用于治疗、改善、和/或预防由DNAse1和/或DNAse1L3缺陷引起或与之相关的疾病或障碍的组合物和方法

用于治疗、改善、和/或预防由dnase1和/或dnase1l3缺陷引起或与之相关的疾病或障碍的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术依照35u.s.c.
§
119(e)要求2020年1月11提交的美国临时专利申请号62/959,932的优先权，特此通过引用并入其全部内容。


背景技术：

3.红斑狼疮(或狼疮)是人免疫系统过兴奋而攻击健康组织的一组自身免疫性疾病的总称。这些疾病的症状会影响多种不同的身体系统，包括关节、皮肤、肾脏、血细胞、心脏和肺。最常见和最严重形式的狼疮是系统性红斑狼疮(sle)。
4.狼疮症状因人而异，并且可能偶尔发生。常见的症状是关节疼痛和肿胀，以及关节炎，主要发生在手指、手、手腕和膝盖。其它常见症状包括：呼吸时胸痛；口腔溃疡；疲劳；体重减轻；无其它病因的发烧；全身不适、不安或不适(不舒服)；脱发；对阳光敏感；“蝴蝶形”面部皮疹，见于大约一半的sle患者；和肿大的淋巴结。狼疮是一种高发病率状况，大多数患者经历危及生命的肾炎。
5.狼疮被认为受到多种基因和基因多态性的影响，其中超过30种如今与这种障碍有关。sle发病机制与清除凋亡细胞释放的dna的能力降低有关，随着时间的推移，凋亡细胞释放的dna的积累会引发自身免疫反应和抗dna自身抗体的形成。有两个与sle相关的关键特征：t淋巴细胞和b淋巴细胞两者活化失调和参与组织损伤的抗dna自身抗体——尤其是抗双链dna——的发展。主要组织相容性复合物(mhc)ii类基因、某些iii类基因[补体组分2(c2)和4(c4a)、肿瘤坏死因子(tnf)和热休克蛋白70kd(hspa1a)等位基因]和其它非mhc基因[igg的fc片段、低亲和力iia和iiia(fcgr2a和fcgr3a)、白细胞介素6和10(il6和il10)和b细胞cll/淋巴瘤2(bcl2)的受体]都可能导致易感性。然而，导致疾病易感性的主要基因座和等位基因目前尚不清楚。
[0006]
最近有人描述了一种罕见的常染色体隐性形式的sle，在dnase1l3基因中存在无效突变(al-mayouf,et al.,2011,nature genetics 43(12),1186-1188)。dnase1l3相关sle是儿科发病，并且与高发的狼疮性肾炎有关。事实上，发现dnase1l3缺陷小鼠迅速产生抗双链dna和染色质的抗体，随后出现免疫活化、igg在肾小球中沉积和肾小球肾炎。dnase1l3是dnase i的三种人同系物中的一种；此酶发挥核酸内切酶的作用，能够切割单链dna和双链dna，不受肌动蛋白抑制，并在细胞凋亡过程中介导dna的分解。另一方面，dnase1以非常高(亚纳摩尔(sub-nanomolar))的亲和力结合肌动蛋白单体，而以较低的亲和力结合肌动蛋白多聚物；结合肌动蛋白的dnase i是酶失活的。dnase1切割非复合的dna，而dnase1l3切割染色质。
[0007]
遗憾地是，迄今为止，文献中都尚未描述旨在治疗与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的狼疮以及与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的其它病理的稳定且生物可利用的dnase1和/或dnase1l3酶生物制剂。
[0008]
因此，本领域需要可用于治疗由dnase1和/或dnase1l3缺陷导致的和/或与之相关
的疾病或障碍诸如但不限于sle的组合物和方法。本公开实现了这种需求。


技术实现要素：

[0009]
本公开提供了某些构建体，诸如但不限于dnase1
–
x1
–
连接体
–
fc
–
x2和dnase1l3
–
x1
–
连接体
–
fc
–
x2，其中dnase1、dnase1l3、x1、x2、连接体和fc在本文其它部分定义。此外，本公开提供了包含至少一种本公开的构建体的某些同型二聚体构建体。
[0010]
本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的狼疮形式的方法。此外，本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中与低效net水解(netolysis)相关的疾病和/或障碍的方法。此外，本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的自身免疫性障碍的方法。此外，本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中的病理性血栓形成的方法。此外，本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中的心肌梗塞的方法。此外，本公开提供了使用本公开的某些构建体治疗、改善、和/或预防对象中的癌症转移的方法。
附图说明
[0011]
当结合附图阅读时，将会更好地理解以下对本公开示例性实施方式的详细描述。出于示例本公开的目的，在附图中示处了示例性实施方式。然而，应当理解，本公开不限于附图中所示实施方式的精确布置和实施方案。
[0012]
图1示例了中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular trap)(net)的形成。扫描电子显微镜下中性粒细胞(标记为a)投射网(标记为b)而捕获幽门螺杆菌(helicobacter pylori)(其中一些标记为c)。图片取自kumamoto t,et al.,2006,eur heart j.27(17):2081-7。
[0013]
图2示例了本公开的非限制性dnase1-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0014]
图3示例了本公开的非限制性dnase1l3-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0015]
图4示例了本公开的非限制性dnase1-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0016]
图5示例了本公开的非限制性构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。在某些实施方式中，某些突变使rdnase过兴奋和/或使rdnase抗肌动蛋白(即对肌动蛋白亲和力降低)和/或增加构建体的半衰期。示例了小鼠dnase1(seq id no:42)和小鼠dnase1l3(seq id no:43)的氨基酸序列的非限制性比对。
[0017]
图6示例了本公开的非限制性构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。在某些实施方式中，构建体缺少至少部分dnase1l3核定位结构域。
[0018]
图7示例了指示出某些dnase1l3克隆切割染色质的凝胶，但某些dnase1克隆并非如此。
[0019]
图8示例了本公开的非限制性构建体。在某些实施方式中，dnase1多肽与dnase1l3的c-末端尾部融合。
[0020]
图9示例了dnase-fc构建体的产生和纯化的某些方面。
[0021]
图10a-10b示例了本公开的某些net降解构建体的体内药效动力学。
[0022]
图11示例了本公开的某些net降解构建体的非限制性纯化凝胶。
[0023]
图12示例了如下发现：与单独的经优化的dnase1或dnase1l3构建体相比，包含dnase1和dnase1l3的非限制性的经优化的异源二聚体展现了增加的net降解。显示了本技术中描述的各种构建体对单独的dna(上面的凝胶)和结合了蛋白质的dna(下面的凝胶)的dnase降解活性。泳道2和泳道5显示了由dnase1和dnase1l3组成的纯化的异源二聚体(构建体1669和1689的异源二聚体)，泳道1、3、4和6显示了各种纯化的经优化的dnase1构建体，以及泳道7是纯化的经优化的dnase1l3构建体。如图所示，只有异源二聚体可以同时消化质粒dna(上面的凝胶)和染色质dna(下面的凝胶)，可通过凝胶中dna条带尺寸减小来鉴定。
具体实施方式
[0024]
本发明一方面涉及发现了某些构建体可用于治疗、改善、和/或预防与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的疾病或障碍。
[0025]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防与dnase1l3缺陷相关的狼疮形式(包括sle)。
[0026]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防与低效net水解(“netolysis”)相关的疾病和/或障碍。
[0027]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防自身免疫性障碍，诸如但不限于狼疮(包括sle)、甲状腺自身免疫性疾病、和低补体血症荨麻疹性血管炎综合征(hypocomplementeric urticarial vasculitis syndrome)(huvs)。
[0028]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防病理性血栓形成，诸如但不限于微血管血栓形成、静脉血栓形成、和/或动脉血栓形成。在某些实施方式中，病理性血栓形成包括中性粒细胞血栓形成，其包括但不限于抗中性粒细胞胞浆自身抗体(anti-neutrophilic cytoplasmic autoantibodies)(anca)血管炎、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)和白塞(bechet's或behcet's)病或综合征。在某些实施方式中，病理性血栓形成包括导致中风的血栓形成。
[0029]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防心肌梗塞。
[0030]
在某些实施方式中，本文考虑的构建体可用于治疗、改善、和/或预防癌症的扩散和进展(例如，癌症转移)。
[0031]
本公开提供了包含与某些蛋白质融合的dnase1l3和/或dnase1多肽(或其片段、重排、(点)突变、截短、和/或任意其它修饰和/或类似物和/或衍生物)的稳定且生物可利用的构建体。在某些实施方式中，与本领域已知的dnase1l3和/或dnase1多肽相比，本文考虑的构建体具有提高的生物利用度和/或可开发性(developability)。在某些实施方式中，与本领域已知的dnase1l3和/或dnase1多肽相比，本文考虑的构建体具有增强的酶活性。在某些实施方式中，与本领域已知的dnase1l3和/或dnase1多肽相比，本文考虑的构建体具有改善的药代动力学行为。在某些实施方式中，与本领域已知的dnase1l3和/或dnase1多肽相比，本文考虑的构建体具有增强的稳定性。
[0032]
在某些实施方式中，本公开的构建体的体内半衰期是本领域中描述的dnase1和/
或dnase1l3多肽的至少约1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、和/或20倍长。在其它实施方式中，本公开的构建体以比本领域中其它dnase1和/或dnase1l3多肽低的剂量和/或低的频率向对象施用。在又其它实施方式中，本公开的构建体每月一次、每月两次、每月三次、和/或每月四次向对象施用。在又其它实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3多肽相比，本公开的构建体的较低频率施用导致更好的患者依从性(compliance)和/或提高的功效。
[0033]
本公开的构建体可用于治疗由减少的和/或低效的和/或次优的中性粒细胞胞外陷阱(net)降解和/或清除和/或水解导致的和/或与之相关的疾病或障碍。多形核白细胞(pmn)是最丰富的白细胞形式，在组织和血液中循环，寻找入侵的微生物。如果pmn遇到入侵的微生物时，细胞会以一系列机制来与感染作战，包括吞噬作用、在称为脱粒的过程中释放储存的抗菌化合物、以及作为最后手段的自毁过程，其中pmn“爆破”，释放出被称为“中性粒细胞胞外陷阱”或net的捕获dna和细胞毒性物质的网。net是捕获入侵病原体的细胞外的源自中性粒细胞的dna网。net的主干是一个粘性染色质网，附着有各种抗菌细胞毒性蛋白质和肽，当pmn响应感染性刺激而脱粒时，这些蛋白质和肽与染色质一起释放。net在入侵生物附近维持高浓度的抗菌化合物，提高了细胞毒性剂的效力，从而中和入侵病原体以防止其扩散并消除感染威胁。
[0034]
尽管net具有抗感染的有益作用，但其必须从组织和循环中快速有效地清除，否则会产生严重的病理后果。具体地，与低效net水解(“netolysis”)相关的疾病包括自身免疫性障碍，如狼疮、病理性血栓形成(诸如但不限于导致中风的血栓形成)和心肌梗塞，以及癌症的扩散和进展。
[0035]
net通常被血液基(blood-based)金属酶降解，并且几种循环酶同种型水解dna中的高能键以实现netolysis。为此，不同的酶同种型将dna识别为游离核酸或与蛋白质如net蛋白质骨架中的染色质结合。在系统性红斑狼疮(sle)，包括儿童群体中出现的可遗传且高侵袭形式的sle中发现了这些酶的功能缺失突变。此外，net促进癌症进展和转移，而抑制net显示了鼠模型中癌症转移减少。
[0036]
肿瘤进展和转移中的net：目前，通过手术完全切除对癌症进行局部区域控制是所有形式的实体瘤的主要治疗方式，并且在辅助治疗(adjuvant setting)下显著提高了大多数肿瘤的无病生存率和总体生存率(disease free and overall survival)。因此，控制术后远处转移对患者的结局至关重要，而目前全身化疗用于控制肿瘤复发，结果不一。长期以来，与癌症治疗相关的感染性并发症与不良的肿瘤学结果相关，而和与感染性并发症相关的发病率无关，在广泛范围的恶性肿瘤包括肺、乳腺、结肠和食道肿瘤中都发现了这一现象。具体地，手术或化疗后的治疗后感染与转移性疾病死亡率的提高密切相关。令人遗憾的是，感染性并发症在肿瘤学中经常发生，在某些系列中接近40％。最近，感染与肿瘤复发之间的关联与肿瘤微环境中net的存在有关。由感染引起的中性粒细胞脱粒增加了net，它与血液中的肿瘤细胞结合，而且似乎支持它们的转移进展。
[0037]
在发现感染诱导的net形成可能导致癌症的进展和扩散后，研究人员研究了癌细胞本身诱导net形成的能力，发现高侵袭性的癌细胞能够在没有感染的情况下诱导net形成。癌细胞似乎通过诱导中性粒细胞挤出net来“劫持”免疫系统，以便搭便车穿过循环系统并支持它们附着到远处的转移部位。这些发现得到了晚期食道癌、肺癌和胃gi癌患者体内
