衍生自腺病毒五邻体基座的可变结构域的工程化多肽的制作方法

衍生自腺病毒五邻体基座的可变结构域的工程化多肽
1.本发明涉及一种源自腺病毒五邻体基座蛋白的工程化多肽。本发明的多肽基于腺病毒五邻体基座的“上部”α-螺旋结构域，如五邻体基座原子结构中所示的，但它基本上完全缺少显示果冻卷折叠(jellyroll fold)结构的β-桶片层结构域(果冻卷折叠结构域)的任何氨基酸。该多肽至少含有五邻体基座的所述α-螺旋结构域的大片段(在本文中也称为“大片段”)，该片段包括rgd环和vlp环，并且还可以含有腺病毒五邻体基座的α-螺旋结构域的第二短片段。本发明的多肽提供了一种新的支架，用于优化呈递肽实体，例如寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和由两个、几个或许多亚基组成的蛋白质复合物，优选作为对靶分子的高亲和力药剂。
2.设计用于呈递肽实体(例如寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和蛋白质复合物)的成功的蛋白质支架的先决条件是紧凑、稳定的蛋白质结构域，其能够容纳表示可以容纳所述实体的暴露的且柔性的环结构的形态。在本发明的优选实施方案中，这些展示的实体能够表示可以由肽结构的任何结合配偶体识别的任何肽序列，例如结合子序列和/或互补位序列和/或例如来自随机化文库的序列，其能够分别被呈递给能够由所述结合子序列识别的任何化学或生物化学结构(例如上文例示的那些)，例如抗原和/或毒素和/或毒液和/或化学品(图1)。另外，可以插入至本发明的一种或多种工程化多肽中的的外源序列可以表示用于鉴定特异性结合子(例如抗体(图2))的抗原。
3.如wo2017/167988a1中所公开的，来自许多腺病毒(ad)血清型的五邻体基座蛋白质(原聚体)含有高度可变的环区域，其能够经功能化用于插入编码寡肽、多肽序列、蛋白质结构域、蛋白质和蛋白质复合物的外源序列。腺病毒是人类最常用的基因治疗载体中的一种。腺病毒外壳主要由两种不同的蛋白质构成：六邻体蛋白和五邻体基座蛋白，其中后者形成五聚体组装体，其上附接了该病毒特有的纤维蛋白。当在缺乏其他腺病毒组分的情况下重组表达时，某些腺病毒血清型的五邻体基座蛋白显示为自发地自组装成多聚体超结构。该超结构表示十二面体，由总共60个腺病毒基座蛋白以十二个相同的五聚体拷贝排列形成。
4.本发明的技术问题是提供用于呈递靶分子的肽结合配偶体的蛋白质支架。
5.通过如权利要求、本说明书和附图中所限定和公开的本发明的实施方案来提供对上述技术问题的解决方案。
6.对五邻体基座蛋白(pdb id 6hcr)的高分辨率结构的仔细检查证明，五邻体基座蛋白本身采用不同的双结构域构架，其中一个结构域表示β-桶果冻卷折叠，其与由α-螺旋稳定的第二结构域结合，在本发明中称为“冠型结构域(crown domain)”(图3)。如突变研究所证明的，前者介导多聚化成十二面体，而后者在十二面体表面上向溶剂呈递扩展的环。这些环的长度和序列组成在不同的腺病毒血清型中是极其可变的，而基座蛋白的其余部分在整个腺病毒物种中高度保守。腺病毒十二面体表示高度通用的展示支架，例如用于免疫原性肽，其能够插入至替换腺病毒五邻体基座中天然存在的序列的环中。因此，如果所有插入位点都被占据，则在单个十二面体上完全能够有效地展示数百个异源肽(参见wo2017/167988a1)。十二面体可以以非常高的量重组产生，其非常稳定，并且可以在环境温度下无
限期储存(参见wo2017/167988a1)。利用这些高度有利的特征，在其暴露的环中展示免疫原性肽的基于合成的十二面体的颗粒能够经工程化用于一系列应用中的潜在用途，包括(肿瘤)免疫学和新兴感染性疾病。早期，在候选疫苗的背景下，本发明人已经将腺病毒十二面体开发成合成的生物积木(biobrick)形式，其便于表位插入至暴露的环中，并且建立了基于如wo2017/167988a1中所公开的multibac平台的高效腺病毒基座蛋白产生方案。最近，在仔细检查腺病毒基座蛋白的结构时，本发明人认识到该构架表示在基因融合进化期间可能产生的真正的双结构域结构(图3)。出现的两个结构域可以容易分成两个不同的紧凑实体：含有多聚化信息的β-桶结构域(果冻卷折叠结构域)和类似冠型的α-螺旋结构域。
7.共同未决的国际专利申请pct/ep2019/070722描述了源自五邻体基座蛋白的果冻卷折叠结构域的多聚化多肽。尽管发现腺病毒的五邻体基座蛋白可以分成两个结构域，但本发明人认识到α-螺旋冠型结构域本身对于采用如wo2017/167988a1中所公开的各种非腺病毒序列具有重要意义，并且可以独自产生。
8.本发明提供了分别由腺病毒基座蛋白头部结构域(即，五邻体基座蛋白质减去多聚化结构域)或其特定片段组成或衍生的工程化多肽，其作为自主支架以独自形成单独、稳定、高度通用的蛋白质实体。因为冠型结构域中高度可变的环使人联想到抗体互补决定区(cdr)，所以根据本发明的冠型结构域多肽在下文中也称为“addobody”。本发明的addobody多肽能够展示任何肽结构的多个拷贝，特别是肽、寡肽、蛋白质结构域、蛋白质或蛋白质复合物。addobody含有腺病毒五邻体基座α-螺旋结构域的大片段和小片段。本发明还涉及仅含有α-螺旋结构域的大片段的最小addobody(或miniaddobody)。
9.这些寡肽、多肽序列、蛋白质结构域和蛋白质能够包括：(i)天然存在的结合子序列或互补位，(ii)从随机文库和选择进化(噬菌体/核糖体展示)获得的结合子序列或互补位，(iii)刺激免疫系统以触发免疫应答的抗原性实体，例如用于疫苗接种目的，或用于在细胞培养物中或试管中体外制备抗体或其他结合子分子。理想地，呈递这种实体的这种蛋白质将是安全的、非免疫原性的、有效的并且可调的。此外，它们将容易以工业规模产生。在某些实施方案中，如wo2017/167988a1中所公开的，多肽含有在vl环(也称为v环)和/或rgd环内的插入位点。根据本发明，公开了用于异源修饰现有腺病毒五邻体基座蛋白的天然序列的两个或更多个柔性位点，其进一步增加了例如冠型结构域和腺病毒五邻体基座的柔性修饰，以包括多种可能的异源肽结构。
10.另外，本发明的多肽能够工程化为多价病毒样颗粒(vlp)。本公开描述了工程化多肽的创建、设计和产生及其作为一种用于呈递肽结构以呈递至靶结合配偶体的新型蛋白质的实施方案。
11.更具体地，本发明提供了以下实施方案：
12.本发明提供了一种分离的工程化多肽，其包含基本上对应于五邻体基座的第一片段和第二片段的氨基酸伸展段，其中分别地，多肽的第一片段存在于在全长五邻体基座中形成果冻卷折叠结构域的第一氨基酸伸展段和第二氨基酸伸展段之间，并且其中多肽的第二片段存在于在全长五邻体基座中形成果冻卷折叠结构域的第二片段和第三片段之间，其中分离的工程化结构域缺少腺病毒五邻体基座的形成果冻卷折叠结构域的氨基酸伸展段，其中可选地多肽的第一片段和/或第二片段含有一个或多个异源修饰。
13.优选地，提供了一种具有以下通式(i)结构的多肽：
14.n-a-l-b-c(i)
15.其中
16.a表示存在于形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的第一氨基酸伸展段和第二氨基酸伸展段之间、对应于腺病毒五邻体基座的n-末端氨基酸伸展段的氨基酸伸展段；
17.b表示插入在形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的第二氨基酸伸展段和第三氨基酸伸展段之间、对应于腺病毒五邻体基座的c-末端氨基酸伸展段的氨基酸伸展段；
18.l表示选自由氨基酸、寡肽和多肽组成的组的化学基团；
19.n可以存在或不存在，并且如果存在，表示化学基团，例如氨基酸、寡肽和多肽；
20.c可以存在或可不存在，并且如果存在，表示化学基团，例如氨基酸、寡肽和多肽；
21.其中，可选地，片段a和/或b含有一个或多个异源修饰。
22.优选片段或基团n分别包含便于多肽纯化的氨基酸序列，例如his标签。这同样也分别适用于片段或基团c。
23.更优选地，如本文所定义的多肽的片段a包含选自由根据以下表1的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
24.表1：
[0025][0026]
其中，可选地，片段a含有一个或多个异源修饰。
[0027]
优选地，如本文所定义的多肽的片段b包含选自由根据以下表2的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
