fast storage buffer总体积为3μl，相当于稀释倍数为10倍(＝1*10)，激活体系里面终浓度为0.4u/μl；
[0314]
(2)酶的活力为5u/μl时，酶和1
×
taq/fast storage buffer总体积为3μl，相当于稀释倍数为5倍(＝1*5)，激活体系里面终浓度为0.4u/μl；
[0315]
(3)酶的活力为2.5u/μl时，酶和1
×
taq/fast storage buffer总体积为5μl，相当于稀释倍数为2.5倍(＝0.5*5)，激活体系里面终浓度为0.4u/μl。
[0316]
试剂浓度加入量μl终浓度tm buffer5
×
51
×1×
fast taq storage buffer1
×
1/对照酶或待测酶*5u/μl2/2/10.4u/μlnf水*/17/17/18/
[0317]
3、操作步骤
[0318]
(1)将反应管置于9700型pcr仪中，进行激活处理；
[0319]
激活程序为(95℃，5min)将激活后的溶液置于4度保存，24小时内使用；
[0320]
用1
×
等温延伸测活buffer将激活后的修饰酶由0.4u/μl被稀释至0.12u/μl；
[0321]
0.12u/μl＝15μl 0.4u/μl+35μl 1
×
等温延伸测活buffer；
[0322]
待测酶：将重复的2管混为1管，分别稀释到0.008u/μl和0.012u/μl；
[0323]
对照酶：将重复的2管混为1管，混匀离心。
[0324]
(2)稀释对照酶：neb对照酶taq(5u/μl)
[0325][0326]
(3)稀释待测酶:
[0327][0328]
(4)配制等温延伸反应mix(20μl/份)
[0329][0330]
(5)加样
[0331]
①
使用白色96孔pcr板(roche lc480型荧光定量pcr仪专用)作为反应管；
[0332]
②
先将5μl的稀释待测酶或对照酶(0-0.07u)分装到对应的反应孔中，做三管重复，然后向每个反应孔中加入20μl的mix。其中酶终浓度为0时，加入5μl的1
×
等温延伸测活buffer；
[0333]
③
封膜，在离心机上，2500rpm离心3min(离心机用之前先遇冷，离心时注意配平)；
[0334]
④
荧光定量pcr设定程序：
[0335]
设定反应条件(72℃，30s)，22循环，反应体系设为25μl，荧光选择sybr greeni。
[0336]
(6)荧光定量pcr仪测定数据，详见于图21、图22、图23。
[0337]
(7)标准曲线的制定：
[0338][0339][0340]
①
第一次a-fast taq标曲信号值：
[0341]
②
第一次线性拟合曲线：详见于图24。
[0342]
③
第一次待测酶a-fast taq酶活：
[0343][0344]
(8)荧光定量pcr仪测定数据
[0345]
①
详见于图25、图26、图27。
[0346]
②
fast taq标曲信号值：
[0347][0348]
③
第一次线性拟合曲线：详见于图28。
[0349]
④
待测酶a-fast taq酶活：
[0350][0351][0352]
⑤
实验数据分析：
[0353]
测量次数20210119#1p2c1d1m420210119#1p2c1d1m5第一次测试10.669.11第二次测试11.7612.18平均值11.2110.64
[0354]
结论：
[0355]
综上所述，所以本发明是一种实时检测超高速taq dna聚合酶的酶活检测的新方法，可以建立酶活测试的标准曲线，r2＞0.98，可以准确测定taq dna聚合酶的活性，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％。
[0356]
[0357]
[0358]
[0359]