循环net水平与其癌症分期——即在原发肿瘤远处位点存在癌症的情况下(即i期-ii期癌症的血液中net少于iii期-iv期癌症)直接相关的支持。这些发现表明，net数可用作这些侵袭性形式的癌症中癌症进展的独立生物标志物。同样支持net协助侵袭性形式的癌症转移的观点是，在肺癌、gi癌和乳腺癌的临床前鼠模型中net的抑制阻止了循环肿瘤细胞与肝血窦的粘附，并减少了肺转移的出现。这些研究表明，net在人肿瘤小鼠模型中促进肝和肺转移，而靶向net可抑制肿瘤的转移扩散。
[0038]
目前关于net在癌症中的作用的研究表明，循环net水平是肿瘤进展和转移在预后上重要的生物标志物，人癌细胞能够诱导促进转移的net以协助其生长和扩散，并且抑制net的形成可抑制人gi癌、肺癌和乳腺癌鼠模型中的肿瘤进展和转移。总的来说，这些研究支持在癌症治疗中使用基于net的疗法。
[0039]
聚焦系统性红斑狼疮(sle)的自身免疫性疾病：长期以来，人们一直认为死亡和凋亡细胞的清除不足与自身免疫性疾病包括某些形式的sle的发病机制直接相关。这一观点源于40年前首次报道的发现，即sle患者的血清dnase1活性低于健康对象，dnase1是血液中主要否则将dna从死亡和凋亡细胞中去除以及清除net的酶。此外，低dnase1活性与狼疮(iii型或iv型)肾病的活跃期有关，表明dnase1活性与sle肾病的发展有关。
[0040]
针对这些临床观察结果，研究人员设计了缺乏dnase1活性的转基因dnase1敲除小鼠，并发现这些小鼠重现了人sle中存在的临床和生化表型，包括出现双链dna(dsdna)抗体、自身抗体在肾小球表面上沉积导致的肾小球肾炎、和围管状浸润(perivascular infiltrates)。引人注目的是，dnase1缺陷小鼠也重现了患有sle的人中的雌性偏见。
[0041]
dnase1的失活突变以杂合模式出现在两名患有小儿狼疮的日本患者中(yasutomo i et al.,2001,nat genet.2001；28(4):313-4)。重要的是，这些女孩具有非常低的dnase1活性和非常高滴度的抗核小体和抗双链dna(dsdna)抗体。在这项研究之后，在几个早在2岁就出现狼疮的阿拉伯家庭中发现了dnase1l3的纯合失活突变(al-mayouf,et al.,2011,nature genetics 43(12),1186-1188)，提出了这种疾病的一种非常具有侵袭性的形式。将dnase1和dnase1l3与人自身免疫性疾病联系起来的其它证据是，在西班牙sle患者、白种人甲状腺自身免疫性疾病患者、以及土耳其和意大利低补体血症荨麻疹性血管炎综合征——一种与sle的临床特征重合的自身免疫性障碍——患者中对dnase1的功能丧失变体的鉴定。
[0042]
虽然这些发现支持dnase1和dnase1l3参与人自身免疫性疾病发病机制的观点，但随后的研究确定了这些突变的频率非常罕见，在自身免疫性疾病患者中基本上低于1％。最后，在产生完全失活的酶的sle中鉴定出了白种人特异性的dnase1l3的等位基因中的单核苷酸多态性(snp)。在三个白种人群体(墨西哥人、土耳其人和德国人)中发现该等位基因频率——预测了次等位基因频率(minor allelic frequency)分别为0.017、0.052和0.077。由于使患者易患自身免疫性疾病需要dnase1l3功能的纯合丧失，因此预期这种形式的dnase1l3缺陷所导致的遗传上定义的病例的数量也非常低。
[0043]
随着在狼疮患者中鉴定的dnase1的常见多态性的鉴定，这种情况发生了巨大变化。第8外显子q244r多态性的snp，也被称为rs1053874，以0.494的次等位基因频率分布于全球。发现该等位基因的r244形式与韩国狼疮患者中抗核糖核蛋白(抗rnp)抗体的产生密切相关，并且与阿根廷患者的sle易感性显著相关。根据这种关联，日本研究人员确定了
r244变体的酶活性是q244变体的一半，从而说明具备r244多态性的患者发生自身免疫性疾病的倾向更大。然后，相同的研究人员继续系统地评估ensembl数据库(ensemble dot org)中所有非同义dnase1snp，最终鉴定出了60个dnase1功能丧失变体，所有这些变体都具有潜在的致病性。大多数这些形式的出现都非常罕见，但最常见的变体的频率(rs1053874
–
q244r,mar为0.494)预期将在全世界约25％的人口中以纯合子的形式出现。
[0044]
病理性血栓形成中的net：另一个治疗干预领域——靶向net可证明有治疗性——是血管血栓形成，诸如但不限于微血管血栓形成、静脉血栓形成、和动脉血栓形成。在某些实施方式中，本公开考虑了中性粒细胞血栓形成，其包括但不限于抗中性粒细胞胞浆自身抗体(anca)血管炎、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、和白塞(或贝赫切特)病或综合征。net促进血栓形成，并且可能在癌症和心肌梗塞等病理环境中增强血栓形成(thalin c,et al.,2019,arterioscler thromb vasc biol.39(9):1724-38)。血清dnase1活性在急性心肌梗塞早期突然升高，并且上述dnase1的低活性多态性(rs1053874)在经历活跃性心肌梗塞的日本患者体内显著增加(与稳定型心绞痛相反)。这些发现直接暗示dnase1功能降低与心肌梗塞有关。
[0045]
现在将详细参考所公开主题的某些实施方式。尽管将结合所列举的权利要求描述所公开的主题，但是应当理解，所示例的主题并不旨在将权利要求限制于所公开的主题。
[0046]
在整个文档中，应以灵活的方式解释以范围格式表示的值，从而不仅包括明确列举为范围界限的数值，而且还包括该范围内包含的所有单个数值或子范围，就好像每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，“约0.1％至约5％”或“约0.1％至5％”的范围应解释为不仅包括约0.1％至约5％，而且包括所指示范围内的单个值(例如1％、2％、3％和4％)以及子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％、3.3％至4.4％)。除非另外指出，否则陈述“约x至y”具有与“约x至约y”相同的含义。同样地，除非另外指出，否则陈述“约x、y或约z”与“约x、约y或约z”具有相同的含义。
[0047]
定义
[0048]
如本文所用，以下每个术语在本章节中具有与其相关的含义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语通常都具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。总体上，本文所用的命名法以及动物药理学、药物科学、分离科学和有机化学中的实验室程序是本领域公知且常用的。应当理解，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要，只要本教导仍然可操作即可。章节标题的任何使用均旨在帮助阅读文档，而不应理解为限制性的；与章节标题相关的信息可能发生在该具体章节之内或之外。本文中所引用的所有出版物、专利和专利文件都通过引用以其整体并入本文，就像通过引用将其单独地并入一样。
[0049]
在本技术中，在元素或组分被认为包括在所叙述的元素或组分的列举中和/或选自所叙述的元素或组分的列举的情况下，应当理解，该元素或组分可以是所叙述的元素或组分中的任何一个，并且可以选自所叙述的元素或组分中的两个或更多个。
[0050]
在本文所述的方法中，可以以任何顺序执行动作，除非明确地叙述了时间或操作序列。此外，可以同时执行指定的动作，除非明确的权利要求语言叙述了它们是分开执行的。例如，可以在单个操作中同时执行所要求保护的进行x的动作和所要求保护的进行y的动作，并且所得的方法将落入所要求保护的方法的字面范围内。
[0051]
在文档中，除非上下文另外明确指出，否则术语“一个”、“一种”或“该/所述”用于包括一个或多个。除非另有说明，否则术语“或”用于指代非排他性的“或”。陈述“a和b中的至少一个”或“a或b中的至少一个”与“a、b或a和b”具有相同的含义。
[0052]
当提及诸如量、时间上的持续时间等的可测量值时，本文所使用的“约”意指涵盖指定值的
±
20％或
±
10％，在某些实施方式中为
±
5％，在某些实施方式中为
±
1％，在某些实施方式中为
±
0.1％的变化，因为这样的变化适用于执行所公开的方法。
[0053]
如果疾病或障碍的症状的严重性、患者经历这种症状的频率、或两者都降低，则该疾病或障碍是“减轻”的。
[0054]
如本文所用，术语“改变”、“缺陷”、“变异”或“突变”是指在细胞中影响其编码的多肽的功能、活性、表达(转录或翻译)或构象的基因的突变，包括错义和无义突变、插入、缺失、移码和过早终止。
[0055]
如本文所用，术语“抗体”是指能够与抗原上特异性表位特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，也可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。
[0056]
如本文所用，术语“auc”是指血浆药物浓度-时间曲线(auc)下的面积，并且与施用一定剂量药物后对药物的实际身体暴露相关。在某些实施方式中，auc以mg*h/l表示。auc可用于测量药物的生物利用度，其为通过任意途径施用后被完整吸收并到达作用部位或全身循环的未改变药物的分数。
[0057]
可以使用线性梯形法或对数梯形法来计算auc。线性梯形法使用数据点之间的线性插值来计算auc。ogd和fda要求此方法，并且其为生物等效性试验的标准。对于给定的时间间隔(t1–
t2)，auc可以计算如下：
[0058][0059]
其中c1和c2是时间间隔(t1和t2)内的平均浓度。
[0060]
对数梯形法使用数据点之间的对数插值来计算auc。当浓度降低时，这种方法更准确，这是因为药物消除是指数的(这使得它在对数刻度上呈线性)。对于给定的时间间隔(t1–
t2)，auc可以计算如下(假设c1》c2)：
[0061][0062]
如本文所用，术语“生物利用度”是指活性部分(蛋白质或药物或代谢物)进入全身循环从而进入作用部位，或通过任意途径施用后进入全身循环的程度和速率。活性部分的生物利用度在很大程度上由剂型的性质决定，而后者部分取决于其设计和制造。给定药物或蛋白质的制剂之间生物利用度的差异可具有临床显著性；因此，了解药物制剂是否等效是至关重要的。药物或蛋白质的生物利用度的最可靠量度是血浆浓度-时间曲线下的面积(auc)。auc与到达全身循环的未改变药物或治疗性蛋白质的总量成正比。如果药物或治疗性蛋白质的血浆浓度曲线基本上是可叠加的，则可以认为其吸收程度和速率是生物等效的。对于药物的静脉内剂量，生物利用度定义为一(unity)。对于通过其它施用途径施用的药物，生物利用度通常小于一。不完全的生物利用度可能是由于可细分为剂型效应、膜效应和施用部位效应的类别的许多因素造成的。半衰期和auc提供有关药物或生物制剂的生物
利用度的信息。
[0063]
如本文所用，如本文所用的术语“保守变异”或“保守取代”是指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基置换。保守变异或取代不可能改变肽链的形状。保守变异或取代的实例包括用另一个疏水残基置换一个疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或用另一个极性残基取代一个极性残基，如用赖氨酸取代精氨酸、用天冬氨酸取代谷氨酸、或用天冬酰胺取代谷氨酰胺。
[0064]
如本文所用，本公开的“构建体”是指包括dnase1和/或dnase1 l3多肽、或其片段、重排、(点)突变、截短、或任意其它修饰和/或类似物和/或衍生物的融合多肽。
[0065]“疾病”是动物的健康状态，其中动物无法维持体内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康状况将继续恶化。
[0066]
动物的“障碍”是一种健康状态，其中动物能够维持体内稳态，但其中与没有该障碍的情况相比，动物的健康状态不利。如果不治疗，障碍不一定会导致动物健康状况进一步下降。
[0067]
如本文所用，术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足以提供期望的生物学结果的试剂量。该结果可以是减少和/或减轻疾病的体征、症状或原因，或生物系统的任何其它期望的改变。在任何单独的情况下，本领域普通技术人员都可以采用常规实验确定适当的治疗量。
[0068]
如本文所用，术语“dnase1”是指脱氧核糖核酸酶-1(uniprotkb＝p24855)。本文提供了人dnase1的序列(seq id no:1)。在某些实施方式中，dnase1的信号肽对应于seq id no:1的残基1-22。
[0069]
seq id no:1
[0070][0071]
本文提供了小鼠dnase1的序列(seq id no:29)：
[0072]
mrytglmgtlltlvnllqlagtlriaafnirtfgetkmsnatlsvyfvkilsrydiaviqevrdshlvavgklldelnrdkpdtyryvvseplgrksykeqylfvyrpdqvsildsyqyddgcecgndtfsrepaivkffspytevqefaivplhaapteavseidalydvyldvwqkwgledimfmgdfnagcsyvtssqwssirlrtspifqwlipdsadttvtsthcaydrivvagallqaavvpnsavpfdfqaeyglsnqlaeaisdhypvevtlrki
[0073]
人dnase1(seq id no:1,如下序列'1')与小鼠dnase1(seq id no:29,如下序列'2')的序列比对如下：
[0074]
dnase1
[0075][0076][0077]
如本文所用，“人dnase1”是指本文描述的人dnase1序列，或其片段、重排、(点)突变、截短、或任意其它修饰和/或类似物和/或衍生物。如本文所用，关于dnase1的术语“酶促活性”被定义为能够结合病水解dna。
[0078]
如本文所用，术语“dnase1l3”是指脱氧核糖核酸酶γ(uniprotkb＝q13609)。本文提供了人dnase1l3的序列(seq id no:2)。在某些实施方式中，dnase1l3的信号肽对应于seq id no:2的残基1-20。在某些实施方式中，dnase1l3的核定位信号对应于seq id no:2的残基296-304。在某些实施方式中，dnase1l3的核定位信号对应于seq id no:2的残基292-304。在某些实施方式中，dnase1l3的核定位信号对应于seq id no:2的残基291-305。在某些实施方式中，dnase1l3的核定位信号对应于seq id no:2的残基a-b，其中a范围从291到296并且b范围从304到305。
[0079]
seq id no:2
[0080][0081]
本文提供了小鼠dnase1l3的序列(seq id no:30)：
[0082]
