用于测量饲料中的蛋白酶活性的方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及用于测量饲料中的蛋白酶活性的方法和试剂盒。


背景技术：

2.蛋白酶通常被添加到动物饲料中以增加饲料的蛋白质可消化性。在一些情况下，蛋白酶在造粒过程之前加入到饲料中，所述造粒过程涉及将饲料混合物加热到高温。在其他情况下，将蛋白酶喷洒到饲料上和/或混合到饲料中。在任一方式中，往往期望测量饲料产品中蛋白酶活性的量，以确保蛋白酶已经实际上被加入，并且蛋白酶已经以正确的量被加入，并且蛋白酶在造粒和/或混合过程中存活。
3.然而，测量饲料中的蛋白酶活性有几个困难。第一，所加入的蛋白酶可能被吸附到饲料的组分中，使所述蛋白酶难以被提取。第二，蛋白酶抑制剂在一些饲料中的存在具有负面影响，并且使得难以准确地鉴定蛋白酶活性。第三，饲料中蛋白酶的包含水平相当低，因此必须建立高度灵敏的方法来测量其中的蛋白酶活性。由于这些困难，现有的方法往往涉及特殊的设备、复杂的工序或专门的知识，或者具有降低的准确度和精确度。
4.因此，需要简单、高度灵敏的方法来检测饲料中的蛋白酶活性，所述方法可以容易地进行并且不需要复杂的设备。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法。所述方法包括将含有所测量的蛋白酶的饲料提取物与蛋白酶底物一起在含有十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,sds)的反应缓冲液中孵育；以及通过检查反应混合物中的颜色变化来测量蛋白酶活性。
6.本发明还提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的试剂盒。所述试剂盒包括用于制备饲料提取物的提取液、蛋白酶底物、和含有sds的反应缓冲液。在定量测量的实施方式中，根据本发明的试剂盒进一步包括一种或多种标准酶溶液。
附图说明
7.图1是显示含有150,000u/kg蛋白酶的试管(左试管)与不含蛋白酶的试管(右试管)之间的颜色变化差异的照片；
8.图2是显示用反应缓冲液中不同浓度的sds进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；
9.图3是通过使用蛋白酶proact360的参考标准溶液制备的标准曲线；
10.图4是显示对蛋白酶proact进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；
11.图5是显示对蛋白酶axtrapro进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；和
12.图6是显示对用或不用sds提取的饲料中的蛋白酶进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图。
具体实施方式
13.本发明提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：
14.a)用提取液提取饲料样品以获得饲料提取物；
15.b)将饲料提取物的等分试样与蛋白酶底物和反应缓冲液混合以形成反应混合物，其中所述蛋白酶底物是与发色团偶联的多肽，并且所述反应缓冲液包含十二烷基硫酸钠(sds)；
16.c)在使发色团从蛋白酶底物中释放出来并导致反应混合物颜色变化的条件下孵育所述反应混合物；和
17.d)通过检查所述反应混合物的颜色变化来测量蛋白酶活性。
18.在本发明中，术语“饲料样品”可以用“饲料”、“食物”、“预混物”或“食物样品”代替，并且是指任何含有待测量的蛋白酶的样品。根据本发明的饲料样品可以包含动物饲料的一种或多种成分。动物饲料成分的非限制性示例包括：玉米或玉米成分，例如玉米粉、玉米纤维、玉米皮、玉米ddgs(含有可溶固形物的干酒糟(distiller's dried grain with solubles))、青贮饲料、磨碎的玉米、玉米胚芽、玉米麸质、玉米油和玉米植株的任何其它部分；大豆或大豆成分，例如大豆油、大豆豆粕、大豆皮、大豆青贮饲料、磨碎的大豆和大豆植株的任何其它部分；小麦或小麦的任何成分，例如小麦粗粉、小麦纤维、小麦壳、小麦谷壳、磨碎的小麦、小麦胚芽和小麦植株的任何其它部分；大麦或大麦植株的成分；甘油；卵磷脂；瘤胃保护脂肪；糖蜜；草类，例如果园草和羊茅草；鱼粉、肉骨粉；羽毛粉；和家禽副产品粉；和用于青贮饲料或干草的苜蓿和/或三叶草，以及本文所述的任何饲料成分的各种组合，或本领域中通常已知的其它饲料成分。如本领域中将认识到的，饲料组合物可以进一步补充有氨基酸、维生素、矿物质和其它饲料添加剂，例如其它类型的酶、有机酸、精油、益生菌、益生元、抗氧化剂、色素、抗结块剂等。