[0028]
表2：
[0029][0030]
其中，可选地，片段b含有一个或多个异源修饰。
[0031]
在根据本发明的多肽的优选实施方案中，片段a和/或b含有一个或多个异源修饰，其中所述一个或多个异源修饰包含在以下位点中：
[0032]-片段a的rgd环区域；和/或
[0033]-片段a的v环(也称为“可变环”)；和/或
[0034]-片段a的序列(从n-末端至c-末端)
[0035]
x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-d-x
7-x
8-x
9-s-y-n-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16
(seq id no:21)(下文称为“底层区域(floor region)”)
[0036]
其中
[0037]
x1为i或l，优选为i；
[0038]
x2选自由k、q和e组成的组，优选为q；
[0039]
x3为p或a，优选为p；
[0040]
x4选自由l、v和i组成的组，优选为l；
[0041]
x5选自由t、e、a、k和l组成的组，优选为e；
[0042]
x6选自由e、k、t和q组成的组，优选为k；
[0043]
x7选自由s、p和d组成的组，优选为s；
[0044]
x8选自由k、t和s组成的组，优选为k；
[0045]
x9选自由k、s、n、g和d组成的组，优选为s；
[0046]
x
10
为l或v，优选为v；
[0047]
x
11
为i或l，优选为i；
[0048]
x
12
选自由s、e和p组成的组，优选为e；
[0049]
x
13
为无氨基酸(即不存在)或为n，优选为无氨基酸；
[0050]
x
14
为d或g，优选为d；
[0051]
x
15
选自由s、k、q和t组成的组，优选为k；并且
[0052]
x
16
选自由t、n、i、k和m组成的组，优选为i；和/或
[0053]-片段b的序列(从n-末端至c-末端)t-h-v-f-x
17-r-f-p(seq id no:22)(下文称为“b环”)，其中，x
17
为d或n，优选为n。
[0054]
根据本发明，令人惊讶地发现，如通过本发明的示例性addobody的x射线晶体学所证明的，底层区域(也表示为“底层位点(floor site)”)和b环显示出柔性构象。
[0055]
应当理解，关于底层区域(也称为“底层位点”)和b环都是(更特别是b环)各种腺病毒物种的腺病毒五邻体基座序列中相当保守的位点，一个或多个异源修饰包括分别在上述残基的任何位置处和任何位置的任何插入、缺失、取代，其中插入或取代可以分别包含底层区域和b环的相应氨基酸中的一个或多个或全部。
[0056]
关于b环，优选的异源修饰是优选通过异源寡核苷酸、多肽、蛋白质或蛋白质复合物对如上所定义的seq id no:22的1至6位氨基酸残基的取代。
[0057]
在本发明的优选实施方案中，多肽至少在rgd环(即如上所定义的rgd环区域)、v环和底层位点中包含一个或多个异源修饰，其中在这种类型的某些实施方案中，一个或多个异源修饰仅位于所述rdg环区域、所述v环和所述底层位点中。在其他实施方案中，本发明的多肽至少在rgd环区域和v环中包含一个或多个异源修饰，其中在这种类型的某些实施方案中，一个或多个异源修饰仅位于所述rdg环区域和所述v环中。在本发明的其他实施方案中，多肽至少在底层区域和b环中包含一个或多个异源修饰，其中在这种类型的某些实施方案中，一个或多个异源修饰仅位于所述底层位点和所述b环中。应理解，一个或多个修饰可以存在于如上所定义的片段a和/或片段b的异源修饰位点的任何组合中，包括在上述所定义的全部位点中具有一个或多个异源修饰。
[0058]
更优选地，片段a的rgd环区域的n-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0059]
x
18-x
19-x
20-x
21-x
22-x
23-x
24-x
25-x
26
(seq id no:23)，其中
[0060]
x
18
选自由d、e和n组成的组，优选为d；
[0061]
x
19
选自由v、l和i组成的组，优选为v；
[0062]
x
20
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e、k、s和t组成的组，更优选为t；
[0063]
x
21
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e和k组成的组，更优选为a；
[0064]
x
22
选自由f、y和w组成的组，优选为y；
[0065]
x
23
选自由a、d、e、n和q组成的组，优选为e或q，更优选为e；
[0066]
x
24
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e、n和k组成的组，更优选为e；
[0067]
x
25
选自由s或t组成的组，优选为s；并且
[0068]
x
26
是任意氨基酸，并且构成rgd环区域的n-末端氨基酸。
[0069]
更优选地，片段a的rgd环区域的c-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0070]
x
27-x
28-x
29-x
30-x
31-x
32-x
33-x
34
(seq id no:24)，其中
[0071]
x
27
是任意氨基酸，并且构成第二rgd环的c-末端氨基酸；
[0072]
x
28
选自由i、l和v组成的组，优选为i；
[0073]
x
29
选自由d、e、k、n、q和v组成的组，优选为q或k，更优选为q；
[0074]
x
30
选自由c、g和p组成的组，优选为p；
[0075]
x
31
选自由i、l和v组成的组，优选为l或v，更优选为l；
[0076]
x
32
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为e；
[0077]
x
33
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为k；并且
[0078]
x
34
选自由d和e组成的组，优选为d；
[0079]
参照wo2017/167988a1，应理解，根据本发明，如本文所公开和定义的rgd环区域能够细分为第一rdg环和第二rdg环，更特别地如在wo2017/167988的第31至33页上所定义的。
[0080]
优选地，片段a的v环的n-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0081]
x
35-x
36-x
37-x
38-x
39-x
40-x
41-x
42
(seq id no:25)
[0082]
其中
[0083]
x
35
选自由f、y和w组成的组，优选为f；
[0084]
x
36
选自由h、k和r组成的组，优选为k；
[0085]
x
37
选自由a、v、i和l组成的组，优选为a；
[0086]
x
38
选自由h、k和r组成的组，优选为r；
[0087]
x
39
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；
[0088]
x
40
选自由a、v、i、l和m组成的组，优选为m；
[0089]
x
41
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；以及
[0090]
x
42
是任意氨基酸，并且构成v环的n-末端氨基酸。
[0091]
优选地，片段a的v环的c-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0092]
x
43-x
44-x
45-x
46-x
47-x
48-x
49
(seq id no:26)
[0093]
其中
[0094]
x
43
是任意氨基酸，并且构成v环的c-末端氨基酸；
[0095]
x
44
选自由f、y和w组成的组，优选为y；
[0096]
x
45
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为e；
[0097]
x
46
选自由f、y和w组成的组，优选为w；
[0098]
x
47
选自由a、f、v、y和w组成的组，优选为f或v，更优选为f；
[0099]
x