mslhpasprlaslllfilalhdtlalrlcsfnvrsfgaskkenheamdiivkiikrcdlillmeikdssnnicpmlmeklngnsrrsttynyvissrlgrntykeqyafvykeklvsvktkyhyhdyqdgdtdvfsrepfvvwfhspftavkdfvivplhttpetsvkeidelvdvytdvrsqwktenfifmgdfnagcsyvpkkawqnirlrtdpkfvwligdqedttvkkstscaydrivlcgqeivnsvvprssgvfdfqkaydlseeealdvsdhfpvefklqssraftnnrksvslkkrkkgnrs
[0083]
人dnase1l3(seq id no:2,如下序列'1')与小鼠dnase1l3(seq id no:30,如下序列'2')的序列比对如下：
[0084]
dnase1l3
[0085][0086][0087]
如本文所用，“人dnase1l3”是本文描述的人dnase1l3序列，或其片段、重排、(点)突变、截短、或任意其它修饰和/或类似物和/或衍生物。如本文所用，关于dnase1l3的术语“酶促活性”被定义为能够结合病水解dna。
[0088]
如本文所用，术语“dnase1-fc”是指与igg分子(优选人igg)的fcr结合结构域重组融合和/或化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)的dnase1多肽。在某些实施方式中，dnase1的c-末端融合或缀合至fcr结合结构域的n-末端。在某些实施方式中，dnase1的n-末端融合或缀合至fcr结合结构域的c-末端。
[0089]
如本文所用，术语“dnase1l3-fc”与igg分子(优选人igg)的fcr结合结构域重组融合和/或化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)的dnase1l3多肽。在某些实施方式中，dnase1l3的c-末端融合或缀合至fcr结合结构域的n-末端。在某些实施方式中，dnase1l3的
n-末端融合或缀合至fcr结合结构域的c-末端。
[0090]
如本文图5所示，小鼠dnase1(seq id no:42,下文'查询')与小鼠dnase1l3(seq id no:43,下文目标)的序列比对如下：
[0091]
[0092][0093]
如本文使用，术语“fc”是指人igg(免疫球蛋白)的fc结构域。考虑了将igg的亚型如igg1、igg2、igg3和igg4用作fc结构域。
[0094]
如本文所用，“fc区”是igg分子的一部分，其与通过木瓜蛋白酶消化igg分子获得的可结晶片段相关。fc区包含通过二硫键连接的igg分子的两条重链的c-末端一半。它没有抗原结合活性，但包含碳水化合物部分以及补体和fc受体(包括fcrn受体)的结合位点。fc片段包含整个第二恒定结构域ch2(根据kabat编号系统,人igg1的残基231-340)和第三恒定结构域ch3(残基341-447)。术语“igg铰链-fc区”或“铰链-fc片段”是指由fc区(残基231-447)和从fc区的n-末端延伸的铰链区(残基216-230)组成的igg分子区域。术语“恒定结构域”是指免疫球蛋白分子的一部分，其相对于该免疫球蛋白的另一部分，即含有抗原结合位点的可变结构域，具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的ch1、ch2和ch3结构域以及轻链的chl结构域。
[0095]
如本文所用，术语“fc受体”是指在某些细胞(包括b淋巴细胞、滤泡树突性细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、人血小板和肥大细胞等)表面上发现的蛋白质，其促成免疫系统的保护功能。fc受体与附接至感染细胞或入侵病原体上的抗体结合。免疫球蛋白fc受体(fcr)在所有造血细胞上均有表达，并在抗体介导的免疫反应中发挥关键作用。免疫复合物与fcr的结合使效应细胞活化，导致吞噬作用、igg-调理颗粒的内吞作用、炎症介质的释放、以及抗体依赖性细胞毒性(adcc)。已针对所有类型
的免疫球蛋白描述了fc受体：igg的fcγr和新生儿fcr(fcrn)、ige的fcεr、iga的fcαr、igd的fcδr、和igm的fcμr。除了fcrn和fcεrii以外，所有已知的fc受体在结构上均属于免疫球蛋白超家族，fcrn和fcεrii分别与i类主要组织相容性抗原和c型凝集素在结构上相关(fc receptors,neil a.fangera,et al.,in encyclopedia of immunology(第2版),1998)。
[0096]
如本文所用，术语“fcrn受体”是指新生儿fc受体(fcrn)，也称为brambell受体，它是人体内由fcgrt基因编码的蛋白质。fcrn特异性结合抗体的fc结构域。fcrn通过减少内皮细胞中的溶酶体降解来延长igg和血清白蛋白的半衰期。igg、血清白蛋白和其它血清蛋白质通过胞饮作用持续内在化。通常，血清蛋白质从内体运输到溶酶体，在那里其被降解。fcrn介导的igg跨上皮细胞的转胞吞作用是可能的，这是因为fcrn在酸性ph(《6.5)下结合igg，但在中性或更高ph下不结合。igg和血清白蛋白在弱酸性ph(《6.5)下由fcrn结合，并循环到细胞表面，在那里其在血液的中性ph(》7.0)下被释放。这样，igg和血清白蛋白避免溶酶体降解。
[0097]
igg分子的fc部分位于重链的恒定区，尤其是在ch2结构域中。fc区结合fc受体(fcrn)，fc受体是b细胞的表面受体，也是补体系统的蛋白质。igg分子的fc区与fcrn的结合活化了携带受体的细胞，并从而活化了免疫系统。已经鉴定了对小鼠fc-小鼠fcrn和人fc-人fcrn相互作用至关重要的fc残基(dall'acqua et al.,2002,j.immunol.169(9):5171-80)。fcrn结合结构域包括igg分子的ch2结构域(或其fcrn结合部分)。
[0098]
如本文所用，术语“片段”应用于核酸时是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”可以是至少约15、50-100、100-500、500-1000、1000-1500个核苷酸、1500-2500或2500个核苷酸(及其之间的任意整数值)。如本文所用，术语“片段”应用于蛋白质或肽时是指较大蛋白质或肽的子序列，且长度可以至少为约20、50、100、200、300或400个氨基酸(及其之间的任意整数值)。
[0099]
在氨基酸序列的功能衍生物的上下文中，术语“功能等效物”或“功能衍生物”是指保留与本文所示的dnase1-fc和/或dnase1l3-fc构建体的序列的生物学活性(功能或结构)基本上相似的生物学活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等效物可以是天然衍生物或合成制备的。本公开的功能等效多肽也可以是使用本领域已知的一种或多种结构和/或序列比对技术鉴定的多肽。
[0100]
示例性功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列，条件是该蛋白质的生物学活性是保守的。取代的氨基酸期望地具有与被取代的氨基酸相似的化学物理性质。期望的相似的化学物理性质包括电荷、蓬松性、疏水性、亲水性等的相似性。通常，两个多肽之间大于30％的同一性被认为是功能等效的指示。优选地，本公开的功能等效多肽与dnase1-fc和/或dnase1l3-fc构建体的序列同一性程度大于80％。更优选的多肽具有分别大于85％、90％、95％、98％或99％的同一性程度。可通过使用本领域已知的酶学测定法来确定用于确定功能等效物或功能衍生物是否具有与dnase1-fc和/或dnase1l3-fc构建体相同或相似或更高的生物学活性的方法。
[0101]“基因转移”和“基因递送”是指将具体核酸序列可靠地插入所靶向细胞的方法或系统。
[0102]“诱导型”启动子是核苷酸序列，当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才导致基因产物在细胞中产生。
[0103]
如本文所用，用于本公开内所考虑的蛋白质和/或多肽(诸如，例如，包含fcrn结合位点的dnase1和/或dnase1l3构建体)的术语“体内半衰期”是指从动物的循环和/或其它组织清除动物体内施用量一半所需的时间。当作为时间的函数来构建融合蛋白的清除率曲线时，该曲线通常是两相的，其具有极速的α相(这表示所施用的分子在血管内空间和血管外空间之间的平衡，并且部分地取决于分子的大小)和更长的β相(其表示分子在血管内空间的分解代谢)。在某些实施方式中，术语“体内半衰期”实际上对应于β相分子的半衰期。
[0104]
如本文所用的术语“指导材料”，包括在用于鉴定或减轻或治疗本文叙述的多种疾病或障碍的试剂盒中的出版物、记录、图表、或可用于传达本公开的核酸、肽、和/或化合物的有用性的任何其它表达介质。
[0105]“分离的”是指从天然状态改变或移出。例如，活体动物中天然存在的核酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同核酸或多肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。
[0106]“分离的核酸”是指与在天然存在的状态下位于其侧翼的序列分开的核酸区段或片段，即已从通常与该片段相邻的序列(即在其天然存在的基因组中与该片段相邻的序列)中移出的dna片段。该术语还适用于已从天然伴随核酸的其它组分中基本上纯化的核酸，即在细胞中天然伴随核酸的rna或dna或蛋白质。因此，该术语包括，例如，重组dna——其并入到载体(vector)、并入到自主复制的质粒或病毒，或并入到原核生物或真核生物的基因组dna中，或其独立于其它序列作为单独分子(即，作为通过pcr或限制性内切酶消化产生的cdna或基因组或cdna的片段)存在。它还包括为编码另外的多肽序列的杂交基因的一部分的重组dna。
[0107]“寡核苷酸”或“多核苷酸”是在长度上范围为至少2个，在某些实施方式中，至少为8个、15个或25个核苷酸，但可以高达50、100、1000或5000个核苷酸长度的核酸或与多核苷酸特异性杂交的化合物。
[0108]
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致后者的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常地，可操作连接的dna序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时处于同一阅读框中。
[0109]
如本文所用，术语“患者”、“个体”或“对象”是指人。
[0110]
如本文所用，术语“药物组合物”或“组合物”是指在本公开中有用的至少一种化合物与药学上可接受的载剂(carrier)的混合物。该药物组合物促进了化合物向患者的施用。本领域中存在多种施用化合物的技术，其包括但不限于皮下、静脉内、口服、气雾剂、吸入、直肠、阴道、经皮、鼻内、颊、舌下、肠胃外、鞘内、胃内、眼、肺、和局部施用。
[0111]
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指不消除化合物的生物学活性或性质并且相对无毒的材料如载剂或稀释剂，即，该材料可以被施用至个体，而不会引起不良的生物学影响或以有害的方式与组合物中所含的任何组分相互作用。
[0112]
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指药学上可接受的材料、组合物或载剂，如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材
料——其参与在患者体内或向患者体内携带或运输本公开中有用的化合物，使得化合物可以执行其预期功能。每种载剂在与制剂中其它成分，包括在本公开中有用的化合物相容的意义上必须是“可接受的”，并且对患者无害。可以用作药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物。如本文所用，“药学上可接受的载剂”还包括与本公开中有用的化合物的活性相容的任何和所有包衣、抗菌和抗真菌剂以及吸收延迟剂等，并且是患者生理上可接受的。“药学上可接受的载剂”可以进一步包括本公开中有用的化合物的药学上可接受的盐。在本公开的实践中使用的药物组合物中可能包含的其它另外的成分是本领域内已知的并且在例如remington's pharmaceutical sciences(genaro,ed.,mack publishing co.,1985,easton,pa)中进行了描述，其通过引入并入本文。
[0113]
如本文所用，语言“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸和碱包括无机酸、无机碱、有机酸、无机碱、溶剂化物、水合物、及其包合物制备的所施用的化合物的盐。
[0114]
如本文所用，术语“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体、和合成的非天然存在的其类似物组成的聚合物。
[0115]
如本文所用，术语“预防”或“防止”是指如果没有障碍或疾病发生，则没有障碍或疾病发展，或如果已经有障碍或疾病发展，则没有进一步的障碍或疾病发展。还考虑人们(one)预防与障碍或疾病有关的一些或全部症状的能力。
[0116]
如本文所用，术语“启动子”定义为被细胞的合成机器、或引入的合成机器识别的dna序列，其需要启动多核苷酸序列的特异性转录。
[0117]
如本文所用，术语“启动子/调控序列”是指表达与启动子/调控序列可操作连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，而在其它情况下，此序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其它调控元件。启动子/调控序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
[0118]
如本文所用，术语“重组多肽”定义为通过使用重组dna方法产生的多肽。
[0119]
如本文所用，术语“重组dna”定义为通过连接来自不同来源的dna段而产生的dna。
[0120]
如本文所用的“样品”或“生物样品”是指从对象分离的生物材料。生物样品可以包含适合于检测对象的生理或病理过程的mrna、多肽或其它标志物的任何生物材料，并且可以包含获自个体的流体、组织、细胞和/或非细胞材料。
[0121]
如本文所用，术语“信号肽”是指在蛋白质翻译期间结合在感兴趣的新生蛋白质的氨基末端的氨基酸残基的序列(例如，长度范围为10至30个残基)。信号肽在内质网运输后被信号识别颗粒(srp)识别并被信号肽酶切割(lodish,et al.,2000,molecular cell biology,第4版)。
[0122]
如本文所用，“基本上纯化的”是指基本上不含其它组分。例如，基本上纯化的多肽是已经与其通常以其天然存在状态缔合的其它组分分开的多肽。非限制性实施方式包括95％的纯度、99％的纯度、99.5％的纯度、99.9％的纯度和100％的纯度。