19.根据本发明，饲料样品可以是动物饲料领域中已知的任何合适的形式，并且可以是湿的或干的组分。例如，饲料样品可以是选自由以下组成的组的形式：全价饲料、饲料补充剂、饲料添加剂、预混物、撒饲料(top-dress)、桶装饲料(tub)、矿物质、粗粉、块、粒料、糊状饲料(mash)、液体补充剂、灌服剂(drench)、丸剂(bolus)、零食(treat)以及它们的任何组合。此外，饲料样品在用根据本发明的提取液提取之前可以任选地进行研磨。
20.本发明的饲料可被配制用于施用于任何动物。动物包括但不限于人类、食用动物如家禽(例如，鸡，包括肉鸡、蛋鸡和种鸡、鸭、小母鸡(game hen)、鹅、珍珠鸡/母鸡、鹌鹑、和火鸡)、肉牛、奶牛、小牛、猪、山羊、绵羊、野牛、和鱼；伴侣动物，例如猫、狗、马、兔、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠)、刺猬和雪貂；研究用动物，例如啮齿动物、猫、狗、兔子、猪、和非人灵长类动物；以及动物园动物，例如非人灵长类动物、狮子、老虎、熊、大象、长颈鹿等。
21.本发明的饲料样品可以包含蛋白酶以提高饲料的可消化性，所述蛋白酶可以通过本发明的方法来测量。饲料样品中所用的蛋白酶可以是本领域中通常已知的任何蛋白酶。蛋白酶的示例包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶以及它们的组合。优选地，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。更优选地，蛋白酶是蛋白酶proact360(dsm nutritional products ltd.,
switzerland)和/或proact(dsm nutritional products ltd.,switzerland)和/或axtrapro(dupont,usa)。
22.在根据本发明的方法中，首先在步骤a)中用提取液对饲料样品进行提取。
23.所述提取液可以是任何适于从饲料样品中提取蛋白酶的溶液。提取液的一个示例是缓冲溶液。所述缓冲溶液可以是任何含有以下缓冲试剂中的一种或多种缓冲试剂的缓冲溶液：h2o、氯化钠(nacl)、甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)和三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。提取液可以含有或可以不含有磷酸盐。优选地，提取液不含磷酸盐。更优选地，提取液是蒸馏水中的nacl溶液。
24.提取液可包含聚山梨醇酯表面活性剂，例如20、40、60、或80。优选地，提取液包含20。
25.优选地，提取液包含20和氯化钠。更优选地，提取液含有1mm至500mm，优选地20mm至800mm，更优选地50mm至500mm，例如55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm和450mm的氯化钠，以及0.001w/v％至0.1w/v％，优选地0.005w/v％至0.05w/v％，例如0.006w/v％、0.007w/v％、0.008w/v％、0.009w/v％、0.01w/v％、0.011w/v％、0.012w/v％、0.013w/v％、0.014w/v％、0.015w/v％、0.016w/v％、0.017w/v％、0.018w/v％、0.019w/v％、0.02w/v％、0.025w/v％、0.03w/v％、0.035w/v％、0.04w/v％或0.045w/v％的20。
26.用于步骤a)的提取的饲料样品的量可以变化。通常，饲料样品的量可以为约1克至约100克，例如约2克、5克、10克、15克、20克、25克、30克、35克、40克、45克、50克、55克、60克、70克、80克、90克或95克，或更多。优选地，使用约10克至约60克的饲料样品。更优选地，使用约20克至约50克的饲料。进一步优选地，使用约20克或约50克的饲料进行提取。
27.提取液可以以任何适于提取目的的量使用。优选地，提取液在步骤a)中以每1克在所述步骤中使用的饲料约1ml至约100ml，优选地约5ml至约50ml，更优选地约10ml至20ml的量使用。