48
选自由d、e、s和t组成的组，优选为d或e，更优选为e；并且
[0100]
x
49
选自由f、y和w组成的组，优选为f。
[0101]
根据另一方面，本发明还涉及一种进一步分离的工程化多肽，其包含腺病毒五邻体基座蛋白的α-螺旋结构域的大片段，该多肽缺少α-螺旋结构域的小片段和腺病毒五邻体
基座蛋白的果冻卷折叠结构域，其中所述大片段可选地含有一个或多个异源修饰。这种进一步工程化多肽在本文中称为“最小冠型结构域”或“最小addobody”或“miniaddobody”。
[0102]
本发明的最小冠型结构域(或最小addobody)优选具有如根据以下式(ii)所定义的通用结构：
[0103]
n-a-c(ii)
[0104]
其中n、a和c如上述式(i)所定义的。
[0105]
本发明还涉及一种编码本发明的最小addobody的核酸。本发明进一步提供了一种包含编码最小addobody的所述核酸的载体，优选地所述核酸包含在表达盒中。进一步提供了一种含有所述最小addobody载体的重组宿主细胞。本发明进一步提供了一种用于产生本发明的最小addobody的方法，其包括以下步骤：在允许最小addobody表达的条件下，培养在表达盒中含有最小addobody编码序列的载体，以及可选地从宿主细胞中纯化最小addobody。
[0106]
如下文进一步更详细描述的，如本文所定义的“异源修饰”可以是与相应天然存在的序列相比的相应位点(rgd环区域、v环、底层位点、b环)的任何修饰，优选如在腺病毒五邻体基座蛋白中所发现的。优选地，异源修饰选自由以下组成的组：与片段a和/或b的野生型序列相比的一个或多个单氨基酸突变、一个或多个异源氨基酸和/或氨基酸伸展段对野生型氨基酸伸展段的一个或多个取代、异源氨基酸伸展段的一个或多个插入、一个或多个氨基酸的一个或多个缺失和一个或多个氨基酸修饰及其任何组合。通常，根据本发明的优选的修饰是用非腺病毒氨基酸序列、优选非腺病毒寡核苷酸、多肽、蛋白质和/或蛋白质复合物插入和/或取代如本文所定义的位点的野生型腺病毒序列的氨基酸残基。
[0107]
点突变(能够存在一个或多个，优选在如本文所定义的片段a和/或b的相应位点中)可以例如通过偶联残基取代氨基酸，该偶联残基即具有能够与结合配偶体形成共价键的侧链的天然或非天然存在的氨基酸，例如，另一偶联残基存在于待偶联至偶联残基的另一多肽上或在本发明的片段a和/或b中和/或连接子l中和/或在片段n中和/或在根据本发明的多肽的片段c中。后者可以分别用于稳定addobody或最小addobody的结构，或通过稳定本发明多肽的二聚体、十聚体、五聚体和/或十二面体(例如，经由头对尾、头对头或头对尾排列)。优选的偶联残基是氨基酸d、e、k和c，其中c是特别优选的，因为在本领域已知合适的氧化还原条件下它可以容易地与另一个c形成二硫键。
[0108]
根据优选实施方案，异源修饰提供了靶特异性结合实体。
[0109]
在本发明的优选实施方案中，靶特异性结合实体选自由以下组成的组：抗原、表位、cdr、抗体、抗体片段(例如抗原结合(fab)片段、fab’片段、f(ab’)2片段)、重链抗体、单域抗体(sdab)、单链可变片段(scfv)、可变片段(fv)、vh结构域、vl结构域、单域抗体、纳米抗体、ignar(免疫球蛋白新抗原受体)、di-scfv、双特异性t细胞接合器(bite)、双亲和重靶向(dart)分子、二价抗体(triple body)、二价抗体(diabody)、单链二价抗体、互补位、替代支架蛋白、以及其融合蛋白。
[0110]
根据本发明，互补位(也称为抗体的抗原结合位点)是识别和结合抗原、更特别是抗原的表位的抗体的一部分。它通常是短的氨基酸伸展段，通常为5至10个氨基酸，其是抗体的fab区域的一部分。
[0111]
根据本发明的特定多肽具有以下氨基酸序列(从n-末端至c-末端)：
[0112]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp
[0113]
(seq id no:27)
[0114]
根据seq id no:27的本发明上述多肽的变体具有以下氨基酸序列(从n-末端至c-末端)：
[0115]
gamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp
[0116]
(seq id no:32)
[0117]
根据本发明的另一特定多肽具有以下氨基酸序列(从n-末端至c-末端)：
[0118]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgtimhtnmpnvnefmysnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedileyewvefelpegnfsvtmtidlmnnaiidnylavgrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpvtelvmpgvytneafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrqpfqegfqimyedleggnipalldvdayekskkdtttetttkkelkiqpvekdskdrsynvlpdkintayrswylaynygdpekgvrswtllttsdvtcgveqaellpvysksffneqavysqqlraftslthvfnrfpenqilvrppaptittvsenvp
[0119]
(seq id no:28)
[0120]
根据seq id no:27的本发明上述多肽的变体具有以下氨基酸序列(从n-末端至c-末端)：
[0121]
qgtimhtnmpnvnefmysnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedileyewvefelpegnfsvtmtidlmnnaiidnylavgrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpvtelvmpgvytneafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrqpfqegfqimyedleggnipalldvdayekskkdtttetttkkelkiqpvekdskdrsynvlpdkintayrswylaynygdpekgvrswtllttsdvtcgveqaellpvysksffneqavysqqlraftslthvfnrfpenqilvrppaptittvsenvp
[0122]
(seq id no:33)
[0123]
本发明进一步涉及一种编码根据本发明的多肽的核酸。
[0124]
还提供了一种包含本发明的核酸(其与编码本发明的多肽的核苷酸序列同义)的载体。载体可以在表达盒内含有该核酸(或核苷酸序列)。
[0125]
本发明还提供了一种包含所述核酸或所述载体的重组宿主细胞。
[0126]
此外，本发明还涉及一种用于生产根据本发明的多肽的方法，其包括在允许所述多肽表达的条件下培养含有所述载体的宿主细胞的步骤，该载体包含在表达盒中的所述核酸。生产方法优选包括从培养的宿主细胞中纯化多肽的步骤。
[0127]
本发明还提供了一种工程化腺病毒五邻体基座蛋白，其包含本发明的多肽(即addobody或最小addobody)，该多肽包含一个或多个异源修饰，优选至少在底层区域和/或b环(相对于包含addobody的工程化五邻体基座蛋白)中的一个或多个异源修饰，或优选至少
在底层区域(相对于包含最小addobody的工程化五邻体基座蛋白)中的一个或多个异源修饰，其与腺病毒五邻体基座蛋白的多聚化结构域(果冻卷折叠结构域)融合。优选地，多聚化结构域选自腺病毒，腺病毒选自人腺病毒血清型2(had2)、人腺病毒血清型3(had3)、人腺病毒血清型4(had4)、人腺病毒血清型5(had5)、人腺病毒血清型7(had7)、人腺病毒血清型11(had11)、人腺病毒血清型12(had12)、人腺病毒血清型17(had17)、人腺病毒血清型25(had25)、人腺病毒血清型35(had35)、人腺病毒血清型37(had37)、人腺病毒血清型41(had41)、大猩猩腺病毒(gorad)、黑猩猩腺病毒(chimpad)、猿腺病毒血清型18(sad18)、猿腺病毒血清型20(sad20)、猿腺病毒血清型49(sad49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhad51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhad52)和恒河猴腺病毒血清型53(rhad53)。