[0123]“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列：当其与基因编码或指定的多核苷酸可操作连接时，基本上仅当细胞是与启动子对应的组织类型的细胞时，才导致基因产物在细胞中产生。
[0124]
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸
处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。
[0125]
如本文所用，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞已被外源核酸转染、转化或转导。细胞包括原代对象细胞及其后代。
[0126]
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”定义为将治疗剂，即在本公开中有用的化合物(单独或与另一种药剂组合)应用或施用至患者，或将治疗剂应用或施用至来自患者的分离的组织或细胞系(例如，用于诊断或离体应用)，该患者患有疾病或障碍、或疾病或障碍的症状，目的是治愈(cure)、治愈(heal)、减轻、缓解、改变、补救、改善、改良或影响疾病或障碍、疾病或障碍的症状。基于从药物基因组学领域获得的知识，可以具体地定制或修改这样的治疗。
[0127]
如本文所用，术语“变体”是在序列上分别与参考核酸序列或肽序列不同但保留参考分子的基本性质的核酸序列或肽序列。核酸变体序列的变化可能不会改变参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可能导致氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短。肽变体序列的变化通常是有限的或保守的，使得参考肽和变体的序列总体上非常相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考肽的氨基酸序列可能差异仅在以任何组合的一个或多个取代、添加或缺失。核酸或肽的变体可以是天然存在的如等位基因变体，或者可以是未知天然存在的变体。核酸和肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
[0128]“载体”是包括分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体在本领域中都是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应解释为包括非质粒和非病毒的促进核酸转移到细胞中的化合物，诸如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
[0129]
如本文所用，术语“病毒”定义为由包裹在蛋白质包衣中的核酸(rna或dna)组成的颗粒——具有或不具有外部脂质包膜，其能够用其核酸转染细胞。
[0130]
如本文所用，术语“野生型”是指从天然存在来源分离的基因或基因产物。野生型基因在人群中最常见，并因此被任意设计为“正常”或“野生型”基因形式。相反，术语“修饰的”或“突变体”是指当与野生型基因或基因产物相比时在序列和/或功能性质(即改变的特性)上显示出改变的基因或基因产物。可以分离天然存在的突变体；通过当与野生型基因或基因产物相比时其具有改变的特性(包括改变的核酸序列)这一事实来对其进行鉴定。
[0131]
范围：在整个的本公开中，本公开的各个方面都可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式进行的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本公开范围的不灵活的限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了在该范围内的所有可能的子范围以及单个数值。例如，应将诸如1到6的范围描述视为已明确公开了子范围，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
[0132]
构建体和多肽
[0133]
一方面，本公开提供了dnase1-fc和/或dnase1l3-fc构建体。本公开考虑了本文所考虑的构建体可具有本文所述的一种或多种突变。
[0134]
此外，本公开提供了包含两个独立地选择的本公开的dnase1构建体的同型二聚体构建体。此外，本公开提供了包含两个独立地选择的本公开的dnase1l3构建体的同型二聚体构建体。此外，本公开提供了包含本公开的dnase1构建体和本公开的dnase1l3构建体的异源二聚体构建体。
[0135]
本公开提供了本文描述的构建体，以及任意糖基化变体(可选的糖形)，以及通过定点诱变或任意种类的蛋白质化学操纵修饰以具有提高的溶解性和/或酶促活性和/或体内半衰期的构建体。
[0136]
在某些实施方式中，构建体包含氨基酸序列：
[0137]
dnase1
–
x1
–
连接体-fc
–
x2
ꢀꢀ(i)[0138]
其中：
[0139]
dnase1是如本文其它部分所述的人dnase1多肽；
[0140]
x1是共价键，或x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0141]
连接体是化学键或包含1-100个氨基酸的多肽；
[0142]
x2无，或x2是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0143]
fc是如本文其它部分所述的人igg1的fc结构域。
[0144]
在某些实施方式中，(i)将构建体从左到右描述为从其n-末端到其c-末端。在这种情况下，fc的n-末端与dnase1的c-末端连接。在某些实施方式中，(i)将构建体从左到右描述为从其c-末端到其n-末端。在这种情况下，fc的c-末端与dnase1的n-末端连接。
[0145]
在某些实施方式中，多肽包含氨基酸序列：
[0146]
dnase1l3-x1-连接体-fc-x2
ꢀꢀ
(ii)
[0147]
其中：
[0148]
dnase1l3是如本文其它部分所述的人多肽dnase1l3；
[0149]
x1是共价键，或x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0150]
连接体是化学键或包含1-100个氨基酸的多肽；
[0151]
x2无，或x2是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0152]
fc是如本文其它部分所述的人igg1的fc结构域。
[0153]
在某些实施方式中，(ii)将构建体从左到右描述为从其n-末端到其c-末端。在这种情况下，fc的n-末端与dnase1l3的c-末端连接。在某些实施方式中，(ii)将构建体从左到右描述为从其c-末端到其n-末端。在这种情况下，fc的c-末端与dnase1l3的n-末端连接。
[0154]
fc:
[0155]
在某些实施方式中，人igg1的fc结构域具有以下序列：
[0156]
seq id no:4higg fc结构域，fc(人)
[0157]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0158]
在某些实施方式中，小鼠igg1的fc结构域具有以下序列：
[0159]
seq id no:31higg fc结构域，fc(小鼠)
[0160]
gckpcictvpevssvfifppkpkdvlyitlepkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk
[0161]
在某些实施方式中，关于seq id no:4的cys6(c6)突变为另一种氨基酸，诸如但不限于g或s。在某些实施方式中，关于seq id no:4的cys9(c9)突变为另一种氨基酸，诸如但不限于gly或ser。在非限制性实施方式中，负责fc结构域重链中链间二硫键的c6/c9残基的任意一种此类突变都将二聚酶融合转变为单体融合，从而允许更容易获得染色质和微粒dna。
[0162]
在某些实施方式中，higg fc结构域具有关于seq id no:4的以下突变中的至少一种：m32y、s34t和t36e。在非限制性实施方式中，任意此类突变都增强相应构建体的内体再循环。在某些实施方式中，higg fc结构域具有关于seq id no:4的以下突变：m32y、s34t和t36e。
[0163]
本公开构建体fc结构域的所考虑的关于seq id no:4的突变的非限制性列举包括c6s、c9s、m32y、s34t和/或t36e。在某些实施方式中，构建体的fc结构域包含关于seq id no:4的c6s突变。在某些实施方式中，构建体的fc结构域包含关于seq id no:4的c9s突变。在某些实施方式中，构建体的fc结构域包含关于seq id no:4的m32y突变。在某些实施方式中，构建体的fc结构域包含关于seq id no:4的s34t突变。在某些实施方式中，构建体的fc结构域包含关于seq id no:4的t36e突变。
[0164]
连接体：
[0165]
在某些实施方式中，连接体是化学键或不存在。在某些实施方式中，连接体是包含1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、和/或1-5个氨基酸。在某些实施方式中，连接体包含gly和/或ser氨基酸。
[0166]
在某些实施方式中，连接体包含gs。在某些实施方式中，连接体包含gsc。在某些实施方式中，连接体包含ggggsggggs(seq id no:5)。在某些实施方式中，连接体包含sstmvrs(seq id no:40)。在某些实施方式中，连接体包含sstmvgs(seq id no:41)。
[0167]
在某些实施方式中，连接体包含elktplgdtthtxprzpapellggp(seq id no:6)，其中x的每次出现是c、g或s，并且其中z的每次出现是c、g或s。在某些非限制性实施方式中，x和z中的至少一个不是c并且防止二硫桥的形成。在某些实施方式中，seq id no:6对应于人igg1的铰链区。
[0168]
x1和x2：
[0169]
在某些实施方式中，x1是共价键。在某些实施方式中，x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段。
[0170]
在某些实施方式中，x2是共价键。在某些实施方式中，x2是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段。
[0171]
dnase1：
[0172]
本公开的示例性构建体包含seq id no:7的氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1多肽，其中下划线序列对应于fc，并且其中斜体序列对应于连接体。
[0173]
seq id no:7
[0174][0175][0176]
在某些实施方式中，构建体具有关于seq id no:7的以下fc突变中的至少一种或多种：c290s、c293s、m316y、s318t和/或t320e。
[0177]
本公开的示例性构建体包含seq id no:8的氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1多肽，其中下划线序列对应于fc，并且其中斜体序列对应于连接体。
[0178]
seq id no:8
[0179][0180]
在某些实施方式中，构建体缺少对应于seq id no:1残基1-22的dnase1的信号肽的至少部分。在某些实施方式中，构建体缺少对应于seq id no:1残基1-22的dnase1的信号肽。
[0181]
本公开构建体dnase1结构域的所考虑的关于seq id no:1的突变的非限制性列举包括但不限于q31r、e35r、y46h、y46s、v88n、n96k、d109n、v111t、a136f、r148s、e149n、m186i、l208p、d220n、d250n、a252t、g262n、d265n、和l267t。
[0182]
在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变q31r。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变e35r。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变y46h。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变y46s。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变v88n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变n96k。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变d109n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变v111t。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变a136f。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变r148s。在某些实
施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变e149n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变m186i。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变l208p。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变d220n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变d250n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变a252t。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变g262n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变d265n。在某些实施方式中，构建体的dnase1结构域包含关于seq id no:1的突变l267t。
[0183]
在某些非限制性实施方式中，关于seq id no:1的突变a136f减少构建体的肌动蛋白结合。
[0184]