28.步骤a)的提取可以在室温下进行，以获得饲料提取物。任选地，饲料提取物在放入下一步骤之前可以进行进一步操作，例如通过离心进行进一步操作。
29.在根据本发明的方法的步骤b)中，将从步骤a)获得的饲料提取物或其等分试样与蛋白酶底物和反应缓冲液混合以形成反应混合物。
30.在步骤b)中，蛋白酶底物可以是任何与发色团偶联的多肽，所述发色团可以由所测量的蛋白酶切割并由此释放发色团，以导致反应混合物颜色变化。
31.在本发明中，术语“多肽”以其最广泛的含义使用，并且可以包括肽、多肽和蛋白质，以及含有一个或多个非天然氨基酸或任何其它化学修饰的肽、多肽和蛋白质，所述化学修饰允许多肽作为正在测量其活性的蛋白酶的底物。多肽可以是天然存在的多肽，例如酪蛋白、胶原蛋白、明胶、白蛋白、球蛋白等。或者，多肽可以是合成肽或多肽。
32.在本发明中，术语“发色团”是一种化学基团，所述化学基团如果被释放到溶液中则可提供可见的颜色变化。合适的发色团的非限制性示例包括但不限于羊毛罂红(erioglaucine)、反应性黑5、反应性蓝21、反应性橙78、反应性黄15、反应性蓝19、反应性蓝
4、反应性红11、反应性黄86、反应性蓝163、反应性红180、单卤代和二卤代三嗪染料例如单氟代和二氟代三嗪染料、单氯代和二氯代三嗪染料、单-(m'-羧基吡啶鎓)三嗪、染料系列中的染料、cibacron
tm
系列煤焦油色素、2,4,5-三卤代嘧啶、2,3-二卤代喹喔啉、n-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-nhs)酯官能化染料、n-羟基琥珀酰亚胺基(nhs)官能化染料、乙烯基砜染料例如系列的煤焦油着色剂(包括蓝)、偶氮染料例如苏丹i、苏丹ii、苏丹iii、苏丹iv、苏丹黑、分散橙、分散红、油红o、台盼蓝、刚果红、β-胡萝卜素、对硝基苯胺(pna)、磺酰氯染料例如丽丝胺、罗丹明和丹磺酰氯(dabsyl chloride)、四氟苯基酯官能化染料、异硫氰酸酯官能化染料和碘乙酰基官能化染料，以及结构上等同于本文所列染料的其它染料。
33.蛋白酶底物可不溶于反应混合物。适用于本发明的方法的不溶性底物的非限制性示例包括hide-remazol亮蓝r、偶氮胶原蛋白、azurine交联酪蛋白、明胶-remazol亮蓝、酪蛋白-remazol亮蓝、和胶原蛋白-remazol亮蓝。在一个示例性实施方式中，不溶性底物是酪蛋白-remazol亮蓝。
34.或者，蛋白酶底物可以可溶于反应混合物中。合适的可溶性底物的非限制性示例包括n-琥珀酰-ala-ala-pro-phe-pna、n-琥珀酰-ala-ala-pro-leu-pna、n-琥珀酰-ala-ala-pro-arg-pna、n-甲基磺酰基-d-phe-gly-arg-pna、和邻氨基苯甲酰基-agsrgagq-(2,3-二硝基苯基-乙二胺)。优选地，底物是n-琥珀酰-ala-ala-pro-phe-pna。
35.在步骤b)中，反应缓冲液可以是本领域已知的任何适用于蛋白酶切割反应的缓冲液。本发明的反应缓冲液可以包含一种或多种选自由以下组成的组的缓冲试剂：tris、tris hcl、3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸(taps)、n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸(bicine)、n-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、3-[n-三(羟甲基)甲基氨基]-2-羟基丙磺酸(tapso)、hepes、2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸(tes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、哌嗪-n,n'-双(2-乙磺酸)(pipes)、二甲基胂酸(卡可酸盐)、柠檬酸钠盐(ssc)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2(r)-2-(甲氨基)琥珀酸(琥珀酸)、硼酸盐、磷酸盐、乙酸盐、甘氨酸、碳酸镁或碳酸钙和碳酸氢盐。优选地，本发明的反应缓冲液包含甘氨酸作为缓冲试剂。更优选地，本发明的反应缓冲液是甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
