191个人类微单倍型基因座遗传标记及其扩增引物和应用

1.本发明涉及法医遗传学鉴定技术领域，尤其涉及191个人类微单倍型基因座遗传标记及其扩增引物和应用。


背景技术：

2.短串联重复序列(short tandem repeat，str)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snp)是法医学常用遗传标记。str因多态性高、分布广泛的特点成为个体识别和亲缘关系鉴定的主流遗传标记，在实际案例检验中发挥着不可替代的作用。与str相比，snp突变率低、扩增片段短，还能提供祖先信息、预测个体表型特征，在降解检材分析、地理祖先推断上更具有优势。虽然在司法实践中str与snp都发挥了重要作用，但二者仍有很大的局限性，无法完全满足法医学要求。例如，高度降解检材片段长度部分小于100bp，而现有试剂盒str的片段长度范围大多在100bp～450bp；对于dna模板量极少的超微量检材，str扩增过程中由于复制滑脱常常出现stutter峰，使用毛细管电泳(capillary electrophoresis，ce)无法区分等位基因与stutter；而使用str分析混合检材时，容易受到stutter峰及检材混合比例的影响出现不确定性。对于snp来说，大多snp是二等位基因，单个snp多态性低，信息量不足，因此为达到与str相似的效能，需要增加检测位点数，然而，复合过多位点可能影响基因座间扩增效率均衡性，进而出现等位基因丢失。
3.亲缘关系鉴定是法医物证两大任务之一。目前的祖孙鉴定、全同胞鉴定和亲子鉴定已有相应的鉴定规范(亲权鉴定技术规范gb/t37223-2018，生物学全同胞关系鉴定技术规范sf/t 0117-2021；生物学祖孙关系鉴定规范sf/z jd0105005-2015)可以参照用于实际应用，其中祖孙鉴定对参与鉴定的被鉴定人具有严格要求，即要求祖父母、孩子和孩子生母同时参与鉴定，缺一不可。全同胞鉴定也是只能区分同父同母的全同胞与无关个体，而亲子鉴定需要孩子的父母至少一方参与鉴定。以上有规范参照的鉴定内容，日常商品化的试剂盒即可满足需求。但是在实际检案中时常遇到孩子的父母去世或者不能参与鉴定，以及需要鉴定祖孙关系(只有爷孙两人参与鉴定)、半同胞鉴定、叔侄鉴定、姑侄鉴定和姨外甥鉴定，这类鉴定属于二层级亲缘关系鉴定，是目前法医学研究的难点之一。


技术实现要素：

4.针对现有法医学遗传鉴定方法存在的上述问题，本发明提供191个人类微单倍型基因座遗传标记及其扩增引物和应用，该191个人类微单倍型基因座遗传标记用于法医遗传学鉴定中，不仅能够满足日常法医检案需求，还能单独解决两个体间的二层级亲缘关系鉴定，并具有极高的准确度、灵敏性和稳定性。
5.为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
6.一种191个人类微单倍型基因座遗传标记，包括如下191个人类微单倍型基因座：
7.8.9.10.11.12.13.134；68)seq id no.135-136；69)seq id no.137-138；70)seq id no.139-140；71)seq id no.141-142；72)seq id no.143-144；73)seq id no.145-146；74)seq id no.147-148；75)seq id no.149-150；76)seq id no.151-152；77)seq id no.153-154；78)seq id no.155-156；79)seq id no.157-158；80)seq id no.159-160；81)seq id no.161-162；82)seq id no.163-164；83)seq id no.165-166；84)seq id no.167-168；85)seq id no.169-170；86)seq id no.171-172；87)seq id no.173-174；88)seq id no.175-176；89)seq id no.177-178；90)seq id no.179-180；91)seq id no.181-182；92)seq id no.183-184；93)seq id no.185-186；94)seq id no.187-188；95)seq id no.189-190；96)seq id no.191-192；97)seq id no.193-194；98)seq id no.195-196；99)seq id no.197-198；100)seq id no.199-200；101)seq id no.201-202；102)seq id no.203-204；103)seq id no.205-206；104)seq id no.207-208；105)seq id no.209-210；106)seq id no.211-212；107)seq id no.213-214；108)seq id no.215-216；109)seq id no.217-218；110)seq id no.219-220；111)seq id