[0128]
包含本发明的addobody多肽的本发明的工程化五邻体基座蛋白通常具有根据以下式(iii)的结构(从n-末端至c-末端)：
[0129]
d-a-e-b-f(iii)
[0130]
其中，a和b是如上所定义的α-螺旋冠型结构域的片段，d、e和f是腺病毒五邻体基座的形成多聚化(果冻卷折叠)结构域的氨基酸序列，其中一个或多个异源修饰存在于片段a的底层区域和/或片段b的b环中。
[0131]
包含本发明的最小addobody多肽的本发明的工程化五邻体基座蛋白通常具有根据以下式(iv)的结构(从n-末端至c-末端)：
[0132]
d-a-e-li-f(iv)
[0133]
其中，a是如上所定义的α-螺旋冠型结构域的大片段，d、e和f是腺病毒五邻体基座的形成多聚化(果冻卷折叠)结构域的氨基酸序列，其中可选地且优选地，一个或多个异源修饰存在于片段a的底层区域，并且其中li是选自肽、寡肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合物的连接子。作为li的优选连接子选自寡肽连接子，例如具有4至10个氨基酸(即4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)、优选具有氨基酸g和s的寡肽。优选示例是gggs(seq id no:37)。另一示例是由g和s组成并且具有多个ggs重复(例如2个、3个、4个、5个或更多ggs重复)的连接子。这种类型的特别优选的连接子是ggsggs(seq id no:38)。
[0134]
形成多聚化结构域的优选氨基酸序列取自seq id no:1至seq id no:20的腺病毒五邻体基座序列。
[0135]
片段d、a和f的更优选氨基酸序列的特征如下：
[0136]
根据本发明的优选实施方案，通式(iii)和/或(iv)的氨基酸伸展段d具有以下共有序列(seq id no:34)：
[0137]
(u)
1-47
ptj1grnsiry sj2j3x4pj5j6dtt j7j8ylvdnksa diaslnyqnd
[0138]
hsnfj5ttvj9q nndj
10j11
pj
12
eaj
13 tqtinj
14
dj
15
rs rwgj
16j17
lktij
18
[0139]j19
tz1z2z3z4z5z6z7z
8 z9z
10z11z12z13z14z15
[0140]
其中：氨基酸伸展段d结束于c-末端侧上在z1之前的残基t处或在z1至z
15
中的氨基酸处；
[0141]
u是任意氨基酸或无氨基酸；
[0142]
j1为e或g；
[0143]
j2为e或s；
[0144]
j3为l或v；
[0145]
j4为a或s；
[0146]
j5为l或q；
[0147]
j6为y或e；
[0148]
j7为r或k；
[0149]
j8为v或l；
[0150]
j9为v或i；
[0151]j10
为f或y；
[0152]j11
为t或s；
[0153]j12
为a或t或i或g；
[0154]j13
为s或g；
[0155]j14
为f或l；
[0156]j15
为e或d；
[0157]j16
为a或g；
[0158]j17
为d或q；
[0159]j18
为l或m；
[0160]j19
为h或r；
[0161]
z1如果存在，则为n；
[0162]
z2如果存在，则为m；
[0163]
z3如果存在，则为p；
[0164]
z4如果存在，则为n；
[0165]
z5如果存在，则为v或i；
[0166]
z6如果存在，则为n；
[0167]
z7如果存在，则为e或d；
[0168]
z8如果存在，则为y或f；
[0169]
z9如果存在，则为m；
[0170]z10
如果存在，则为f或s或y；
[0171]z11
如果存在，则为t或s；
[0172]z12
如果存在，则为s或n；
[0173]z13
如果存在，则为k；
[0174]z14
如果存在，则为f；
[0175]z16
如果存在，则为k。
[0176]
片段d的更优选氨基酸序列在以下表3中概述：
[0177]
表3：通式(iii)和(iv)的片段d的优选序列
[0178][0179]
根据本发明的另一优选实施方案，上述通式(iii)和/或(iv)的氨基酸伸展段e具有以下序列(seq id no:35)：
[0180]z17z18z19z20z21z22z23z24z25z26 z
27
qvywslpdj
20 mj
21
dpvtfrst j
22
qj
23j24
nj
25
pvvgj
26 elz
28z29z30
[0181]
其中：氨基酸伸展段e起始于n-末端侧上在z
17
至z
27
中的氨基酸处或在z
27
之后的氨基酸q处；
[0182]
氨基酸伸展段b结束于c-末端侧上在z
28
之前的氨基酸l处或在z
28
至z
30
中的氨基酸处；
[0183]z17
如果存在，则为l或s
[0184]z18
如果存在，则为t或p或c
[0185]z19
如果存在，则为t或p
[0186]z20
如果存在，则为p或s或a或r
[0187]z21
如果存在，则为n或d
[0188]z22
如果存在，则为g或v
[0189]z23
如果存在，则为h或t
[0190]z24
如果存在，则为c
[0191]z25
如果存在，则为g
[0192]z26
如果存在，则为a或v或s
[0193]z27
如果存在，则为e或q
[0194]j20
为l或m
[0195]j21
为q或k
[0196]j22
为q或r或s
[0197]j23
为v或i
[0198]j24
为s或n
[0199]j25
为y或f
[0200]j26
为a或v
[0201]z28
如果存在，则为m或l
[0202]z29
如果存在，则为p
[0203]z30
如果存在，则为v或f
[0204]
片段e的更优选氨基酸序列在以下表4中概述：
[0205]
表4：通式(iii)和(iv)的片段e的优选序列
[0206]
[0207][0208]
根据本发明的另一优选实施方案，上述通式(iii)和/或(iv)的片段f具有以下序列(seq id no:36)：
[0209]z31z32z33
altdhgt lplrssij
27
gv qrvtj
28
tdarr rtcpyvyka lgivj
30
pj
31
vls srtf
[0210]
其中：氨基酸伸展段f起始于n-末端侧上在z
31
至z
33
中的氨基酸处或在z
33
之后的氨基酸a处；
[0211]z31
如果存在，则为n
[0212]z32
如果存在，则为v
[0213]z33
如果存在，则为p
[0214]j27
为r或s或g
[0215]j28
为v或i
[0216]j29
为y或h
[0217]j30
为a或s
[0218]j31
为r或k
[0219]
片段f的更优选氨基酸序列在以下表5中概述：
[0220]
表5：通式(iii)和(iv)的片段f的优选序列
[0221][0222]
应理解，优选选择根据通式(iii)的本发明的工程化腺病毒五邻体基座的片段a、b、d、e和f中的每一个的起始和结束氨基酸，使得当与seq id no:1至seq id no:20所示的序列相比时，形成从一个片段至下一个片段的过渡的残基优选地不重叠。
[0223]
还应理解，优选选择根据通式(iv)的本发明的工程化腺病毒五邻体基座的片段a、d、e和f中的每一个的起始和结束氨基酸，使得当与seq id no:1至seq id no:20所示的序列相比时，形成从一个片段至下一个片段的过渡的残基优选不重叠。
[0224]
根据式(iii)的本发明的工程化五邻体基座蛋白的片段a、b、d、e和f优选由相同腺病毒血清型的氨基酸序列组成，但也考虑嵌合体。
[0225]
根据式(iv)的本发明的工程化五邻体基座蛋白的片段a、d、e和f优选由相同腺病毒血清型的氨基酸序列组成，但也考虑嵌合体。
[0226]
本发明还提供了本发明的工程化腺病毒五邻体基座蛋白、优选式(iii)或(iv)的五邻体基座蛋白、最优选式(iii)的五邻体基座蛋白的五聚体复合物。
[0227]
本发明进一步涉及病毒样颗粒(vlp)，其包含本发明的工程化腺病毒五邻体基座蛋白的12个五聚体复合物。