[0036]
反应缓冲液的ph可以变化。例如，本发明的方法中的反应缓冲液可被调节至约6.0至约12.0，例如6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和约12.0的ph。优选地，反应缓冲液的ph为约7.0至约11.0，例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9或约11.0。更优选地，反应缓冲液的ph为约7.5至约10.0，例如7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或约10.0。最优选地，反应缓冲液的ph为约9.0。
[0037]
反应缓冲液中缓冲试剂的浓度通常足以维持所需的ph范围，并且因此可以变化。反应缓冲液中缓冲试剂的浓度例如可以为约20mm至约200mm，例如20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm和200mm。优选地，反应缓冲液中缓冲试剂的浓度为约50mm至150mm，例如50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm和150mm。更优选地，反应缓冲液中缓冲
试剂的浓度为约60mm至120mm，例如60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、105mm、110mm、115mm和120mm。进一步优选地，反应缓冲液中缓冲试剂的浓度为约90mm至约110mm，例如90mm、91mm、92mm、93mm、94mm、95mm、96mm、97mm、98mm、99mm、100mm、101mm、102mm、103mm、104mm、105mm、106mm、107mm、108mm、109mm和110mm。最优选地，反应缓冲液中缓冲试剂的浓度为约100mm。
[0038]
根据本发明的反应缓冲液可以含有一种或多种表面活性剂。所述表面活性剂可以是聚山梨醇酯表面活性剂，例如20、40、60、或80。更优选地，表面活性剂是20。反应缓冲液可以含有量为0.001w/v％至0.1w/v％，优选地0.005w/v％至0.05w/v％，例如0.006w/v％、0.007w/v％、0.008w/v％、0.009w/v％、0.01w/v％、0.011w/v％、0.012w/v％、0.013w/v％、0.014w/v％、0.015w/v％、0.016w/v％、0.017w/v％、0.018w/v％、0.019w/v％、0.02w/v％、0.025w/v％、0.03w/v％、0.035w/v％、0.04w/v％或0.045w/v％的20的表面活性剂。
[0039]
根据本发明的反应缓冲液可以含有十二烷基硫酸钠(sds)。反应缓冲液中sds的浓度可以在约0.0005w/v％至约0.5w/v％的范围内，例如0.0005w/v％、0.0006w/v％、0.0007w/v％、0.0008w/v％、0.0009w/v％、0.001w/v％、0.002w/v％、0.003w/v％、0.004w/v％、0.005w/v％、0.006w/v％、0.007w/v％、0.008w/v％、0.009w/v％、0.01w/v％、0.02w/v％、0.03w/v％、0.04w/v％、0.05w/v％、0.06w/v％、0.07w/v％、0.08w/v％、0.09w/v％、0.1w/v％、0.2w/v％、0.3w/v％、0.4w/v％、和0.5w/v％。优选地，反应缓冲液中sds的浓度可以在约0.005w/v％至约0.5w/v％的范围内，例如0.005w/v％、0.015w/v％、0.025w/v％、0.035w/v％、0.045w/v％、0.055w/v％、0.065w/v％、0.075w/v％、0.085w/v％、0.095w/v％、0.15w/v％、0.25w/v％、0.35w/v％和0.45w/v％。更优选地，反应缓冲液中sds的浓度可以在约0.01w/v％至约0.45w/v％的范围内，例如0.01w/v％、0.02w/v％、0.03w/v％、0.04w/v％、0.05w/v％、0.06w/v％、0.07w/v％、0.08w/v％、0.09w/v％、0.1w/v％、0.2w/v％、0.3w/v％、0.4w/v％、0.41w/v％、0.42w/v％、0.43w/v％、0.44w/v％和0.45w/v％。