no.221-222；112)seq id no.223-224；113)seq id no.225-226；114)seq id no.227-28；115)seq id no.229-230；116)seq id no.231-232；117)seq id no.233-234；118)seq id no.235-236；119)seq id no.237-238；120)seq id no.239-240；121)seq id no.241-242；122)seq id no.243-244；123)seq id no.245-246；124)seq id no.247-248；125)seq id no.249-250；126)seq id no.251-252；127)seq id no.253-254；128)seq id no.255-256；129)seq id no.257-258；130)seq id no.259-260；131)seq id no.261-262；132)seq id no.263-264；133)seq id no.265-266；134)seq id no.267-268；135)seq id no.269-270；136)seq id no.271-272；137)seq id no.273-274；138)seq id no.275-276；139)seq id no.277-278；140)seq id no.279-280；141)seq id no.281-282；142)seq id no.283-284；143)seq id no.285-286；144)seq id no.287-288；145)seq id no.289-290；146)seq id no.291-292；147)seq id no.293-294；148)seq id no.295-296；149)seq id no.297-298；150)seq id no.299-300；151)seq id no.301-302；152)seq id no.303-304；153)seq id no.305-306；154)seq id no.307-308；155)seq id no.309-310；156)seq id no.311-312；157)seq id no.313-314；158)seq id no.315-316；159)seq id no.317-318；160)seq id no.319-320；161)seq id no.321-322；162)seq id no.323-324；163)seq id no.325-326；164)seq id no.327-328；165)seq id no.329-330；166)seq id no.331-332；167)seq id no.333-334；168)seq id no.335-336；169)seq id no.337-338；170)seq id no.339-340；171)seq id no.341-342；172)seq id no.343-344；173)seq id no.345-346；174)seq id no.347-348；175)seq id no.349-350；176)seq id no.351-352；177)seq id no.353-354；178)seq id no.355-356；179)seq id no.357-358；180)seq id no.359-360；181)seq id no.61-362；182)seq id no.363-364；183)seq id no.365-366；184)seq id no.367-368；185)seq id no.369-370；186)seq id no.371-372；187)seq id no.373-374；188)seq id no.375-376；189)seq id no.377-378；190)seq id no.379-380；191)seq id no.381-382。
19.相对于现有技术，本发明提供的扩增所述191个人类微单倍型基因座遗传标记的引物可以在同一体系中特异性的扩增得到上述191个微单倍体基因座，引物对相互之间不会产生干扰，可以满足多重pcr的要求，进一步提高了利用其扩增的基因座作为遗传标记进
行法医学鉴定分析的准确性和稳定性，并简化了法医学鉴定的操作步骤，尤其降低了二层级亲缘关系鉴定的难度，具有极高的应用价值。
20.本发明还提供所述191个人类微单倍型基因座遗传标记在法医鉴定中的应用。
21.本发明还提供所述191个人类微单倍型基因座遗传标记在个体识别鉴定或亲缘关系鉴定中的应用。
22.优选的，所述亲缘关系鉴定包括亲子鉴定、全同胞鉴定、只有两个体参与的二层级亲缘关系鉴定。
23.本发明还提供一种法医学鉴定试剂盒，该试剂盒包括扩增所述191个人类微单倍型基因座遗传标记的引物。
24.优选的，所述法医学鉴定试剂盒还包括缓冲溶液、dna聚合酶和dntp。