[0228]
本发明还提供了如本文所定义的具有如本文所概述的一个或多个异源修饰的多肽和/或含有这种如本文所定义的具有一个或多个异源修饰的多肽的vlp作为药物的用途。
[0229]
本发明还提供了药物组合物，其包含：如本文所定义的具有如本文所概述的一个或多个异源修饰的多肽和/或含有这种如本文所定义的具有一个或多个异源修饰的多肽的vlp，以及任选的至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0230]
本发明进一步提供了一种用于生产如本文所公开的vlp、优选由如本文定义的含有一个或多个异源修饰的多肽组成的vlp的方法，其包括在允许多肽组装成vlp的条件下孵育根据本发明的多肽、优选如本文所定义的包含一个或多个异源修饰的多肽的溶液的步骤。
[0231]
本发明还提供了如本文所定义的具有如本文概述的一个或多个异源修饰的多肽和/或含有这种如本文所定义的具有一个或多个异源修饰的多肽的vlp在治疗和/或预防感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤或癌症中的用途。
[0232]
本发明还涉及一种鉴定靶分子的结合序列的方法，其包括以下步骤：
[0233]
(i)制备载体的文库，每个载体含有编码根据本发明的多肽的核苷酸序列，该多肽在表达盒中具有候选结合序列，由所述核苷酸序列编码的每个多肽在如本文所定义的位点(rgd环和/或v环和/或底层区域和/或b环)中的一个或多个中包含作为异源修饰的候选结合序列，其中由每个载体中的核苷酸序列编码的候选结合序列不同(即载体优选含有编码随机化候选结合序列的核苷酸序列的随机化文库)；
[0234]
(ii)在宿主细胞或无细胞体系中表达由核苷酸序列编码的多肽；
[0235]
(iii)可选地在从宿主细胞或无细胞体系纯化之后，使步骤(ii)中表达的多肽与靶分子接触；以及
[0236]
(iv)检测已经与靶分子结合的多肽。
[0237]
更特别地，上述步骤(i)可以是以下步骤(ia)和(ib)中的一个：
[0238]
(ia)制备载体的文库，每个载体含有编码多肽的核苷酸序列，该多肽在表达盒中具有候选结合序列，由所述核苷酸序列编码的每个多肽在如上所定义的rgd环区域和/或v环和/或底层区域和/或b环中的一个或多个中包含作为异源修饰的候选结合序列，即所述文库中的核苷酸序列编码如本文所定义的addobody，其中，由每个载体中的核苷酸序列编码的候选结合序列不同，使得载体含有编码随机候选结合序列的核苷酸序列的随机化文库；或
[0239]
(ib)制备载体的文库，每个载体含有编码多肽的核苷酸序列，该多肽在表达盒中具有候选结合序列，由所述核苷酸序列编码的每个多肽在如上所定义的rgd环区域和/或v环和/或底层区域中的一个或多个中包含作为异源修饰的候选结合序列，即所述文库中的核苷酸序列编码如本文所定义的最小addobody(也称为“miniaddobody”)，其中，由每个载体中的核苷酸序列编码的候选结合序列不同，使得载体含有编码随机化候选结合序列的核苷酸序列的随机化文库。
[0240]
该方法优选进一步包括确定与靶分子结合的多肽的解离常数(kd)的步骤。
[0241]
如在本发明的上下文中使用的术语“特异性结合”是指结合部分(例如抗体)更强
地结合靶(例如表位)，与结合另一靶相比，如果其以低于第二靶的解离常数的解离常数(kd)结合第一靶，则该结合部分是特异性的。靶能够由它们的配体识别，该配体以一定的亲和力结合其靶，因此，结合其相应靶的配体会导致生物效应。优选地，结合既是特异性的又以高亲和力发生，优选kd小于10-7
m、10-8
m、10-9
m、10-10
m或更小。这种亲和力优选在37℃下测量。合适的试验包括表面等离子体共振测量(例如biacore)、石英晶体微天平测量(例如attana)以及竞争试验。
[0242]
如本文所用，术语“kd”(通常以“mol/l”为单位测量，有时缩写为“m”)旨在指结合部分(例如抗体或其片段)与靶分子(例如其抗原或表位)之间的特定相互作用的解离平衡常数。确定kd的方法包括但不限于elisa和表面等离子体共振试验。
[0243]
上述鉴定方法也能够作为进化过程提供，其中在随后轮的文库制备(其中修饰先前每轮的候选序列，以便提供与靶分子的改善的结合)、表达、与靶的接触中进一步优化鉴定出的与靶结合的序列，可选地随后确定解离常数，使得在随后每轮中选择改进的结合候选物，直到实现预定的最小解离常数，例如优选指示候选序列与靶的特异性结合的解离常数，或直到解离常数与先前一轮相比没有进一步改进，通常没有进一步降低。
[0244]
然后，分别编码因此选定和/或优化的含有优选最终优化的结合序列的addobody(或最小addobody)的核苷酸序列能够例如通过分别使用在编码优化的addobody或最小addobody的片段中的合适的限制性内切酶位点与编码相同或不同、优选相同的腺病毒五邻体基座的多聚化结构域的核酸融合以及与在表达盒中含有该核苷酸序列的载体融合。然后将分别编码优选优化的addobody或最小addobody的核酸与编码多聚化结构域的核苷酸序列成一直线插入，以便在表达盒内生成完整的addobody-多聚化结构域(或最小addobody-多聚化结构域)构建体(即根据本发明的工程化五邻体基座蛋白)。然后，能够将载体导入合适的宿主细胞中，并且能够大量表达和纯化构建体(也称为工程化腺病毒五邻体底)。然后，能够从纯化的工程化腺病毒五邻体基座制备vlp，其包括选定/优化的结合序列的多个拷贝(如果对于vlp中每个五邻体基座，结合序列以单拷贝存在，则多达60个拷贝)，从而例如针对抗原(或其表位)的结合序列而言导致改进对靶分子的识别。当然，该体系能够用于任何结合配偶体，例如抗原或抗体或如本文进一步详述的这种实体的片段。
[0245]
本发明还提供了本发明的addobody的五聚体。此外，本发明提供了由两个addobody五聚体组成的本发明的addobody的十聚体。
[0246]
应理解，本文所公开的所有工程化蛋白质和多肽也能够在本领域已知的无细胞表达体系中从相应的表达载体表达。
[0247]
根据本发明的另一方面，提供了工程化五邻体基座蛋白，其中所述蛋白在以下序列中包含异源修饰：(从n-末端至c-末端)
[0248]
片段a的x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-d-x
7-x
8-x
9-s-y-n-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16
(seq id no:21)(也称为“底层位点”或“底层区域”)，其中
[0249]
x1为i或l，优选为i；
[0250]
x2选自由k、q和e组成的组，优选为q；
[0251]
x3为p或a，优选为p；
[0252]
x4选自由l、v和i组成的组，优选为l；
[0253]
x5选自由t、e、a、k和l组成的组，优选为e；
[0254]
x6选自由e、k、t和q组成的组，优选为k；
[0255]
x7选自由s、p和d组成的组，优选为s；
[0256]
x8选自由k、t和s组成的组，优选为k；
[0257]
x9选自由k、s、n、g和d组成的组，优选为s；
[0258]
x
10
为l或v，优选为v；
[0259]
x
11
为i或l，优选为i；
[0260]
x
12
选自由s、e和p组成的组，优选为e；
[0261]
x
13
为无氨基酸(即不存在)或为n，优选为无氨基酸；
[0262]
x
14
为d或g，优选为d；
[0263]
x
15
选自由s、k、q和t组成的组，优选为k；并且
[0264]
x
16
选自由t、n、i、k和m组成的组，优选为i；和/或
[0265]
片段b(也称为“b环”)的以下序列(从n-至c-末端)t-h-v-f-x
17-r-f-p(seq id no:22)，其中x
17
为d或n，优选为n。
[0266]
根据本发明的连接子l(式(i))可以选自寡肽连接子，例如具有4至10个氨基酸(即4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的寡肽。还考虑了多于10个氨基酸(通常为11至50个氨基酸)的较大寡肽。连接子l也可以是多肽、蛋白质或蛋白质复合物，条件是连接子l不干扰addobody的正确折叠和稳定性。这同样适用于如本文所定义的片段n和c。根据本发明的优选实施方案，如本文所定义的连接子l可以选自氨基酸序列(从n-末端至c-末端)gamgsgiq(seq id no:29)和gangdsgn(seq id no:20)。