[0040]
反应缓冲液可以进一步包含盐例如氯化钠(nacl)或氯化钾(kcl)、还原剂例如二硫苏糖醇(dtt)、β-巯基乙醇(bme)、和三(2-羧乙基)膦(tcep)，填充剂例如硫酸葡聚糖、聚乙二醇(peg)、消泡剂、酶抑制剂、和/或四甘醇、和/或其他。
[0041]
优选地，反应缓冲液含有作为缓冲试剂的甘氨酸、一种或多种表面活性剂例如20、sds和/或盐例如氯化钠(nacl)。更优选地，反应缓冲液含有量为约50mm至约150mm，例如50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、100mm、105mm、110mm、115mm、120mm、125mm、130mm、135mm、140mm、145mm和150mm的甘氨酸；量为0.005w/v％至0.05w/v％，例如0.006w/v％、0.0065w/v％、0.007w/v％、0.0075w/v％、0.008w/v％、0.0085w/v％、0.009w/v％、0.0095w/v％、0.01w/v％、0.011w/v％、0.012w/v％、0.013w/v％、0.014w/v％、0.015w/v％、0.016w/v％、0.017w/v％、0.018w/v％、0.019w/v％、0.02w/v％、0.025w/v％、0.03w/v％、0.035w/v％、0.04w/v％或0.045w/v％的20；量为0.005w/v％至约0.1w/v％，例如0.005w/v％、0.006w/v％、0.007w/v％、0.008w/v％、0.009w/v％、0.01w/v％、0.015w/v％、0.02w/v％、0.025w/v％、0.03w/v％、0.035w/v％、0.04w/v％、0.045w/v％、0.05w/v％、0.055w/v％、0.06w/v％、0.065w/v％、0.07w/v％、
0.075w/v％、0.08w/v％、0.085w/v％、0.09w/v％、0.095w/v％和0.1w/v％的sds；和/或量为100mm至1000mm，例如100mm、150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm、500mm、550mm、600mm、6500mm、700mm、750mm、800mm、850mm、900mm和1000mm的nacl。
[0042]
在步骤b)中，可以加入任何量的反应缓冲液，以使与蛋白酶底物偶联的发色团被反应混合物中所测量的蛋白酶顺利地切割。优选地，反应缓冲液以每1ml加入到反应混合物中的饲料提取物50ml至500ml，更优选地60ml至400ml，进一步优选地70ml至200ml，例如80ml、90ml、100ml、110ml、120ml、130ml、140ml、150ml、160ml、170ml、180ml、190ml和200ml的量加入。
[0043]
在步骤b)中，应加入足够量的蛋白酶底物，以使所测量的蛋白酶切割并从反应混合物中的蛋白酶底物中释放尽可能多的发色团。优选地，蛋白酶底物以使得反应混合物含有0.5mm至20mm，更优选地1mm至15mm，进一步优选地2mm至10mm，例如2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm的蛋白酶底物的量加入。
[0044]
在步骤b)中，饲料提取物或其等分试样可以直接地或在稀释后与蛋白酶底物和反应缓冲液混合。优选地，将所提取的饲料在混合前用反应缓冲液进行1:1-100(v/v)，更优选地1:5-80(v/v)，更优选地1:50(v/v)稀释。
[0045]
一旦如步骤b)制备了反应混合物，本发明的方法就进一步涉及步骤c)在允许蛋白酶底物由所测量的蛋白酶切割并释放发色团以导致反应混合物颜色变化的条件下孵育反应混合物。
[0046]
如本领域任何技术人员所理解的，孵育反应混合物所需的条件和时间将取决于饲料样品、饲料样品中蛋白酶的浓度和性质、以及用于制备反应混合物的蛋白酶底物的特性而变化。一般而言，反应混合物可在约环境温度至约100℃范围内的温度下孵育。例如，反应混合物可在约15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、或约100℃的温度下孵育。通常，反应混合物被孵育，直到发展出足量的发色团以允许测定蛋白酶活性。例如，孵育的持续时间可以在约1分钟至约10小时或更长的范围内。优选地，孵育于65℃进行1小时。