25.本发明还提供所述的法医学鉴定试剂盒的使用方法，该使用方法为：提取待测样品的基因组dna为模板，用所述试剂盒进行pcr扩增，得到的扩增产物再进行接头序列pcr反应得到多重pcr文库，对多重pcr文库进行定量和二代测序检测分析，得到微单倍型基因座的分型结果。
26.优选的，所述pcr扩增的体系包括以下试剂及用量：
27.；
28.所述pcr扩增的程序为：
[0029][0030]
所述接头序列pcr反应的体系包括以下试剂及用量：
[0031][0032]
；
[0033]
所述接头序列pcr反应的程序为：
[0034][0035]
优选的，所述基因组dna的浓度为5ng-20ng。
[0036]
优选的，所述191个人类微单倍型基因座扩增引物的混合物中，每个引物的浓度为5-10μm。
[0037]
进一步优选的，所述法医学鉴定试剂盒还可以引入性别鉴定位点对应的引物或其他功能性鉴定引物，以满足所述法医学鉴定试剂盒对性别鉴定的需求。
附图说明
[0038]
图1是本发明实施例6中的检测的实施例4中的法医学鉴定试剂盒与现有试剂盒在相同鉴定中的系统效能对比图，其中，2nd vs.ur：二层亲缘关系鉴定，3rd vs.ur：三层亲缘关系鉴定；试剂盒类型：mh：实施例4中的法医学鉴定试剂盒，sig：signature，42str：本实验室构建的42个str试剂盒，com a：sig+42str两试剂盒联用，com b：上述三个试剂盒联用。
具体实施方式
[0039]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0040]
实施例1
[0041]
微单倍型基因座的筛选：
[0042]
22条常染色体上的191个微单倍型基因座的筛选，使用千人基因组数据库中的103名中国北京汉族和105名中国南方汉族人群的人群数据，按照以下特定的条件筛选得到：
[0043]
初筛：
[0044]
(1)去除重组热区；(2)去掉杂合度小于0.4的snp；(3)dna片段长度250bp内有2-5个snp，共筛选出245479个微单倍型基因座。并使用phase预估微单倍型基因座的单倍型及单倍型频率。
[0045]
复筛：
[0046]
在上述筛选出的微单倍型基因座进一步筛选：
[0047]
(1)dna片段长度200bp内有3～5个snp；(2)有效等位基因数大于2.5；(3)在ucsc浏览器上查看跨越微单倍型位置的上下游
±
200bp内的序列特征，剔除存在长poly结构、重复区域(repeat)、indel的微单倍型基因座；(4)扩增引物设计成功后，在ensembl浏览器上对序列进行blat，剔除能在基因组比对上多个位置的微单倍型基因座序列；(5)为了降低连锁可能性，位于同一染色体的微单倍型基因座物理距大于5mb。
[0048]
通过以上条件并能成功测序得到正确分型的总计191个微单倍型基因座，且所涉及优化的191对引物可以满足高通量扩增的要求，且相互之间不产生干扰。
[0049]
微单倍型基因座的命名
[0050]
目前国际上对微单倍型基因座没有规范的命名方式，kidd教授提出的命名方式有一定的局限性，不利于实验室之间微单倍型基因座的统一。本实验室提出一种新的微单倍型基因座命名方法，通过观察微单倍型的名字，可以直观的知道该微单倍型基因座位于几号染色体上，包含几个snp和snp在染色体上的位置。我们提出的命名方法包括微单倍型英文字母缩写“mh”、染色体编号、基因座内各snp的位置。例如mh1-1987049/096/145/156，“mh”为微单倍型简称以区分不同遗传标记，“1”为该基因座位于1号染色体上，“1987049”为基因座第一个snp在染色体上的位置，“096/145/156”分别表示第二个、第三个和第四个snp在该染色体上与第一个snp位置不相同的后几位数字。这样的命名方法直观明了，有利于各实验室间微单倍型基因座的统一，或随着研究人群的增多，一些snp在不同群体间的多态性具有差异，能够清晰的了解微单倍型基因座内snp的增加或删除。通过上述人群和特定的筛选条件，最终得到191个人类微单倍型基因座，且经检测分析，其合并了str和snp的优势，具有扩增片段短、突变率低、多态性良好、无stutter峰的优点。
[0051]
实施例2
[0052]
实施例1中筛选得到的一组人类微单倍型基因座，包括如下191个人类微单倍型基因座：
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
实施例3
[0062]
扩增实施例2中的191个人类微单倍型基因座的191对引物的序列分别如下：
[0063]