[0267]
如在本发明的上述实施方案中已经概述的(参见表1和2)，本发明的片段a和/或b以及工程化腺病毒五邻体基座蛋白优选基于各自独立地衍生自五邻体基座序列的氨基酸序列，五邻体基座序列选自人腺病毒血清型2(had2)、人腺病毒血清型3(had3)、人腺病毒血清型4(had4)、人腺病毒血清型5(had5)、人腺病毒血清型7(had7)、人腺病毒血清型11(had11)、人腺病毒血清型12(had12)、人腺病毒血清型17(had17)、人腺病毒血清型25(had25)、人腺病毒血清型35(had35)、人腺病毒血清型37(had37)、人腺病毒血清型41(had41)、大猩猩腺病毒(gorad)、黑猩猩腺病毒(chimpad)、猿腺病毒血清型18(sad18)、猿腺病毒血清型20(sad20)、猿腺病毒血清型49(sad49)、恒河猴腺病毒血清型51(rhad51)、恒河猴腺病毒血清型52(rhad52)和恒河猴腺病毒血清型53(rhad53)的五邻体基座。
[0268]
上述指出的腺病毒五邻体基座的优选氨基酸序列在通常可访问的数据库(例如uniprot和uniprote)中列出，本文提及的上述腺病毒亚型的特别优选的序列在以下各项中列出：uniprot acc.no.q2y0h9(人腺病毒血清型3；seq id no:1)、uniprot acc.no.p03276(人腺病毒血清型2；seq id no:2)、uniprot acc.no.q2ksf3(人腺病毒血清型4；seq id no:3)、uniprot acc.no.p12538(人腺病毒血清型5；seq id no:4)、uniprot acc.no.q9jft6(人腺病毒血清型7；seq id no:5)、uniprot acc.no.d2dm93(人腺病毒血清型11；seq id no:6)、uniprot acc.no.p36716(人腺病毒血清型12；seq id no:7)、uniprot acc.no.f1dt65(人腺病毒血清型17；seq id no:8)、uniprot acc.no.m0quk0(人腺病毒血清型25；seq id no:9)、uniprot acc.no.q7t941(人腺病毒血清型35；seq id no:10)、uniprot acc.no.q912j1(人腺病毒血清型37；seq id no:11)、uniprot acc.no.f8wqn4(人腺病毒血清型41；seq id no:12)、uniprot acc.no.e5l3q9(大猩猩腺病毒；seq id no:
snfpvvgtellpvhaksfyn eqavysqlir qstalthvfn rfpenqilvr ppaptittvsenvpaltdhg tlplrssisg vqrvtitdar rrtcpyvyka lgvvapkvlssrtf
[0311]
本发明的多肽不限于分别形成上述提及的腺病毒亚型血清型的α-螺旋结构域的氨基酸伸展段a(最小addobody)或a和b(addobody)的已知特异性序列。如下文进一步概述的，氨基酸片段a和b也能够与已知腺病毒五邻体基座原聚体的序列具有类似的氨基酸序列，只要a和b的序列使得所得多肽在合适条件下采用构象稳定的冠型或最小冠型结构域。通常，片段a和b的这种类似序列与已知腺病毒五邻体基座的相应氨基酸序列、优选seq id no:1至seq id no:20的那些序列、更优选如表1和2中所提供的氨基酸伸展段a和b共有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的氨基酸序列同一性，条件是，在rgd区域和/或v环和/或底层区域和/或b环中存在一个或多个异源修饰的本发明的实施方案中，如上概述的所述序列同一性应理解为参照优选如上概述的序列的腺病毒五邻体基座片段a和b，不包括所述rgd环区域和/或所述v环和/或所述底层区域和/或所述b环。此外关于片段d、e和f，应理解，这些片段能够各自具有与已知腺病毒五邻体基座序列的相应部分类似的氨基酸序列，并且上文给出的对于片段a和b的优选序列同一性值也适用于片段d、e和f。
[0312]
如本文所用，如果没有另外特别指出的话，氨基酸序列使用iupac的单字母代码从n至c末端表述。
[0313]
本发明特别优选的addobody是基于人腺病毒血清型3(had3)的五邻体基座蛋白。对于关于seq id no:1的氨基酸位置的优选序列，参照表1(分别为大片段或片段a)和表2(分别为小片段或片段b)。这同样适用于分别关于大片段或片段a的最小addobody。
[0314]
本发明的特别优选的addobody是基于黑猩猩腺病毒(chimpad)的五邻体基座蛋白。对于关于seq id no:14的氨基酸位置的优选序列，参照表1(分别为大片段或片段a)和表2(分别为小片段或片段b)。这同样适用于分别关于大片段或片段a的最小addobody。
[0315]
如上概述的，本发明的一个首要实施方案是将一种或多种抗原或其一种或多种表位、更特别是感染原(例如病毒、细菌或其他病原体)的一种或多种抗原或其一种或多种表位、或者肿瘤或癌症抗原或其一种或多种表位分别包括在优选存在于如上所定义的本发明的addobody或最小addobody的片段a和/或b中的位点中的一个或多个中。如本文所用，术语“抗原”或“抗原的表位”是指由免疫应答的分子(例如抗体、t细胞受体(tcr)等)识别的结构。在本上下文中，其还明确指wo2017/167988a1中公开的“抗原”和“表位”的定义(抗原：第16页，表位：第15页和第16页)。存在于多肽或工程化腺病毒基座原聚体中的异源修饰也可以是相应天然存在的表位的模拟表位。
[0316]
感染原的抗原或其表位分别包括但不限于例如病毒感染原，例如hiv、肝炎病毒(例如甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒)、疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、风疹病毒、黄热病病毒、登革热病毒、黄病毒(例如寨卡病毒)、流感病毒、马尔堡病病毒、埃博拉病毒以及虫媒病毒(例如基孔肯雅病毒)。细菌感染原的抗原包括但不限于例如军团菌属(legionella)、螺杆菌属(helicobacter)、弧菌属(vibrio)、感染性大肠杆菌菌株、葡萄球菌属(staphylococci)、沙门氏菌属(salmonella)和链球菌属(streptococci)的抗原。感染性原生动物病原体的抗原包括但不限于疟原虫属(plasmodium)、锥虫属(trypanosoma)、利什曼原虫属(leishmania)和弓形虫属(toxoplasma)的抗原。病原体的抗原的其他示例包括
真菌病原体的抗原，例如新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)和白色念珠菌(candida albicans)的抗原。
[0317]
根据本发明能够使用的肿瘤抗原或其表位的具体示例包括但不限于707-ap、afp、art-4、bage、β-连环蛋白/m、bcr-abl、camel、cap-1、casp-8、cdc27/m、cdk4/m、cea、ct、cyp-b、dam、elf2m、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gp100、hage、her-2/neu、hla-a*0201-r170i、hpv-e7、hsp70-2m、hast-2、htert(或htrt)、ice、kiaa0205、lage、ldlr/fut、mage、mart-1/melan-a、mc1r、肌球蛋白/m、muc1、mum-1、mum-2、mum-3、na88-a、ny-eso-1、p190minor bcr-abl、pml/rarα、prame、psa、psm、rage、ru1或ru2、sage、sart-1或sart-3、tel/aml1、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2以及wt1。
[0318]
本发明的多肽的进一步实施方案涉及多肽，其中如本文所定义的用于异源修饰的片段a和/或b的位点中的至少一个含有抗体序列或抗体的部分，例如抗体片段。在本发明的上下文中，术语“抗体”是特异性结合抗原的免疫球蛋白。