[0047]
本发明方法的接下来的步骤包括步骤d)通过检查反应混合物的颜色变化来测量蛋白酶活性。
[0048]
在本发明的步骤d)中，蛋白酶活性可以通过目视检查由反应混合物中释放的发色团生成的颜色变化来定性地测量。
[0049]
在本发明中，术语“定性地”是指简单确定饲料样品中蛋白酶的存在或不存在。因此，本发明的方法可用于确定蛋白酶是否已被加入到饲料样品中和/或蛋白酶活性是否在饲料制备过程中存活。通常，当定性地测量蛋白酶活性时，蛋白酶活性是通过目视检查由反应混合物中释放的发色团生成的颜色变化来测量的。
[0050]
当定性地测量蛋白酶活性时，本发明的方法可以进一步经优化以确定饲料样品中最小量的蛋白酶活性的存在。饲料样品中蛋白酶活性的最小量可以是至少约0.03mg酶/kg饲料，例如0.03mg酶/kg饲料、0.031mg酶/kg饲料、0.032mg酶/kg饲料、0.033mg酶/kg饲料、0.034mg酶/kg饲料、0.035mg酶/kg饲料、0.036mg酶/kg饲料、0.037mg酶/kg饲料、0.038mg酶/kg饲料、0.039mg酶/kg饲料、0.04mg酶/kg饲料、0.042mg酶/kg饲料、0.045mg酶/kg饲料、0.046mg酶/kg饲料、0.048mg酶/kg饲料、0.05mg酶/kg饲料、0.055mg酶/kg饲料、0.06mg酶/
kg饲料、0.065mg酶/kg饲料、0.07mg酶/kg饲料、0.08mg酶/kg饲料、0.09mg酶/kg饲料和0.1mg酶/kg饲料。
[0051]
或者，本发明的步骤d)中的蛋白酶活性可以通过对由反应混合物中释放的发色团生成的颜色变化的分光光度检测来定量地测量。本发明人惊奇地发现，本发明的方法对于饲料样品中的蛋白酶活性的定量测量尤其有价值。
[0052]
在本发明中，术语“定量地”是指准确测定饲料样品中蛋白酶活性的量。例如，本发明的方法可用于确定饲料样品中存在的蛋白酶活性的绝对量，或者有多少蛋白酶活性已经在饲料制备过程中存活。
[0053]
在一个实施方式中，本发明的步骤d)中的蛋白酶活性可以通过将由反应混合物中的发色团生成的颜色变化与一个或多个包含已知量的所测量的蛋白酶的饲料样品的标准曲线中的颜色变化进行比较来定量地测量。对于本领域技术人员而言众所周知的是如何制备标准曲线以及如何根据与标准曲线的比较计算蛋白酶活性(参见harris,t.k.等人，guide to protein purification，第2版，methods in enzymology 2009 463:57-71)。
[0054]
当定量地测量蛋白酶活性时，本发明的方法适用于在很宽的蛋白酶浓度范围内确定蛋白酶活性。优选地，本发明的方法可适合于检测至少约0.2mg酶/kg饲料，例如0.2mg酶/kg饲料、0.21mg酶/kg饲料、0.22mg酶/kg饲料、0.23mg酶/kg饲料、0.24mg酶/kg饲料、0.25mg酶/kg饲料、0.26mg酶/kg饲料、0.27mg酶/kg饲料、0.28mg酶/kg饲料、0.29mg酶/kg饲料和0.3mg酶/kg饲料的蛋白酶活性。
[0055]
本发明的方法避免了饲料样品中存在的饲料抑制剂的影响，并且因此提供了一种稳定且准确的用于以高灵敏度测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法。所述方法尤其适用于定量地测量饲料样品中的蛋白酶活性。所述方法还避免了复杂的设备，因此所述方法是简单、便宜并且适用于自动化的。
[0056]
本发明还提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的试剂盒。本发明的试剂盒可以包含：i)如上所述的提取液；ii)蛋白酶底物，所述蛋白酶底物是与如上所述的发色团偶联的多肽；iii)如上所述的包含十二烷基硫酸钠的反应缓冲液；(iv)对于以下步骤的使用说明：a)用提取液提取饲料样品以获得饲料提取物，b)将饲料提取物的等分试样与蛋白酶底物和反应缓冲液混合以形成反应混合物，c)在蛋白酶底物的切割导致所述反应混合物颜色变化的条件下孵育所述反应混合物；以及d)通过检查所述反应混合物的颜色变化来测量蛋白酶活性。
[0057]
在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒可用于定性地测量饲料样品中的蛋白酶活性。
[0058]