1)seq id no.1-2；2)seq id no.3-4；3)seq id no.5-6；4)seq id no.7-8；5)seq id no.9-10；6)seq id no.11-12；7)seq id no.13-14；8)seq id no.15-16；9)seq id no.17-18；10)seq id no.19-20；11)seq id no.21-22；12)seq id no.23-24；13)seq id no.25-26；14)seq id no.27-28；15)seq id no.29-30；16)seq id no.31-32；17)seq id no.33-34；18)seq id no.35-36；19)seq id no.37-38；20)seq id no.39-40；21)seq id no.41-42；22)seq id no.43-44；23)seq id no.45-46；24)seq id no.47-48；25)seq id no.49-50；26)seq id no.51-52；27)seq id no.53-54；28)seq id no.55-56；29)seq id no.57-58；30)seq id no.59-60；31)seq id no.61-62；32)seq id no.63-64；33)seq id no.65-66；34)seq id no.67-68；35)seq id no.69-70；36)seq id no.71-72；37)seq id no.73-74；38)seq id no.75-76；39)seq id no.77-78；40)seq id no.79-80；41)seq id no.81-82；42)seq id no.83-84；43)seq id no.85-86；44)seq id no.87-88；45)seq id no.89-90；46)seq id no.91-92；47)seq id no.93-94；48)seq id no.95-96；49)seq id no.97-98；50)seq id no.99-100；51)seq id no.101-102；52)seq id no.103-104；53)seq id no.105-106；54)seq id no.107-108；55)seq id no.109-110；56)seq id no.111-112；57)seq id no.113-114；58)seq id no.115-116；59)seq id no.11-118；60)seq id no.119-120；61)seq id no.121-122；62)seq id no.123-124；63)seq id no.125-126；64)seq id no.127-128；65)seq id no.129-130；66)seq id no.131-132；67)seq id no.133-134；68)seq id no.135-136；69)seq id no.137-138；70)seq id no.139-140；71)seq id no.141-142；72)seq id no.143-144；73)seq id no.145-146；74)seq id no.147-148；75)seq id no.149-150；76)seq id no.151-152；77)seq id no.153-154；78)seq id no.155-156；79)seq id no.157-158；80)seq id no.159-160；81)seq id no.161-162；82)seq id no.163-164；83)seq id no.165-166；84)seq id no.167-168；85)seq id no.169-170；86)seq id no.171-172；87)seq id no.173-174；88)seq id no.175-176；89)seq id no.177-178；90)seq id no.179-180；91)seq id no.181-182；92)seq id no.183-184；93)seq id no.185-186；94)seq id no.187-188；95)seq id no.189-190；96)seq id no.191-192；97)seq id no.193-194；98)seq id no.195-196；99)seq id no.197-198；100)seq id no.199-200；101)seq id no.201-202；102)seq id no.203-204；103)seq id no.205-206；104)seq id no.207-208；105)seq id no.209-210；106)seq id no.211-212；107)seq id no.213-214；108)seq id no.215-216；109)seq id no.217-218；110)seq id no.219-220；