[0319]
术语“抗体片段”是指保留完整抗体与抗原特异性结合能力的抗体的一部分。抗体片段的示例包括但不限于互补位、fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、重链抗体、单域抗体(sdab)、scfv片段、可变片段(fv)、vh结构域、vl结构域、纳米抗体、ignar(免疫球蛋白新抗原受体)、di-scfv、双特异性t细胞接合器(bite)、双亲和重靶向(dart)分子、三价抗体(triple bodies)、二价抗体(diabodies)、单链二价抗体等。
[0320]“二价抗体”是能够结合不同抗原的融合蛋白或双价抗体。二价抗体由两条单蛋白质链(通常两条scfv片段)组成，每条链包含抗体的可变片段。因此，二价抗体包含两个抗原结合位点，并且因此能够靶向相同(单特异性二价抗体)或不同的抗原(双特异性二价抗体)。
[0321]
如在本发明的上下文中使用的术语“单域抗体”是指由抗体的单个单体可变结构域组成的抗体片段。简单地，它们仅包含由骆驼科动物或软骨鱼产生的重链抗体的单体重链可变区。由于它们的来源不同，它们也被称为vhh或vnar(可变的新抗原受体)片段。可替代地，单域抗体能够通过使用基因工程将常规小鼠或人抗体的可变结构域单体化而获得。它们的分子量约为12-15kda，因此是能够识别抗原的最小抗体片段。其他示例包括纳米抗体(nanobodies or nanoantibodies)。
[0322]
在本发明的上下文中有用的抗原结合实体还包括“抗体模拟物”，如本文所用，其表达是指类似于抗体特异性结合抗原的化合物，但该化合物在结构上与抗体无关。通常，抗体模拟物是摩尔质量为约3kda至20kda的人工肽或蛋白质，其包含一个、两个或更多个特异性结合抗原的暴露结构域。示例尤其包括laci-d1(脂蛋白相关凝血抑制剂)；亲和蛋白(affilin)，例如人-γb晶体或人泛素；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；来自嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)的sac7d；脂质运载蛋白和衍生自脂质运载蛋白的anticalin；darpin(设计的锚蛋白重复结构域)；fyn的sh3结构域；蛋白酶抑制剂的kunit结构域；单体，例如纤连蛋白的第10个iii型结构域；adnectin：knottin(半胱氨酸结小蛋白)；atrimer；evibody(例如基于ctla4的结合子)、亲合体(affibody)(例如来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的蛋白a的z-结构域的三螺旋束)；反式体(trans-body)，例如人转铁蛋白；四连接素，例如单体或三聚体的人c型凝集素结构域；微体，例如胰蛋白酶抑制
剂ii；亲和蛋白；犰狳重复蛋白。有时也将核酸和小分子认为是抗体模拟物(适配体)，但不是人工抗体、抗体片段和由这些组成的融合蛋白。优于抗体的共同优点是更好的溶解性、组织穿透性、对热和酶的稳定性，以及生产成本相对低。
[0323]
特别是在抗原或其表位以及抗体或抗体片段的上下文中，而且关于任何蛋白质-蛋白质相互作用(例如受体-配体结合)，包括在本发明多肽中的用于分别在addobody或最小addobody的片段a和/或片段b中异源修饰的位点中的一个或多个中，而且关于任何蛋白质-蛋白质相互作用(例如受体-配体结合)，可能包括选择和/或进化过程，用于提供靶结合优化的序列，例如优化的抗原或其表位，以对其发挥改进的免疫应答(参见图2)，或用于提供针对抗原或其表位的优化的识别序列，特别是用于生成具有针对抗原或表位的多个结合位点的分子(图1)。
[0324]
在本发明的上下文中优选的选择/优化过程是文献schaffitzel et al.(2001):protein-protein interactions,a molecular cloning manual:in vitro selection and evolution of protein-ligand interaction by ribosome display(golemis e.,ed.),pages 535-567,cold spring harbor laboratory press,new york中详细概述的核糖体展示。核糖体展示方案具有选择过程的所有步骤完全在体外进行的优点。其他可能的选择过程也是本领域已知的，包括噬菌体展示(smith(1985)science 228,1315-1317；winter et al.(1994)annu.rev.immunol.12,433-455)、酵母双杂交系统(fields and song(1989)nature 340,245-246；chien et al.(1983)proc.natl.acad.sci.u.s.a.88,9578-9582)、细胞表面展示方法(georgiu et al.(1993)trends biotechnol.11,6-10；boder and wittrup(1997)nat.biotechnol.15,553-557)以及mrna展示、酵母展示和/或杆状病毒衣壳展示。
[0325]
核糖体展示过程基本上能够以两种方式用于优化抗原或其他氨基酸序列，该抗原或其他氨基酸序列是通过使用本发明的多肽靶向特定分子中涉及的。或者，用于选择和/或优化以结合靶分子的氨基酸序列能够首先从多肽序列的初始文库中选定，该初始文库能够大至10
14
个单独序列，更通常为109至10
10
个序列，可选地采用如上述schaffitzel et al(2001)中详细描述的进化程序。在选择与靶分子结合的优化序列之后，将编码它/它们的核苷酸序列克隆到本发明的合适载体中，使得多肽表达，其中优化氨基酸被包含在如上所定义的一个或多个位点(rdg区域和/或v环和/或底层区域和/或b环)中。
[0326]
根据本发明的该方面的替代实施方案，将潜在候选结合序列的文库直接克隆到本发明的核酸中，使得每个序列编码含有候选结合序列的多肽，候选结合序列被包含在如上所定义的一个或多个位点(rdg区域和/或v环和/或底层区域和/或b环)中。然后，包含候选结合序列的初始文库的本发明多肽通常在体外表达，根据如上述schaffitzel et al(2001)详细概述的核糖体展示方法，或者本领域已知的结合靶分子的候选氨基酸序列的任何其他合适的选择/进化方法(例如噬菌体展示、mrna展示、酵母展示和/或杆状病毒衣壳展示)来进行优化结合序列的选择。
[0327]
与天然五邻体基座蛋白一样，本发明的工程化腺病毒五邻体基座蛋白组装成五聚体复合物，在优选ph约5.0至约8.0的缓冲溶液中12个五聚体复合物又组装成病毒样颗粒(vlp)。优选示例是处于或接近生理条件的缓冲液条件，例如ph 7.4的pbs，或者ph7.2至7.6的tbs或tbs-t。在这种条件下，本发明的多肽在约20℃至约42℃的温度下形成vlp。本发明
还涉及这种五聚体复合物和vlp。
[0328]
本发明的进一步主题是编码如本文所定义的addobody、最小addobody或工程化腺病毒蛋白的核酸。
[0329]
根据本发明，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指dna、rna或含有一个或多个核苷酸类似物的物种。根据本发明的优选核酸或多核苷酸是dna，最优选是双链(ds)dna。如果没有另外指明使用的话，本发明的核苷酸序列从5’至3’示出，并且使用碱基的iupac单字母代码。
[0330]
还分别提供了本发明的核酸和载体的实施方案，用于插入通用异源修饰(例如，如本文所定义的寡肽、多肽、蛋白质等所体现的)。
[0331]
在本发明的该实施方案的上下文中，插入位点优选是限制性内切酶或归巢核酸内切酶的识别序列。
[0332]
限制性内切酶位点通常是本领域技术人员熟知的。优选示例如上所定义，但是限制性位点能够从较大范围中选定，并且能够在限制性内切酶的各种制造商处找到指导，例如美国马萨诸塞州伊普斯维奇市的纽英伦生物技术有限公司(new england biolabs,inc.)。
[0333]