在本发明的另一个实施方式中，本发明的试剂盒用于定量地测量饲料样品中的蛋白酶活性。在此类实施方式中，所述试剂盒可以进一步含有v)一种或多种用于制备标准曲线的标准酶溶液。
[0059]
本发明的试剂盒可以避免使用昂贵的设备，并且可以在饲料/食品加工现场容易地使用。
[0060]
包括以下实施例以进一步说明本发明。
[0061]
实施例
[0062]
实施例1
[0063]
进行以下实验以目测评定饲料样品中蛋白酶proact360(dsm nutritional products ltd.,switzerland)的存在。
[0064]
用500ml提取液(100mm nacl、0.01w/v％20)提取50g含有蛋白酶proact360(150,000u/kg)的饲料样品1小时。将2ml提取物离心并在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20、0.05w/v％sds，用5m naoh溶液调节ph至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag,switzerland)溶液在试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml乙醇停止反应。在单独的试管中并行地进行不含蛋白酶的阴性对照。图1显示了两个试管的颜色变化。目测评定左试管中黄色的存在，所述黄色是蛋白酶活性存在的标志，而不含蛋白酶的右试管没有颜色变化。
[0065]
实施例2
[0066]
进行以下实验以开发和优化用于测量饲料中的蛋白酶活性的蛋白酶测定。在本实施例中，评估了不同sds浓度在维持蛋白酶活性的同时对变性抑制剂的适用性。
[0067]
将20g空白饲料样品掺加不同量(0nfp/kg、5,000nfp/kg、50,000nfp/kg、100,000nfp/kg、140,000nfp/kg、150,000nfp/kg)的蛋白酶proact360(dsm nutritional products ltd.,switzerland)，并分别使用200ml提取液(100mm nacl，0.01w/v％20)进行提取。将2ml提取物离心并在含有不同浓度sds(0％(w/v)、0.001％(w/v)、0.01％(w/v)、0.05％(w/v)、0.1％(w/v)和0.5％(w/v))的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20，用5m naoh溶液将ph调节至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag，switzerland)溶液在单独的试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml etoh停止反应，并用分光光度计在每个试管上测量od
405nm
。
[0068]
图2显示了在不同浓度的sds存在下蛋白酶浓度与od
405nm
值之间的成比例关系。随着酶浓度增大，od
405nm
增大。在0.05w/v％sds的浓度时观察到了最高的增大，从而允许更高的测定灵敏度。较低浓度的sds似乎不足以使抑制剂变性，而较高浓度可使所测试的蛋白酶变性。
[0069]
实施例3
[0070]
使用所述方法分析不同的饲料样品(糊状饲料和造粒的饲料)，使用参考标准酶溶液的标准曲线来定量饲料内蛋白酶活性。
[0071]
标准曲线的制备
[0072]
将20g空白饲料样品掺加不同量(0nfp/ml、16.5nfp/ml、15nfp/ml、10nfp/ml、5nfp/ml、0.5nfp/ml)的蛋白酶proact360(dsm nutritional products ltd.,switzerland)，并分别使用200ml提取液(100mm nacl，0.01w/v％20)进行提取。将2ml提取物离心并在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20、0.05w/v％sds，用5m naoh溶液调节ph至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag，switzerland)溶液在单独的试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml etoh停止反应，并用分光光度计在每个试管上测量od
405nm