111)seq id no.221-222；112)seq id no.223-224；113)seq id no.225-226；114)seq id no.227-28；115)seq id no.229-230；116)seq id no.231-232；117)seq id no.233-234；118)seq id no.235-236；119)seq id no.237-238；120)seq id no.239-240；121)seq id no.241-242；122)seq id no.243-244；123)seq id no.245-246；124)seq id no.247-248；125)seq id no.249-250；126)seq id no.251-252；127)seq id no.253-254；128)seq id no.255-256；129)seq id no.257-258；130)seq id no.259-260；131)seq id no.261-262；132)seq id no.263-264；133)seq id no.265-266；134)seq id no.267-268；135)seq id no.269-270；136)seq id no.271-272；137)seq id no.273-274；138)seq id no.275-276；139)seq id no.277-278；140)seq id no.279-280；141)seq id no.281-282；142)seq id no.283-284；143)seq id no.285-286；144)seq id no.287-288；145)seq id no.289-290；146)seq id no.291-292；147)seq id no.293-294；148)seq id no.295-296；149)seq id no.297-298；150)seq id no.299-300；151)seq id no.301-302；152)seq id no.303-304；153)seq id no.305-306；154)seq id no.307-308；155)seq id no.309-310；156)seq id no.311-312；157)seq id no.313-314；158)seq id no.315-316；159)seq id no.317-318；160)seq id no.319-320；161)seq id no.321-322；162)seq id no.323-324；163)seq id no.325-326；164)seq id no.327-328；165)seq id no.329-330；166)seq id no.331-332；167)seq id no.333-334；168)seq id no.335-336；169)seq id no.337-338；170)seq id no.339-340；171)seq id no.341-342；172)seq id no.343-344；173)seq id no.345-346；174)seq id no.347-348；175)seq id no.349-350；176)seq id no.351-352；177)seq id no.353-354；178)seq id no.355-356；179)seq id no.357-358；180)seq id no.359-360；181)seq id no.61-362；182)seq id no.363-364；183)seq id no.365-366；184)seq id no.367-368；185)seq id no.369-370；186)seq id no.371-372；187)seq id no.373-374；188)seq id no.375-376；189)seq id no.377-378；190)seq id no.379-380；191)seq id no.381-382。
[0064]
实施例4
[0065]
一种法医学鉴定试剂盒，包括扩增上述191个人类微单倍型基因座的引物(实施例3中的191对引物)、igt-em808聚合酶混合物、增强缓冲液nb、增强缓冲液m、yf缓冲液b、igt-i5标签和igt-i7标签。
[0066]
上述法医学鉴定试剂盒的使用方法为：
[0067]
提取待测人员全血中的基因组dna，以提取的基因组dna为模板，进行pcr扩增，得到的扩增产物再进行接头序列pcr反应得到鉴定产物即多重pcr文库。
[0068]
其中，上述pcr扩增的体系包括以下试剂及用量：
[0069]
；
[0070]
上述pcr扩增的程序为：
[0071][0072]
对上述pcr扩增得到的扩增产物进行第一轮磁珠纯化，具体方法如下：
[0073]
1)向pcr管(装有30ul的pcr扩增产物)中加入27ul室温平衡后的ampure xp磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0074]
2)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96 side磁力架上3min；
[0075]
3)移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入50ul yf bufferb用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0076]
4)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96 side磁力架上3min；
[0077]