在某些非限制性实施方式中，突变e35r、y46h、y46s、r148s、e149n、m186i、l208p和/或d220n提高构建体的酶促活性。
[0185]
在某些非限制性实施方式中，突变v88n、d109n、v111t、g262n、d265n和/或l267t修饰构建体的整体糖基化状态。
[0186]
本公开的构建体的非限制性实例包括以下氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1多肽，其中下划线序列对应于fc，其中斜体序列对应于连接体，并且其中斜体/下划线顺序对应于x1/x2。某些突变显示为双下划线。
[0187]
seq id no:9
[0188][0189]
seq id no:10
[0190][0191]
[0192]
seq id no:11
[0193][0194]
seq id no:12
[0195][0196]
seq id no:13
[0197][0198][0199]
seq id no:14
[0200][0201]
其中x和z独立地是cys、gly或se。
[0202]
在某些非限制性实施方式中，其中x和z中的至少一个不是cys(c)，防止二硫桥的形成。
[0203]
seq id no:15
[0204][0205]
seq id no:16
[0206][0207]
seq id no:17
[0208][0209]
dnase1l3：
[0210]
本公开的示例性构建体包含seq id no:18的氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1l3多肽，其中下划线序列对应于fc，并且其中斜体序列对应于连接体。
[0211]
seq id no:18
[0212][0213][0214]
在某些实施方式中，构建体具有关于seq id no:18的以下fc突变中的至少一种或多种：c313s、c316s、m339y、s341t和/或342e。
[0215]
本公开的示例性构建体包含seq id no:19的氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1l3多肽，其中下划线序列对应于fc，并且其中斜体序列对应于连接体。
[0216]
seq id no:19
[0217][0218]
在某些实施方式中，构建体缺少对应于seq id no:2残基1-20的dnase1l3的信号肽的至少部分。在某些实施方式中，构建体缺少对应于seq id no:2残基1-20的dnase1l3的信号肽。
[0219]
在某些实施方式中，构建体缺少dnase1l3多肽的核定位序列(nls)的至少部分。在某些实施方式中，构建体缺少seq id no:2的残基291-305。在某些实施方式中，构建体缺少
seq id no:2的残基292-304。在某些实施方式中，构建体缺少seq id no:2的残基296-304。在某些实施方式中，构建体缺少seq id no:2的残基a-b，其中a的范围为291至296，并且b的范围为304至305。
[0220]
关于seq id no:18，本公开构建体fc结构域的所考虑的突变的非限制性列举包括c313s、c316s、m339y、s341t和/或t342e。
[0221]
关于seq id no:2，本公开构建体dnase1l3结构域的所考虑的突变的非限制性列举包括e33r、m42t、v44h、v88t、n96k、a127n、v129t、k147s、d148n、l207p、d219n、和/或v254t。
[0222]
在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变e33r。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变m42t。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变v44h。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变v88t。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变n96k。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变a127n。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变v129t。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变k147s。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变d148n。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变l207p。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变d219n。在某些实施方式中，构建体的dnaseil3结构域包含关于seq id no:2的突变v254t。
[0223]
在某些非限制性实施方式中，关于seq id no:1的突变a136f减少构建体的肌动蛋白结合。
[0224]
在某些非限制性实施方式中，关于seq id no:1的突变e33r、v44h、n96k、k147s、d148n、l207p和/或d219n提高构建体的酶促活性。
[0225]
在某些非限制性实施方式中，突变v254t修改了构建体的整体糖基化状态。
[0226]
本公开的构建体的非限制性实例包含以下氨基酸序列，其中粗体序列对应于dnase1l3多肽，其中下划线序列对应于fc，其中斜体序列对应于连接体，并且其中斜体/下划线序列对应于x1/x2。某些突变显示为双下划线。
[0227]
seq id no:20
[0228][0229]
seq id no:21
[0230][0231][0232]
seq id no:22
[0233][0234]
seq id no:23
[0235][0236]
seq id no:24
[0237][0238][0239]
其中x和z的每次出现独立地是cys、gly或se。
[0240]
在某些非限制性实施方式中，其中x和z中的至少一个不是cys(c)，防止二硫桥的形成。
[0241]
seq id no:25
[0242][0243]
其中x和z独立地是c、g或s。
[0244]
在某些非限制性实施方式中，其中x和z中的至少一个不是cys(c)，防止二硫桥的形成。
[0245]
seq id no:26
[0246][0247][0248]
seq id no:27
[0249][0250]
seq id no:28
[0251][0252]
seq id no:32(序列1171
–
小鼠dnase1构建体)
[0253][0254][0255]
seq id no:33(序列1671
–
小鼠dnase1构建体)
[0256][0257]
seq id no:34(序列1687
–
小鼠dnase1构建体)
[0258][0259]
seq id no:35(序列1689
–
小鼠dnase1构建体)
[0260]
[0261][0262]
seq id no:36(序列1584
–
小鼠dnase1l3构建体)
[0263][0264]
seq id no:37(序列1596
–
小鼠dnase1l3构建体)
[0265][0266]
seq id no:38(序列1615
–
小鼠dnase1l3构建体)
[0267][0268]
seq id no:39(序列1669
–
小鼠dnase1l3构建体)
[0269][0270]
在某些实施方式中，本公开考虑了由哺乳动物细胞系诸如但不限于cho细胞系表达的构建体，该细胞系稳定转染人st6β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶(st6beta-galactosamide alpha-2,6-sialyltransferase)(st6gal1)。在某些实施方式中，这种表达增强构建体的唾液酸化。本公开进一步提供了在补充有唾液酸和/或n-乙酰甘露糖胺(1,3,4-o-bu3mannac)的细胞培养物中生长的构建体。在某些实施方式中，这样的生长增强唾液酸对构建体的封端。
[0271]
在某些实施方式中，通过在稳定转染人α-2,6-唾液酸转移酶的cho细胞中表达生物制剂来增强蛋白质唾液酸化，当皮下给药时，大大提高了构建体的生物利用度(c
max
)。在其它实施方式中，通过操纵fc结构域增加ph依赖性fcrn介导的细胞再循环导致体内生物半衰期的提高。在又其它实施方式中，结合稳定转染人α-2,6-唾液酸转移酶的cho细胞并使该细胞在n-乙酰甘露糖胺中生长导致半衰期和/或生物暴露(auc)的大幅增加。在又其它实施方式中，将本文所述的两种或更多种方法组合成单个构建体导致半衰期和/或生物暴露(auc)的大幅增加。
[0272]
在某些实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的构建体被更高度地糖基化。在其它实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的多肽具有对新生儿孤儿受体(fcrn)更高的亲和力。在又其它实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的构建体具有更长的体内半衰期。在又其它实施方式中，与本领域中描述的dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的
构建体的体内半衰期至少高约1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20倍。在又其它实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的构建体以更低的剂量和/或更低的频率向对象施用。在又其它实施方式中，本公开的构建体每月一次、每月两次、每月三次、和/或每月四次向对象施用。在又其它实施方式中，与本领域中其它dnase1和/或dnase1l3构建体相比，本公开的构建体的较低频率施用导致更好的患者依从性和/或提高的功效。
[0273]
在某些实施方式中，构建体是可溶的。在其它实施方式中，构建体是重组多肽。
[0274]
在某些实施方式中，构建体包含导致dnase1和/或dnase1l3多肽的前体分泌的信号肽，该前体经历蛋白水解处理以产生经处理的包含dnase1和/或dnase1l3多肽的构建体。
[0275]
在某些实施方式中，dnase1和/或dnase1l3多肽在c-末端融合至人免疫球蛋白1(igg1)、人免疫球蛋白2(igg2)、人免疫球蛋白3(igg3)、和/或人免疫球蛋白4(igg4)的fc结构域。在其它实施方式中，dnase1和/或dnase1l3多肽在n-末端融合至人免疫球蛋白1(igg1)、人免疫球蛋白2(igg2)、人免疫球蛋白3(igg3)、和/或人免疫球蛋白4(igg4)的fc结构域。在又其它实施方式中，igfc结构域的存在提高了半衰期、溶解度、降低了免疫原性，并提高了dnase1和/或dnase1l3多肽的活性。
[0276]
在某些实施方式中，dnase1和/或dnase1l3多肽在c-末端融合至人血清白蛋白。人血清白蛋白可通过化学连接体包括但不限于天然存在的或工程改造的二硫键与dnase1和/或dnase1l3蛋白缀合，和/或通过与dnase1和/或dnase1l3、和/或其片段和/或变体的遗传融合来与dnase1和/或dnase1l3蛋白缀合。
[0277]
在某些实施方式中，构建体被进一步聚乙二醇化(即与聚(乙二醇)链融合)。
[0278]
在某些实施方式中，构建体被配制成液体制剂。在其它实施方式中，本公开提供了药物组合物的干燥产物形式，其包含治疗量的本公开的构建体，借此该干燥产物可重构为液体形式的构建体的溶液。
[0279]
本公开提供了试剂盒，其包含本公开的至少一种构建体，和/或其盐或溶剂化物，以及在本公开的方法中使用构建体的说明书。
[0280]
应当理解，根据本公开的dnase1和/或dnase1l3多肽不仅包括天然人蛋白质，而且还包括其任意片段、衍生物、融合体、缀合物或突变体。如此处在本公开中所用的，短语“dnase1和/或dnase1l3多肽、其突变体、和/或突变体片段”还包括包含dnase1和/或dnase1l3多肽、其突变体、和/或突变体片段的任意化合物或多肽(诸如但不限于融合蛋白)。根据本公开的融合蛋白被认为是dnase1和/或dnase1l3的生物等效物，但在某些实施方式中由于体内生物暴露增加(如通过“曲线下面积”(auc)或在药代动力学实验中半衰期增加判断的)而能够提供更长的半衰期或更大的效力。
[0281]
载体和细胞
[0282]
本公开进一步提供了包含编码本公开多肽的重组核酸的自主复制或整合的哺乳动物细胞载体。在某些实施方式中，载体包含质粒或病毒。在其它实施方式中，载体包含哺乳动物细胞表达载体。在又其它实施方式中，载体进一步包含至少一种指导和/或控制多肽表达的核酸序列。在又其它实施方式中，重组核酸编码包括dnase1和/或dnase1l3多肽和信号肽的多肽，其中该多肽在从细胞分泌后经过蛋白水解处理以产生本公开的dnase1和/或dnase1l3构建体。
[0283]
在又一方面中，本公开提供了包含本公开载体的分离的宿主细胞。在某些实施方式中，细胞是非人细胞。在其它实施方式中，细胞是哺乳动物的。在又其它实施方式中，本公开的载体包括编码包含dnase1和/或dnase1l3多肽和信号肽的构建体的重组核酸。在又其它实施方式中，多肽在从细胞分泌后经过蛋白水解处理以产生本公开的dnase1和/或dnase1l3构建体。
[0284]
dnase1和/或dnase1l3融合蛋白的产生和纯化
[0285]
在某些实施方式中，可溶的dnase1和/或dnase1l3构建体——包括igg fc结构域或其酶促活性/生物活性片段，可有效治疗、减少、和/或预防本文所考虑的疾病或障碍的进展。
[0286]
为了产生可溶的重组dnase1和/或dnase1l3构建体以供体外使用，将dnase1和/或dnase1l3多肽与igg的fc结构域融合(称为“dnase1-fc”和/或”dnase1l3-fc”)，并且融合蛋白在稳定的cho细胞系中表达。使用适合的载体，也可以由hek293细胞、杆状病毒昆虫细胞系统或cho细胞或毕赤酵母表达系统表达蛋白质。蛋白质可以在贴壁细胞或悬浮细胞中产生。为了建立稳定的细胞系，将编码dnase1和/或dnase1l3构建体的核酸序列克隆到用于大规模产生蛋白质的适当载体中。
[0287]