。标准曲线(图3)是通过将具有不同量的蛋白酶proact360的
样品的od
405nm
值标绘在y轴上并将蛋白酶活性标绘在x轴上来提供的。
[0073]
测量不同饲料样品中的蛋白酶活性
[0074]
用500ml提取液(100mm nacl、0.01w/v％20)提取50g饲料样品1小时。将2ml提取物离心并在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20、0.05w/v％sds，用5m naoh溶液调节ph至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag，switzerland)溶液在单独的试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml etoh停止反应，并用分光光度计在每个试管上测量od
405nm
。基于如上制备的标准曲线计算每个样品的饲料内活性。结果在如下表1中显示：
[0075]
表1：在不同饲料样品(糊状饲料和粒料)中测量的蛋白酶活性
[0076][0077]
实施例4
[0078]
评估了本发明的方法对于饲料中不同蛋白酶的测量的适用性。测试了两种常用的饲料内蛋白酶产品proact(dsm nutritional products ltd.,switzerland)和axtrapro(dupont,usa)。
[0079]
将20g空白饲料分别掺加不同量的蛋白酶(proact：0prot/kg饲料、5,000prot/kg饲料、10,000prot/kg饲料、15,000prot/kg饲料、30,000prot/kg饲料、60,000prot/kg饲料；
和axtrapro：0ppm、5ppm、12.5ppm和25ppm)。用200ml提取液(100mm nacl、0.01w/v％20)提取经掺加的样品中的每一者。将2ml获得的提取物离心并在甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20、0.05w/v％sds，用5m naoh溶液调节ph至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag，switzerland)溶液在单独的试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml etoh停止反应，并用分光光度计在每个试管上测量od
405nm
。对于每种蛋白酶，通过将具有不同量的蛋白酶的样品的od
405nm
值标绘在y轴上和将蛋白酶活性标绘在x轴上来制作坐标图(图4和图5)。如图4和图5所示，od
405nm
值的增大与酶活性的增加成比例，从而证明了所述方法对于饲料样品中不同蛋白酶的测量的适用性。
[0080]
实施例5
[0081]
进行以下实验以比较本发明的方法和其中将sds加入到提取液中的发明。
[0082]
将20g空白饲料样品分别掺加不同量(0nfp/kg、5,000nfp/kg、50,000nfp/kg、100,000nfp/kg、140,000nfp/kg、150,000nfp/kg)的蛋白酶proact360(dsm nutritional products ltd.,switzerland)。用200ml含有sds(0％(w/v)或0.01％(w/v))的提取液(100mm nacl、0.01w/v％20)提取经掺加的样品中的每一者。将2ml提取物离心并在含有sds(0％(w/v)或0.05％(w/v))的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(100mm甘氨酸、500mm nacl、0.01w/v％20，用5m naoh溶液调节ph至ph 9)中进行1/50稀释。将100μl稀释的提取物与100μl的4mm底物suc-ala-ala-pro-phe-pna(bachem ag，switzerland)溶液在单独的试管中混合。将溶液于65℃孵育1小时。通过加入0.2ml etoh停止反应，并用分光光度计在每个试管上测量od
405nm
。
[0083]
通过将具有不同量的蛋白酶的样品的od
405nm
值标绘在y轴上并将蛋白酶活性标绘在x轴上来制作坐标图(图6)。如图6所示，随着酶活性增大，od
405nm
增大。使用在反应溶液中含有sds的方法时观察到了最高的增大，因此使用0.05％sds发生的反应允许更高的测定灵敏度。