5)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul 80％乙醇溶液，静置30sec；
[0078]
6)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul 80％乙醇溶液，静置30sec后移除上清；
[0079]
7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
[0080]
8)将pcr管从磁力架取下，加入24ul nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
[0081]
9)将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；
[0082]
10)用移液器吸取13.5ul上清液，转移到新的200ul pcr管内，新的pcr管内的上清液为纯化后的多重pcr扩增产物。
[0083]
上述接头序列pcr反应的体系包括以下试剂及用量：
[0084]
；
[0085]
上述接头序列pcr反应的程序为：
[0086][0087]
对上述接头序列pcr反应得到的扩增产物进行第二轮磁珠纯化，具体方法如下：
[0088]
1)向pcr管(装有接头序列pcr反应得到的扩增产物)中加入27ul室温平衡后的ampure xp磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0089]
2)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96 side磁力架上3min；
[0090]
3)移除上清，将pcr管从磁力架取下，向管内加入50ul yf bufferb，用移液器轻缓吸打混匀20次；
[0091]
4)室温孵育5min后，将pcr管置于dynamag-96 side磁力架上3min；
[0092]
5)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul 80％乙醇溶液，静置30sec；
[0093]
6)移除上清，pcr管继续放置在磁力架上，向管内加入180ul 80％乙醇溶液，静置30sec后移除上清；
[0094]
7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
[0095]
8)将pcr管从磁力架取下，加入24ul nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
[0096]
9)将pcr管重新置于磁力架上，静置3min；
[0097]
10)用移液器吸取20ul上清液，转移到新的pcr管中，新的pcr管中的上清即为得到的多重pcr文库。
[0098]
文库定量：
[0099]
取2ul制备好的多重pcr文库使用3.0fluorometer定量仪(qubit dsdna hs assay kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。正常文库的浓度范围为5ng/ul-50ng/ul，文库浓度主要与模板的质量相关。
[0100]
文库质量检测：
[0101]
将定量的文库稀释到5ng/ul，取10ul使用gx touch 24(dna hisens chip&reagent kit)进行文库片段长度检测，正常文库的靶片段分布区间在280bp
–
420bp之间。
[0102]
miseq fgx平台进行上机测序检测：
[0103]
参照miseq system denature and dilute libraries guide(document#15039740v10)的protocol a变性和稀释构建好的文库和phix，参照illumina experiment manager software guide(document#15031335v08)使用iem软件编辑样本表格，参照miseq system guide(document#15027617 v05 material#20000262)进行上机测序。本实验选用的测序试剂为miseq reagent kit v3或miseq fgx reagent kit(micro flow cell&standard flow cell)，pe300双端测序。
[0104]
实施例5
[0105]
重复性测试：
[0106]
使用细胞系na18530对实施例4中的试剂盒进行重复性研究，一种为分别三次构建文库，同时上机测序；另一种是一次构建好的文库，分别三次上机测序。经过数据分析比对，na18530全部191个微单倍型基因座的分型均一致，表明实施例4中的微单倍型复合扩增试剂盒(法医学鉴定试剂盒)具有良好的重复性。
[0107]
灵敏度测试：
[0108]