已知许多表达系统可用于产生dnase1和/或dnase1l3构建体，包括细菌(例如大肠杆菌(e.coli)和枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis))、酵母(例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(kluyveronmyces lactis)和巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris))、丝状真菌(例如曲霉(aspergillus))、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。所期望的蛋白质可以以常规方式产生，例如由插入宿主染色体中或游离质粒上的编码序列产生。
[0288]
可以用任何通常的方式例如电穿孔，用所期望的蛋白质的编码序列转化酵母。通过电穿孔转化酵母的方法在becker和guarente,1990,methods enzymol.194:182中公开。成功转化的细胞，即含有本公开dna构建体的细胞，可以通过公知的技术进行鉴定。例如，引入表达构建体所产生的细胞可以生长以产生所期望的多肽。可以收获细胞并进行裂解，并使用诸如southern,1975,j.mol.biol.98:503和/或berent et al.,1985,biotech 3:208中描述的方法检查细胞的dna含量，以检测dna的存在。可选地，可以使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。
[0289]
有用的酵母质粒载体包括prs403—406和prs413—416，并且通常可从strat:1.gene cloning systems,la jolla,ca,usa获得。质粒prs403、prs404、prs405和prs406是酵母整合质粒(y1p)，并且并入了酵母选择性标记i-11s3、trp1、leu2和ijra3。质粒prs413—416是酵母着丝粒质粒(ycp)。
[0290]
已经开发了多种方法来通过互补的粘性末端将dna与载体有效连接。例如，可以将互补的均聚物束(homopolymer tract)添加到dna区段中以插入到载体dna中。然后通过互补的均聚物尾之间的氢键将载体和dna区段连接起来以形成重组dna分子。
[0291]
含有一个或多个限制性位点的合成连接体提供了将dna区段连接到载体的可选的方法。通过内切核酸酶限制性消化产生的dna区段用噬菌体t4 dna聚合酶或大肠杆菌dna聚合酶i处理，这些酶是去除具有3'-5'-外切核酸酶活性的突出的3'-单链末端，并利用其聚合活性填充凹入的3'-末端的酶。
[0292]
这些活性的组合因此产生了平端dna区段。然后在能够催化平端dna分子的连接的酶如噬菌体t4 dna连接酶的存在下将平端区段与大量摩尔过量的连接体分子一起孵育。因此，反应的产物是在其末端携带聚合连接体序列的dna区段。这些dna区段随后用适当的限制性内切酶裂解并连接至表达载体，该表达载体已被产生与dna区段末端相容的末端的酶裂解。
[0293]
然后建立单个稳定转染的细胞的克隆并筛选期望的融合蛋白的高表达克隆。可在96孔板中以高通量方式完成dnase1和/或dnase1l3蛋白表达的单细胞克隆的筛选。通过筛选鉴定出高表达克隆后，蛋白质的产生可在摇瓶或生物反应器中完成。
[0294]
dnase1和/或dnase1l3构建体的纯化可利用本领域已知的标准纯化技术的组合来完成。
[0295]
基因疗法
[0296]
编码本公开中有用的多肽(一种或多种)的核酸可用于治疗本文所考虑的疾病或障碍的基因疗法方案。可将经改进的编码多肽(一种或多种)的构建体插入合适的基因疗法载体并施用于患者以治疗或预防感兴趣的疾病或障碍。
[0297]
载体如病毒载体已在现有技术中用于将基因导入多种不同的靶细胞。通常将载体暴露于靶细胞，使得转化可以在足够比例的细胞中发生，以从所期望的多肽(例如，受体)的表达提供有用的治疗或预防效果。转染的核酸可永久地并入每个所靶向的细胞的基因组中，从而提供持久的效果，或者可选地治疗可能必须定期重复。在某些实施方式中，(病毒)载体用编码本公开的多肽(一种或多种)的遗传物质在体内转染肝细胞。
[0298]
多种载体——病毒载体和质粒载体二者都是本领域已知的(参见例如美国专利号5,252,479和wo 93/07282)。具体地，许多病毒已被用作基因转移载体，包括乳多空病毒如sv40、牛痘病毒、疱疹病毒包括hsv和ebv、以及逆转录病毒。现有技术中的许多基因疗法方案已经使用失能的鼠逆转录病毒。最近授权的几项专利涉及用于执行基因疗法的方法和组合物(参见例如美国专利号6,168,916；6,135,976；5,965,541和6,129,705)。前述专利中的每一个均通过引用以其整体并入本文。
[0299]
aav-介导的基因疗法：
[0300]
aav是属于依赖病毒属的细小病毒，其具有使其特别适合基因疗法应用的数个特征。例如，aav可以感染多种宿主细胞，包括非分裂细胞。此外，aav可以感染来自多种物种的细胞。重要的是，aav与任何人或动物疾病无关，并且在整合后似乎不会改变宿主细胞的生理性质。最后，aav在广泛的物理和化学条件下稳定，这使其适合生产、存储和运输要求。
[0301]
aav基因组是线性单链dna分子，其含有大约4,700个核苷酸(aav-2基因组由4,681个核苷酸组成，aav-4基因组由4,767个核苷酸组成)，通常包含内部非重复区段，每端侧接反向末端重复序列(itr)。itr的长度约为145个核苷酸(aav-1的itr为143个核苷酸)，并具有多种功能，包括作为复制起点和作为病毒基因组的包装信号。
[0302]
基因组的内部非重复部分包括两个大的开放阅读框(orf)，称为aav复制(rep)和衣壳(cap)区域。这些orf编码复制和衣壳基因产物，允许复制、组装、和包装完整的aav病毒粒子。更具体地，从aav rep区域表达至少四种病毒蛋白的家族：rep 78、rep 68、rep 52和rep 40，所有这些均以其表观分子量命名。aav cap区域编码至少三种蛋白质：vp1、vp2和vp3。
[0303]
aav是一种辅助依赖型病毒，也就是说，它需要与辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)共感染以便形成功能完整的aav病毒粒子。在不与辅助病毒共感染的情况下，aav建立潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体或以游离基因形式存在，但不会产生感染性病毒粒子。随后辅助病毒的感染“挽救”整合的基因组，使其能够复制并包装到病毒衣壳中，从而重构感染性病毒粒子。虽然aav可以感染来自不同物种的细胞，但辅助病毒必须与宿主细胞属于同一物种。因此，例如，人aav在已与犬腺病毒共感染的犬细胞中复制。
[0304]
为了产生含有异源核酸序列的感染性重组aav(raav)，可用含有异源核酸序列但缺乏aav辅助功能基因rep和cap的aav载体转染合适的宿主细胞系。然后可以在单独的载体上提供aav辅助功能基因。此外，载体上只能提供aav产生所需的辅助病毒基因(即辅助功能基因)，而不提供具有复制能力的辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)。
[0305]
总的来说，可以在一个或多个载体上提供aav辅助功能基因(即，rep和cap)和附属功能基因。然后可以在宿主细胞中表达辅助和附属功能基因产物，其中它们将反式作用于含有异源核酸序列的raav载体上。然后将含有异源核酸序列的raav载体复制和包装，就如同它是野生型(wt)aav基因组一样，形成重组病毒粒子。当患者的细胞所得的raav病毒粒子感染时，异源核酸序列进入患者细胞并在其中表达。由于患者的细胞缺乏rep和cap基因以及附属功能基因，因此raav无法进一步复制和包装它们的基因组。此外，在没有rep和cap基因源的情况下，wtaav无法在患者的细胞中形成。
[0306]
有11种已知的aav血清型，aav-1到aav-11(mori,et al.,2004,virology 330(2):375-83)。aav-2是人群中最普遍的血清型；一项研究估计，至少80％的普通人群已经感染了wt aav-2(berns and linden,1995,bioessays 17:237-245)。aav-3和aav-5在人群中也很普遍，感染率高达60％(georg-fries,et al.,1984,virology 134:64-71)。aav-1和aav-4是猿猴分离株，但这两种血清型都可以转导人类细胞(chiorini,et al.,1997,j virol71:6823-6833；chou,et al.,2000,mol ther 2:619-623)。在六种已知的血清型中，最好地表征了aav-2。例如，aav-2已被用于一系列广泛的体内转导实验，并已显示转导许多不同的组织类型，包括：小鼠(美国专利号5,858,351；美国专利号6,093,392)，狗肌肉；小鼠肝脏(couto,et al.,1999,proc.natl.acad.sci.usa96:12725-12730；couto,et al.,1997,j.virol.73:5438-5447；nakai,et al.,1999,j.virol.73:5438-5447；和snyder,et al.,1997,nat.genet.16:270-276)；小鼠心脏(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa 97:13801-13806)；兔肺(flotte,et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:10613-10617)；和啮齿动物光受体(flannery et al.,1997,proc.natl.acad.sci.usa 94:6916-6921)。
[0307]
aav-2的广泛组织趋向性可用于递送组织特异性转基因。例如，aav-2载体已被用于递送以下基因：将囊性纤维化跨膜传导调节基因递送到兔肺(flotte,et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:10613-10617)；将factor niii基因(burton,et al.,1999,proc.natl.acad.sci.usa 96:12725-12730)和因子ix基因(nakai,et al.,1999,j.virol.73:5438-5447；snyder,et al.,1997,nat.genet.16:270-276；美国专利号.6,093,392)递送到小鼠肝脏、狗和小鼠肌肉(美国专利号6,093,392)；将促红细胞生成素基因递送到小鼠肌肉(美国专利号5,858,351)；将血管内皮生长因子(vegf)基因递送到小鼠心脏(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa 97:13801-13806)；和将芳族1-氨基酸脱羧
酶基因(aromatic 1-amino acid decarboxylase gene)递送到猴神经元。某些raav递送的转基因的表达在实验室动物中具有治疗作用；例如，据报道因子ix的表达在血友病b的狗模型中恢复表型正常性(美国专利号6,093,392)。此外，向小鼠心肌的raav递送的negf的表达导致新生血管形成(su,et al.,2000,proc.natl.acad.sci.usa 97:13801-13806)，而向帕金森病猴大脑的raav递送的aadc的表达导致多巴胺能功能的恢复。
[0308]
将感兴趣的蛋白质递送至哺乳动物的细胞是通过首先产生包含编码感兴趣的蛋白质的dna的aav载体，然后将该载体施用于哺乳动物来实现的。因此，本公开应被解释为包含含有编码感兴趣的多肽(一种或多种)的dna的aav载体。一旦掌握了本公开，包含编码这种/这些多肽的dna的aav载体的产生对于技术人员来说将是显而易见的。
[0309]
在某些实施方式中，本公开的raav载体包括几个必需的dna元件。在某些实施方式中，这些dna元件包括至少两个拷贝的aav itr序列、启动子/增强子元件、转录终止信号、任何必要的5'或3'非翻译区——其位于编码感兴趣的蛋白质的dna或其生物活性片段的侧翼。本公开的raav载体还可包含感兴趣的蛋白质的内含子的一部分。此外，任选地，本公开的raav载体包含编码感兴趣的突变多肽的dna。
[0310]
在某些实施方式中，载体包含启动子/调控序列，该启动子/调控序列包括能够驱动异源基因在许多不同细胞类型中以高水平表达的混杂启动子。此类启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)即刻早期启动子/增强子序列、劳斯肉瘤病毒启动子/增强子序列等。在某些实施方式中，本公开的raav载体中的启动子/调控序列是cmv即刻早期启动子/增强子。然而，用于驱动异源基因表达的启动子序列也可以是诱导型启动子，例如但不限于类固醇诱导型启动子，或者可以是组织特异性启动子，诸如但不限于肌肉组织特异性的骨骼α-肌动蛋白启动子和肌肉肌酸激酶启动子/增强子等。
[0311]
在某些实施方式中，本公开的raav载体包括转录终止信号。虽然本公开的载体中可以包括任何转录终止信号，但在某些实施方式中，转录终止信号是sv40转录终止信号。
[0312]
在某些实施方式中，本公开的raav载体包括编码感兴趣的多肽或感兴趣的多肽的生物活性片段的分离的dna。本公开应被解释为包括感兴趣的多肽的任何哺乳动物序列，其是已知的或未知的。因此，本公开应被解释为包括来自除人之外的哺乳动物的基因，其多肽以与人多肽基本相似的方式发挥功能。优选地，包括编码感兴趣的多肽的基因的核苷酸序列与编码感兴趣的多肽的基因约50％同源，更优选约70％同源，甚至更优选约80％同源，最优选约90％同源。
[0313]
此外，本公开应被解释为包括野生型蛋白质序列的天然存在的变体或重组衍生的突变体，这些变体或突变体使得由此编码的多肽在本公开的基因疗法方法中与全长多肽在治疗上一样有效，或者甚至比全长多肽在治疗上更有效。
[0314]
本公开还应被解释为包括保留多肽生物活性的dna编码变体。此类变体包括已经或可以使用重组dna技术修饰的蛋白质或多肽，使得蛋白质或多肽具有增强其在本文所述方法中使用的适用性的另外的性质，例如但不限于赋予血浆中蛋白质稳定性增强和蛋白质比活性增强的变体。类似物可以通过保守的氨基酸序列差异或通过不影响序列的修饰或通过两者而与天然存在的蛋白质或肽不同。例如，可以进行保守的氨基酸改变，虽然它们改变了蛋白质或肽的一级序列，但通常不会改变其功能。
[0315]
本公开不限于实验实施例中示例的具体raav载体；确切地说，本公开应当被解释
为包括任何合适的aav载体，包括但不限于基于aav-1、aav-3、aav-4和aav-6等的载体。
[0316]
本公开还包括以有效提供治疗效果的量治疗患有疾病或障碍的哺乳动物的方法。该方法包括向哺乳动物施用编码感兴趣的多肽的raav载体。优选地，哺乳动物是人。
[0317]
通常，在单次注射中施用的病毒载体基因组的数量/哺乳动物在约1
×
108至约5
×
10
16
的范围内。优选地，单次注射中施用的病毒载体基因组的数量/哺乳动物为约1
×
10
10
至约1
×
10
15
；更优选地，单次注射中施用的病毒载体基因组的数量/哺乳动物为约5
×
10
10
至约5
×
10
15
；以及最优选地，在单次注射中施用的病毒载体基因组的数量/哺乳动物为约5
×
10
11
至约5
×
10
14
。
[0318]
当本公开的方法包括多位点同时注射，或包括在数小时(例如，从约少于一小时至约两或三小时)的时间段内注射到不同位点的数次多位点注射时，施用的病毒基因组的总数可与单位点注射方法中叙述的相同，或是其分数或是其倍数。
[0319]
为了以单位点注射施用本公开的raav载体，在某些实施方式中，将包含病毒的组合物直接注射到对象的器官(诸如但不限于对象的肝脏)中。
[0320]
为了施用于哺乳动物，可以将raav载体悬浮在药学上可接受的载剂中，例如ph为约7.8的hepes缓冲盐水中。其它有用的药学上可接受的载剂包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它药学上可接受的盐溶液如磷酸盐和有机酸的盐。这些和其它药学上可接受的载剂的实例描述于remington’s pharmaceutical sciences(1991,mack publication co.,new jersey)中。
[0321]
本公开的raav载体也可以以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括，例如，在干燥盐制剂中的载体的冻干制剂、用于悬浮载体/盐组合物的无菌水和用于悬浮载体并将其施用至哺乳动物的说明书。
[0322]
方法
[0323]
本公开包括治疗、改善、和/或预防与dnase1l3缺陷相关的狼疮形式(包括sle)的方法。
[0324]
本公开包括治疗、改善、和/或预防与低效net水解(“netolysis”)相关的疾病和/或障碍的方法。
[0325]
本公开包括治疗、改善、和/或预防自身免疫性障碍。在某些实施方式中，自身免疫性障碍包括狼疮(包括sle)、甲状腺自身免疫性疾病、和/或低补体血症荨麻疹性血管炎综合征(huvs)。
[0326]
本公开包括用于治疗、改善、和/或预防病理性血栓形成，诸如但不限于微血管血栓形成、静脉血栓形成、和/或动脉血栓形成。在某些实施方式中，病理性血栓形成包括中性粒细胞血栓形成，其包括但不限于抗中性粒细胞胞浆自身抗体(anca)血管炎、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、和白塞(或贝赫切特)病或综合征。在某些实施方式中，病理性血栓形成包括导致中风的血栓形成。
[0327]
本公开包括治疗、改善、和/或预防心肌梗塞的方法。
[0328]
本公开包括治疗、改善、和/或预防癌症的扩散和进展(例如，癌症转移)的方法。
[0329]
在某些实施方式中，方法包括向患有、疑似患有、和/或可能发展本文考虑的任意疾病或障碍的对象施用本公开的构建体。
[0330]
在某些实施方式中，本公开的构建体是在哺乳动物细胞中表达的dnase1和/或
dnase1l3前体构建体(其本身是在本公开内所考虑的构建体)的分泌产物。在其它实施方式中，dnase1和/或dnase1l3前体构建体包含信号肽序列和dnase1和/或dnase1l3多肽，其中dnase1和/或dnase1l3前体构建体经历蛋白水解处理成经处理的包含dnase1和/或dnase1l3多肽的构建体。在又其它实施方式中，在dnase1和/或dnase1l3前体构建体中，信号肽序列与dnase1和/或dnase1l3多肽n-末端缀合。在蛋白水解后，信号序列从dnase1和/或dnase1l3前体构建体上裂解以提供包含dnase1和/或dnase1l3多肽的构建体。
[0331]
在某些实施方式中，急性地或长期地向对象施用多肽。在其它实施方式中，局部地、区域地、肠胃外地或全身地向对象施用多肽。
[0332]
在某些实施方式中，对象是哺乳动物。在其它实施方式中，哺乳动物是人。
[0333]
在某些实施方式中，通过选自以下的至少一种途径施用构建体和/或其前体构建体：皮下、口服、气雾剂、吸入、直肠、阴道、经皮、皮下、鼻内、颊、舌下、肠胃外、鞘内、胃内、眼、肺和局部。在其它实施方式中，构建体和/或其前体构建体作为药物组合物向对象施用，该药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂。
[0334]
在某些实施方式中，急性地或长期地向对象施用构建体和/或其前体构建体。在其它实施方式中，局部地、区域地或全身地向对象施用构建体和/或其前体构建体。在又另一个实施方式中，构建体和/或其前体构建体在编码的载体上递送，其中该载体编码蛋白质并在将该载体施用于对象后，其从载体转录并翻译。
[0335]
本领域的技术人员将理解，当掌握了包括本文详述的方法的本公开内容时，本公开不限于在确立疾病或障碍后对其的治疗。具体地，疾病或障碍的症状不必表现出至对对象危害的点；实际上，在施用治疗之前不需要在对象中检测到疾病或障碍。也就是说，在本公开可以提供益处之前，不必发生疾病或障碍的显著病理学。
[0336]
因此，如本文更充分描述的，本公开包括用于预防对象中的疾病和障碍的方法，其中如本文其它部分所讨论的，本公开的多肽或构建体可在疾病或障碍发作之前向对象施用，从而预防疾病或障碍发展。具体地，当疾病或障碍的症状尚未表现出至对对象危害的点时；实际上，在施用治疗之前不需要在对象中检测到疾病或障碍。也就是说，在本公开可以提供益处之前，不必发生疾病或障碍的显著病理学。因此，本公开包括用于对象中疾病或障碍的预防或延迟发作，或减少其进展或生长的方法，因为可以在检测到疾病或障碍之前向对象施用本公开的多肽。在某些实施方式中，对具有强烈的疾病或障碍家族病史的对象施用本公开的多肽，从而预防或延迟疾病或障碍的发作或进展。
[0337]
掌握了本文的公开内容，本领域技术人员将因此理解，预防对象的疾病或障碍包括向对象施用本公开的多肽作为针对疾病或障碍的预防措施。
[0338]
药物组合物和制剂
[0339]
本公开在本文所述方法内提供包含本公开的多肽的药物组合物。
[0340]
这样的药物组合物是适合于向对象施用的形式，或者药物组合物可进一步包含一种或多种药学上可接受的载剂、一种或多种其它成分、和/或这些的某种组合。如本领域公知的，药物组合物的多种组分可以以生理上可接受的盐的形式存在，如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合。
[0341]
在一个实施方式中，可以施用用于实践本公开的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天和100mg/kg/天之间的剂量。在其它实施方式中，可以施用用于实践本公开的药物组
合物以递送1ng/kg/天和500mg/kg/天之间的剂量。
[0342]
本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载剂、和任何其它成分的相对量将变化，这取决于所治疗对象的身份、大小、和状况，并进一步取决于药物组合物施用的途径。例如，组合物可包含约0.1％和约100％(w/w)之间的活性成分。
[0343]
在本公开的方法中有用的药物组合物可以适当地开发用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、经皮、肺、鼻内、颊、眼、鞘内、静脉内或其它施用途径。其它考虑的制剂包括经设计的(projected)纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞、和基于免疫学的制剂。施用途径(一种或多种)对普通技术人员而言是显而易见的，并且取决于许多因素，包括所治疗疾病的类型和严重度、所治疗的兽类或人类患者的类型和年龄等。
[0344]
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任意方法来制备。通常地，这种制备方法包括使活性成分与载剂或一种或多种其它辅料成分缔合的步骤，然后如有必要或期望，将产品成型或包装成所期望的单剂量或多剂量单位。
[0345]
如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常等于将被施用于对象的活性成分的剂量或该剂量的方便分数，诸如，例如该剂量的一半或三分之一。单位剂型可以是单次日剂量，或多次日剂量之一(例如，每天约1至4次或更多次)。当使用多次日剂量时，对于每个剂量的单位剂型可以相同或不同。
[0346]
施用/给药
[0347]
施用方案可能会影响有效量的构成。例如，可以每天或依次施用数个分剂量以及交错剂量，或可以连续输注剂量，或也可以是弹丸注射。此外，如在治疗或预防情况的紧急情况下所指示的，治疗制剂的剂量可以成比例地增加或减少。
[0348]
本公开的组合物向患者如哺乳动物——如人——施用可以使用已知的程序、以有效治疗患者疾病或障碍的剂量和时间段进行。达到治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可根据多种因素而变化，如所用具体化合物的活性；施用的时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与化合物组合使用的其它药物、化合物或材料；疾病或障碍的状态，所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域公知的类似因素。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。剂量根据治疗化合物的生物活性确定，而生物学活性又取决于治疗化合物曲线的半衰期和血浆时间下的面积。根据本公开的多肽可以以每2天、或每4天、或每周或每月的适当时间间隔进行施用。还可以基于半衰期或从体内清除治疗多肽的速率来确定本公开的多肽的治疗剂量。根据本公开的多肽以每2天、或每4天、每周或每月的适当时间间隔施用，以实现dnase1和/或dnase1l3的酶促活性的恒定水平。
[0349]
例如，可以每天施用数个分剂量或可以根据治疗情况的紧急程度的指示成比例地减少剂量。本公开的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约0.01至50mg/kg体重/天。在某些实施方式中，本公开的治疗化合物的有效剂量范围为约50ng至500ng/kg体重，优选为100ng至300ng/kg体重。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并确定治疗化合物的有效量而无需过多的实验。
[0350]
化合物可以以每天数次频繁地向患者施用，或者可以较不频繁地施用，如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、或甚至更少频率地，如每几个月一次或者甚至一年一次或更少。应当理解，在非限制性实例中，每天给药的化合物的量可以以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天、或每5天施用。例如，在每隔一天施用的情况下，可以在周一开始每天5mg
01/32217、wo 98/55107、wo 98/11879、wo 97/47285、wo 93/18755和wo 90/11757中描述的剂型。
[0362]
控释制剂和药物递送系统
[0363]
可以使用常规技术制备本公开药物组合物的控释或缓释制剂。在某些情况下，所使用的剂型可以以一种或多种活性成分的缓慢或受控释放提供，使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、或微球或其组合，以提供以不同比例的所期望的释放曲线(特征，profile)。本公开涵盖了适合于口服施用的适于控制释放的单次单位剂型，如片剂、胶囊剂、囊性片、和囊片。
[0364]
在某些实施方式中，本公开的制剂可以是但不限于短期、快速补偿(rapid-offset)、以及受控的，例如，持续释放、延迟释放和脉冲式释放的制剂。
[0365]
术语缓释在其常规意义上是指可在延长的时间段内提供逐渐药物释放的药物制剂，尽管不一定，但其可能导致药物血液水平在延长的时间段内基本恒定。该时间段可能长达一个月或更长时间，并且应该是比以弹丸形式施用的相同量的剂更长的释放。为了缓释，可将化合物与为化合物提供缓释性质的合适的聚合物或疏水性材料一起制备。因此，使用本公开方法的化合物可以以微粒形式(例如，通过注射)或以圆片或圆盘形式(通过植入)施用。在本公开的某些实施方式中，使用缓释制剂将本公开的化合物单独或与另一种药剂组合向患者施用。
[0366]
术语延迟释放在本文中以其常规含义使用，是指在药物施用后的一定延迟之后提供药物的初始释放的药物制剂，尽管不一定，但其包括约10分钟到多至约12小时的延迟。术语脉冲式释放在本文中以其常规含义使用，是指以药物施用后产生药物脉冲的血浆曲线的方式提供药物释放的药物制剂。术语立即释放在本文中以其常规含义使用，是指在药物施用后立即提供药物释放的药物制剂。
[0367]
如本文所用，短期是指在药物施用后多至并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟、或约10分钟的任意时间段及药物施用后其任意或所有全部或部分增量。
[0368]
如本文所用，快速补偿是指在药物施用后多至并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟、或约10分钟的任意时间段及其任意或所有全部或部分增量。
[0369]
仅使用常规实验，本领域普通技术人员将认识到或能够确定本文所述的具体程序、实施方式、权利要求、和实例的许多等效物。这些等效物被视为在本公开的范围内并且被所附权利要求书覆盖。例如，应当理解，对反应和制备条件的修改——利用本领域公认的可选方案和仅使用常规实验，都在本技术的范围内。
[0370]
应当理解，无论本文在何处提供数值和范围，这些数值和范围所涵盖的所有数值和范围均应涵盖在本公开的范围内。此外，所有落入这些范围内的数值以及值范围的上限或下限也在本技术的考虑中。
[0371]
以下实施例进一步说明了本公开的各个方面。然而，它们决不是对如本文所述的本公开的教导或公开内容的限制。
[0372]
实施例
[0373]
现在参考以下实施例描述本公开。提供这些实施例仅出于示例目的，而本公开不
限于这些实施例，而是涵盖由于本文提供的教导而显而易见的所有变型。
[0374]
方法和材料
[0375]
除非具体提及，否则可以使用本文其它部分描述或现有技术已知的方案来执行在有或没有补充的情况下构建体在cho细胞或修饰的cho细胞中的表达、酶促测定、auc测定、半衰期测定。
[0376]
曲线下面积测定
[0377]
血浆浓度对时间曲线下的面积，也称为曲线下面积(auc)，可用作评估用于血管外药物递送的分布体积(v)、总消除清除率(cl)、和生物利用度(f)的手段。使用标准等式执行每个表达和纯化的dnase1-fc和/或dnase1l3-fc构建体的血浆时间曲线下面积，以测定单次皮下注射生物制剂后的半衰期和生物利用度，如等式1所述。
[0378]
半衰期测定
[0379]
药物半衰期(t
1/2