使用细胞系na18530对实施例4中的试剂盒进行灵敏度研究，第一轮pcr扩增的起始模板量分别为10ng、5ng、2.5ng、1ng、500pg、250pg、125pg、62.5pg，重复一次。经过数据分析，起始模板量为250pg时仍然能够得到全部微单倍型基因座的准确分型。当起始模板量为125pg时，有一个微单倍型基因座出现了等位基因丢失。当起始模板量为62.5pg时，两次重复分别存在11个和13个微单倍型基因座的杂合子均衡性达不到设定的阈值，此外还有一个起始模板量为62.5pg的样本存在3个微单倍型基因座的等位基因丢失。综上表明实施例4中的微单倍型复合扩增试剂盒灵敏度能够达到250pg，具有非常好的灵敏度。
[0109]
稳定性测试：
[0110]
使用细胞系na18530对实施例4中的试剂盒进行稳定性研究，稳定性研究包括两种，一种是在dna中分别加入腐殖酸和血色素两种pcr抑制剂，另一种是使用超声打断制备降解检材。
[0111]
(1)腐殖酸pcr抑制剂，1ng/ul的dna溶液中腐殖酸的浓度分别为25ng/ul、50ng/ul、75ng/ul和100ng/ul，第一轮pcr扩增dna起始模板量为5ng，重复一次。经过数据分析，当腐殖酸浓度为25ng/ul时，就出现了两个微单倍型基因座的等位基因丢失。
[0112]
(2)血色素pcr抑制剂，1ng/ul的dna溶液中血色素的浓度分别为100um、200um、300um和400um，第一轮pcr扩增dna起始模板量为5ng，重复一次。经过数据分析，当血色素浓度为200um时，就出现了两个微单倍型基因座的等位基因丢失。
[0113]
(3)超声打断dna制备降解检材，按照表1中的条件进行超声打断，qubit定量稀释到5ng/ul进行文库构建。人工制备的降解检材同时采用gstar
tm
25试剂盒(北京金马晟和科技有限公司)进行复合str扩增，采用abi 3500遗传分析仪进行毛细管电泳分析。经gstar
tm 25试剂盒扩增的dna，在超声打断10min后已经出现了严重的基因座不均衡，超声打断20min后出现了整个基因座的等位基因丢失。
[0114]
表1超声打断的条件
[0115][0116]
然而使用实施例4中的微单倍型试剂盒检测的降解dna，超声打断30min后仍能全部获得准确分型。可见上述微单倍型基因座扩增试剂盒具有很好的抗降解能力，可以应用到法医实际检案中。
[0117]
实施例6
[0118]
利用实施例4中的试剂盒对221名河北汉族健康无关个体进行群体数据调查，通过hardy-weinberg平衡检验发现191个微单倍型基因座在该群体处于hardy-weinberg平衡状态。
[0119]
另外，进行基因座独立性分析，得到191个微单倍型基因座处于连锁平衡状态，相互独立。
[0120]
计算实施例4中的试剂盒的系统效能，具体见表2，能够证实该微单倍型基因座试剂盒(法医学鉴定试剂盒)能够解决同一认定、亲子鉴定以及祖孙鉴定的问题。
[0121]
表2微单倍型基因座试剂盒的系统效能
[0122]
locustdpcpeduocpetriorge191个1-2.2025e-1381-6.4440e-221-7.6383e-401-2.5273e-17
[0123]
注：tdp：累积个人识别概率；cpeduo：二联体累积非父排除概率；
[0124]
cpetrio：三联体累积非父排除概率；rge：平均非祖父母排除率。
[0125]
为检验本试剂盒在远亲关系鉴定中的应用价值，利用221个河北汉族无关个体的人群等位基因频率，按照遗传规律模拟二层亲缘关系个体对、三层亲缘关系关系对与无关个体对各50万对，分别进行二层与三层亲缘关系鉴定，以受试者操作特征曲线(roc曲线)下面积(auc)作为系统效能评价指标，并与商品化试剂盒forenseq
tm
dna signature prep kit(verogen)及本实验室前期构建的42个str基因座组成的二代测序试剂盒在相同鉴定中的系统效能进行对比，结果如图1所示，其中，2nd vs.ur：二层亲缘关系鉴定，3rd vs.ur：三层亲缘关系鉴定；试剂盒类型：mh：实施例4中的法医学鉴定试剂盒，sig：signature，42str：本实验室构建的42个str试剂盒(已公开发表)，com a：sig+42str两试剂盒联用，com b：上述三个试剂盒联用。可见，该试剂盒在上述二层与三层亲缘关系鉴定中的系统效能均与另两个试剂盒联用时结果相当。实施例4中的试剂盒在祖孙鉴定中，auc达0.9999以上，并且可以独立解决两个体间二层亲缘关系鉴定问题，解决了因父母样本不能提供而无法实现祖孙鉴定结果的难题。
[0126]
实施例7
[0127]
一种法医学鉴定试剂盒，包括实施例3中的191对引物和6对位于性染色体的引物，其它试剂与实施例4中的法医学鉴定试剂盒中的试剂相同。
[0128]
6对位于性染色体的引物对应鉴定性别的6个snp位点，该6个snp位点及其对应的6对引物如表3所示。
[0129]
表3用于鉴定性别的6个snp位点及其引物
[0130]
[0131][0132]
利用上述法医学鉴定试剂盒进行高通量多重pcr检测(检测方法同实施例4)，其不仅能实现同一认定、亲子鉴定、祖孙鉴定、只有两人参与的祖孙、姑侄或叔侄等二层级亲缘关系的准确鉴定，还能满足性别的准确判断。
[0133]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。