)是血浆浓度或体内药物或生物制剂的量减少50％所花费的时间。按照现有技术和/或本文描述的方案，如等式1，执行每个表达和纯化的构建体的半衰期值，所述方案允许在单次皮下注射生物制剂后测定半衰期和生物利用度。
[0380]
可用等式1计算药物半衰期，该等式将单次注射施用到皮下贮存的药物的全身分数浓度与时间之间的关系相关联。将数据绘制为吸收的药物分数(f)随时间(t)的变化，允许通过将数据拟合为在时间t＝0时在皮下贮存处施用的药物的总全身吸收等式来确定消除常数(ke)和吸收常数(ka)。
[0381][0382]
实施例
[0383]
图1示例了中性粒细胞胞外陷阱(net)的形成。扫描电子显微镜下中性粒细胞(标记为a)投射网(标记为b)而捕获幽门螺杆菌(其中一些标记为c)。图片取自kumamoto t,et al.,2006,eur heart j.27(17):2081-7。
[0384]
图2示例了本公开的非限制性dnase1-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0385]
图3示例了本公开的非限制性dnase1l3-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0386]
图4示例了本公开的非限制性dnase1-fc构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。
[0387]
图5示例了本公开的非限制性构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。在某些实施方式中，某些突变使rdnase过兴奋和/或使rdnase抗肌动蛋白(即对肌动蛋白亲和力降低)和/或增加构建体的半衰期。
[0388]
图6示例了本公开的非限制性构建体，其中突出显示了某些考虑的点突变。在某些实施方式中，构建体缺少至少部分dnase1l3核定位结构域。
[0389]
图7示例了指示出某些dnase1l3克隆切割染色质的凝胶，但某些dnase1克隆并非如此。
[0390]
图8示例了本公开的非限制性构建体。在某些实施方式中，dnase1多肽与dnase1l3的c-末端尾部融合。
[0391]
图9示例了dnase-fc构建体的产生和纯化的某些方面。
[0392]
图10a-10b示例了本公开的某些net降解构建体的体内药效动力学。
[0393]
图11示例了本公开的某些net降解构建体的非限制性纯化凝胶。
[0394]
列举的实施方式：
[0395]
提供了以下示例性实施方式，其编号不应解释为指定重要性等级。
[0396]
实施方式1提供了构建体，其包含氨基酸序列：
[0397]
dnase1
–
x1
–
连接体-fc
–
x2
ꢀꢀ(i)[0398]
其中：
[0399]
dnase1是人dnase1多肽；
[0400]
x1是共价键，或x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0401]
连接体是化学键或包含1-100个氨基酸的多肽；
[0402]
x2无，或x2是氨基酸序列seq id no:3的肽或其片段；
[0403]
fc是人igg1的fc结构域。
[0404]
实施方式1提供了构建体，其包含氨基酸序列：
[0405]
dnase1l3-x1-连接体-fc-x2
ꢀꢀ
(ii)
[0406]
其中：
[0407]
dnase1l3是人dnase1l3多肽；
[0408]
x1是共价键，或x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段；
[0409]
连接体是化学键或包含1-100个氨基酸的多肽；
[0410]
x2无，或x2是氨基酸序列seq id no:3的肽或其片段；
[0411]
fc是人igg1的fc结构域。
[0412]
实施方式3提供了实施方式1-2中任一项的构建体，其中fc包含seq id no:4的氨基酸序列。
[0413]
实施方式4提供了实施方式3的构建体，其中关于seq id no:4的c6和c9中的至少一个独立地突变为g或s。
[0414]
实施方式5提供了实施方式3-4中任一项的构建体，其中关于seq id no:4的c6和c9中的每一个独立地突变为g或s。
[0415]
实施方式6提供了实施方式3-5中任一项的构建体，其包含关于seq id no:4的以下突变中的至少一种：m32y、s34t、t36e。
[0416]
实施方式7提供了实施方式3-6中任一项的构建体，其包含关于seq id no:4的以下突变中的每一种：m32y、s34t、t36e。
[0417]
实施方式8提供了实施方式1-7中任一项的构建体，其中连接体是化学键或不存在。
[0418]
实施方式9提供了实施方式1-7中任一项的构建体，其中连接体是包含1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、和/或1-5个氨基酸的多肽。
[0419]
实施方式10提供了实施方式1-7和9中任一项的构建体，其中连接体包含gs和/或gsc。
[0420]
实施方式11提供了实施方式1-7和9-10中任一项的构建体，其中连接体包含ggggsggggs(seq id no:5)、sstmvrs(seq id no:40)、和/或sstmvgs(seq id no:41)。
[0421]
实施方式12提供了实施方式1-7和9-10中任一项的构建体，其中连接体包含elktplgdtthtxprzpapellggp(seq id no:6)，其中x的每次出现是c、g或s，并且其中z的每次出现是c、g或s。
[0422]
实施方式13提供了实施方式1-12中任一项的构建体，其中x1是共价键。
[0423]
实施方式14提供了实施方式1-12中任一项的构建体，其中x1是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段。
[0424]
实施方式15提供了实施方式1-14中任一项的构建体，其中x2是共价键。
[0425]
实施方式16提供了实施方式1-14中任一项的构建体，其中x2是氨基酸序列raftnnrksvslkkrkkgnrs(seq id no:3)的肽或其片段。
[0426]
实施方式17提供了实施方式1和3-16中任一项的构建体，其中dnase1缺少对应于seq id no:1的残基1-22的至少部分。
[0427]
实施方式18提供了实施方式1和3-17中任一项的构建体，其中dnase1缺少对应于seq id no:1的残基1-22。
[0428]
实施方式19提供了实施方式1和3-18中任一项的构建体，其中dnase1包含关于seq id no:1的以下突变中的至少一种：q31r、e35r、y46h、y46s、v88n、n96k、d109n、v111t、a136f、r148s、e149n、m186i、l208p、d220n、d250n、a252t、g262n、d265n和l267t。
[0429]
实施方式20提供了实施方式1和3-19中任一项的构建体，其中fc包含关于seq id no:4的以下突变中的至少一种：c6g、c6s、c9g、c9s、m32y、s34t和t36e。
[0430]
实施方式21提供了实施方式1和3-20中任一项的构建体，其选自seq id no:7-17和32-35。
[0431]
实施方式22提供了实施方式2-16中任一项的构建体，其中dnase1l3缺少以下中的至少一项：seq id no:2的残基291-305；seq id no:2的残基292-304；seq id no:2的残基296-304；seq id no:2的残基a-b，其中a的范围为291至296，并且b的范围为304至305。
[0432]
实施方式23提供了实施方式2-16和22中任一项的构建体，其中dnase1l3包含关于seq id no:2的以下突变中的至少一种：e33r、m42t、v44h、v88t、n96k、a127n、v129t、k147s、d148n、l207p、d219n和v254t。
[0433]
实施方式24提供了实施方式2-16和22-23中任一项的构建体，其中fc包含关于seq id no:4的以下突变中的至少一种：c6g、c6s、c9g、c9s、m32y、s34t和t36e。
[0434]
实施方式25提供了实施方式2-16和22-24中任一项的构建体，其选自seq id no:18-28和36-39。
[0435]
实施方式26提供了实施方式1-25中任一项的构建体，其在哺乳动物细胞中表达。
[0436]
实施方式27提供了实施方式26的构建体，其中哺乳动物细胞稳定转染有人st6β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(也称为st6gal1)。
[0437]
实施方式28提供了实施方式26的构建体，其中哺乳动物细胞在补充有唾液酸和/或n-乙酰甘露糖胺(也称为1,3,4-o-bu3mannac)的细胞培养物中生长。
[0438]
实施方式29提供了实施方式1-28中任一项的构建体，其是可溶的。
[0439]
实施方式30提供了同型二聚体构建体，其包括两个独立选择的权利要求1、3-20和
26-29中任一项的构建体。
[0440]
实施方式31提供了同型二聚体构建体，其包括两个独立选择的权利要求2-16和22-29中任一项的构建体。
[0441]
实施方式32提供了异源二聚体构建体，其包括权利要求1、3-20和26-29中任一项的构建体和权利要求2-16和22-29中任一项的构建体。
[0442]
实施方式33提供了治疗、改善、和/或预防对象中与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的狼疮形式的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0443]
实施方式34提供了实施方式33的方法，其中狼疮包括系统性红斑狼疮(sle)。
[0444]
实施方式35提供了治疗、改善、和/或预防对象中与低效net水解(netolysis)相关的疾病和/或障碍的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0445]
实施方式36提供了治疗、改善、和/或预防对象中与dnase1和/或dnase1l3缺陷相关的自身免疫性障碍的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0446]
实施方式37提供了实施方式36的方法，其中自身免疫性障碍包括狼疮、甲状腺自身免疫性疾病、和/或低补体血症荨麻疹性血管炎综合征(huvs)。
[0447]
实施方式38提供了治疗、改善、和/或预防对象中的病理性血栓形成的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0448]
实施方式39提供了实施方式38的方法，其中病理性血栓形成包括微血管血栓形成、静脉血栓形成、和/或动脉血栓形成。
[0449]
实施方式40提供了实施方式38-39中任一项的方法，其中病理性血栓形成导致中风或使对象易患中风。
[0450]
实施方式41提供了实施方式38-40中任一项的方法，其中病理性血栓形成包括中性粒细胞血栓形成。
[0451]
实施方式42提供了实施方式41的方法，其中中性粒细胞血栓形成包括抗中性粒细胞胞浆自身抗体(anca)血管炎、血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、和白塞(或贝赫切特)病或综合征中的至少一种。
[0452]
实施方式43提供了治疗、改善、和/或预防对象中的心肌梗塞的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0453]
实施方式44提供了治疗、改善、和/或预防对象中的癌症转移的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的实施方式1-29中任一项的构建体。
[0454]
实施方式45提供了实施方式33-44中任一项的方法，其中在dnase1和/或dnase1l3前体构建体中，信号肽序列与dnase1和/或dnase1l3多肽的n-末端缀合。
[0455]
实施方式46提供了实施方式33-45中任一项的方法，其中构建体是哺乳动物细胞中表达的dnase1和/或dnase1l3前体构建体的分泌产物，其中dnase1和/或dnase1l3前体构建体包含信号肽序列和dnase1和/或dnase1l3多肽，其中dnase1和/或dnase1l3前体构建体经历蛋白水解处理以产生dnase1和/或dnase1l3构建体。
[0456]
实施方式47提供了实施方式46的方法，其中哺乳动物细胞稳定转染有人st6β-半
乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶(也称为st6gal1)。
[0457]
实施方式48提供了实施方式46的方法，其中哺乳动物细胞在补充有唾液酸和/或n-乙酰甘露糖胺(也称为1,3,4-o-bu3mannac)的细胞培养物中生长。
[0458]
实施方式49提供了实施方式33-48中任一项的方法，其中构建体被急性地或长期地向对象施用。
[0459]
实施方式50提供了实施方式33-48中任一项的方法，其中构建体被局部地、区域地、肠胃外地、和/或全身地向对象施用。
[0460]
实施方式51提供了实施方式33-50中任一项的方法，其中构建体和/或其前体构建体在编码的载体上向对象递送，其中载体编码构建体或前体构建体，在向对象施用载体后，构建体或前体构建体被转录并翻译。
[0461]
实施方式52提供了实施方式33-51中任一项的方法，其中通过选自以下的至少一种途径向对象施用构建体：皮下、口服、气雾剂、吸入、直肠、阴道、经皮、皮下、鼻内、颊、舌下、肠胃外、鞘内、胃内、眼、肺和局部。
[0462]
实施方式53提供了实施方式33-52中任一项的方法，其中构建体作为药物组合物向对象施用，药物组合物进一步包含至少一种药学上可接受的载剂。
[0463]
实施方式54提供了实施方式33-53中任一项的方法，其中构建体包括：包括两个独立选择的实施方式1、3-20和26-29中任一项的构建体的同型二聚体构建体；包括两个独立选择的实施方式2-16和22-29中任一项的构建体的同型二聚体构建体；和/或包括实施方式1、3-20和26-29中任一项的构建体和实施方式2-16和22-29中任一项的构建体的异源二聚体构建体。
[0464]
实施方式55提供了实施方式33-54中任一项的方法，其中对象是哺乳动物。
[0465]
实施方式56提供了实施方式55的方法，其中哺乳动物是人。
[0466]
本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。尽管已经参照具体实施方式公开了本公开，但是显然，本领域其它技术人员可以设计出本公开的其它实施方式和变型而不脱离本公开的真实精神和范围。所附权利要求书旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等效变型。