归巢核酸内切酶(he)位点的示例包括但不限于pi-scei、i-ceui、i-ppoi、i-hmui、i-crei、i-dmoi、pi-pfui和i-msoi、pi-pspi、i-scei、其他laglidag组成员及其变体、segh和hef或其他giy-yig归巢核酸内切酶、i-apeii、i-anii、细胞色素b mrna成熟酶bl3、pi-tlii和pi-tfuii、pi-thyi等的识别序列；参见文献stoddard b.l.(2005)q.rev.biophys.38,49-95。相应的酶在市场上可获得，例如从美国马萨诸塞州伊普斯维奇市纽英伦生物技术有限公司获得。
[0334]
在本发明的优选实施方案中，上述所定义的核酸另外包含至少一个用于将该核酸整合到载体或宿主细胞中的位点。整合位点可以允许瞬时或基因组掺入。
[0335]
关于整合到载体中，特别是到质粒或病毒中，整合位点优选与核酸整合到腺病毒、腺伴随病毒(aav)、自主细小病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、逆转录病毒、细长病毒(rhadinovirus)、eb病毒(epstein-barr virus)、慢病毒、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)或杆状病毒中相容。
[0336]
可以掺入本发明的核酸的特别优选的整合位点能够选自tn7的转座子元件、λ-整合酶特异性附着位点和位点特异性重组酶(ssr)，特别是loxp位点或flp重组酶特异性重组(frt)位点。用于整合根据本发明的核酸的进一步优选机制是特异性同源重组序列，例如lef2-603/orf1629。
[0337]
在本发明的进一步优选实施方案中，如本文所述的核酸另外含有一种或多种抗性标记，用于针对其他有毒物质进行选择。在本发明的上下文中有用的抗性标记的优选示例包括但不限于抗生素，例如氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、壮观霉素和卡那霉素抗性标记。
[0338]
本发明的核酸还可以含有一个或多个核糖体结合位点(rbs)。
[0339]
本发明的进一步主题涉及包含如上所定义的核酸的载体。
[0340]
本发明的优选载体是质粒、表达载体、转移载体，更优选的是真核基因转移载体、瞬时或病毒载体介导的基因转移载体。根据本发明的其他载体是病毒，例如腺病毒载体、腺伴随病毒(aav)载体、自主细小病毒载体、单纯疱疹病毒(hsv)载体、逆转录病毒载体、细长
病毒载体、eb病毒载体、慢病毒载体、塞姆利基森林病毒载体和杆状病毒载体。
[0341]
适于整合根据本发明的核酸(例如存在于合适的质粒(例如转移载体)上)的杆状病毒载体也是本发明的主题，并且优选含有位点特异性整合位点，例如tn7附着位点(其可以嵌入lacz基因中，用于生产性整合的蓝/白筛选)和/或loxp位点。根据本发明的进一步优选的杆状病毒含有(作为上述整合位点的替代或补充)表达对宿主有毒的物质的基因，该基因两侧为用于同源重组的序列。表达有毒物质的基因的示例是白喉毒素a基因。用于同源重组的优选序列对是例如lsf2-603/orf1629。杆状病毒还能够含有如上所述的其他标记基因，还包括荧光标记，例如gfp、yfp等。相应杆状病毒的具体示例例如在wo2010/100278a1中所公开的。
[0342]
在wo2005/085456a1中公开了用于本发明的其他适用载体。
[0343]
优选地除了上述例示的标记基因(其一种或多种)之外，在原核宿主细胞中有用的载体包含复制起点(ori)。示例是br322、cole1和条件性复制起点，例如oriv和r6kγ，后者是优选的条件性复制起点，其使得本技术的载体的增殖依赖于原核宿主中的pir基因。oriv使得本技术的载体的增殖依赖于原核宿主中的trfa基因。
[0344]
此外，本发明涉及一种含有本发明的核酸和/或本发明的载体的(重组)宿主细胞。
[0345]
宿主细胞可以是原核或真核的。真核宿主细胞可以是例如哺乳动物细胞，优选人细胞。人宿主细胞的示例包括但不限于hela、huh7、hek293、hepg2、kato-iii、imr32、mt-2、胰腺β-细胞、角化细胞、骨髓成纤维细胞、chp212、原代神经细胞、w12、sk-n-mc、saos-2、wi38、原代肝细胞、flc4、143tk、dld-1、胚胎肺成纤维细胞、原代包皮成纤维细胞、mrc5以及mg63细胞。本发明进一步优选的宿主细胞是猪细胞(优选cpk、fs-13、pk-15细胞)、牛细胞(优选mdb、bt细胞)、牛细胞(例如fll-yft细胞)。在本发明的上下文中有用的其他真核细胞是秀丽隐杆线虫(c.elegans)细胞。其他真核细胞包括酵母细胞，例如酿酒酵母(s.cerevisiae)、裂殖酵母(s.pombe)、白色念珠菌(c.albicans)和巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)。此外，本发明涉及作为宿主细胞的昆虫细胞，其包括来自草地贪夜蛾(s.frugiperda)的细胞，更优选sf9、sf21、express sf+、high five h5细胞，以及来自黑腹果蝇(d.melanogaster)的细胞，特别是s2 schneider细胞。其他宿主细胞包括盘基网柄菌(dictyostelium discoideum)细胞和来自寄生虫(例如利什曼原虫物种(leishmania spec))的细胞。
[0346]
根据本发明的原核宿主包括细菌，特别是大肠杆菌，例如在市场上可获得的菌株，如top10、dh5α、hb101、bl21(de3)等。
[0347]
本领域技术人员能够容易地选择合适的载体构建体/宿主细胞对，用于将根据本发明的核酸元件合适地增殖和/或转移到合适的宿主中。用于将合适的载体元件和载体导入合适的宿主细胞的具体方法同样是本领域已知的，该方法能够在美国纽约约翰
·
威利父子出版公司(john wiley&sons)ausubel等人(编辑)的最新版分子生物学现代方案(current protocols in molecular biology)中找到。
[0348]
在本发明的优选实施方案中，如上所定义的载体另外包含位点特异性重组酶(ssr)的位点，优选用于cre-lox特异性重组的一个或多个loxp位点。在进一步优选的实施方案中，根据本发明的载体包含转座子元件，优选tn7附着位点。
[0349]
进一步优选地，如上所定义的附着位点位于标记基因内。这种排列使得可以通过
转座来选择成功整合到附着位点的序列。根据优选实施方案，这种标记基因选自荧光素酶、β-gal、cat、荧光编码蛋白基因(优选gfp、bfp、yfp、cfp及其变体)和laczα基因。
[0350]
本发明还提供了多肽、编码这种多肽的核酸、含有编码多肽的核酸的载体、包含这种载体的宿主细胞以及如上所定义的vlp作为药物、特别是在治疗和/或预防感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤或癌症中的用途。
[0351]
因此，本发明还涉及药物组合物，其包含如本文所定义的多肽、编码这种多肽的核酸、含有编码多肽的核酸的载体、包含这种载体的宿主细胞或如上所述的vlp，以及任选的至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0352]
通常，在本发明的上下文中，药物组合物的制备、它们的剂量和它们的施用途径是本领域技术人员已知的，并且能够在最新版的雷明顿制药科学(remington's pharmaceutical sciences)(美国宾夕法尼亚州东部mack出版公司(mack publishing co.))中找到指导。
[0353]
本发明的药物组合物含有治疗有效量的如上概述的活性成分。治疗有效量取决于活性成分，特别是施用途径。根据本发明的药物组合物将优选通过肠胃外施用施加，特别是通过输注，例如静脉内、动脉内或骨内输注，或者通过注射，例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮内、皮下或鞘内注射。在抗肿瘤治疗的情况下，药物组合物(例如含有根据本发明的vlp的药物组合物)也能够通过瘤内注射施用。
[0354]
用于注射或输注的本发明溶液通常含有本发明的vlp的水溶液或水缓冲溶液，优选生理ph的等渗缓冲液。本发明的液体药物组合物可以含有其他成分，例如药学上可接受的稳定剂、助悬剂、乳化剂等。本发明的药物组合物的其他成分是佐剂，特别是在本发明的构建体用于疫苗接种目的的应用背景下。
[0355]
本发明的进一步主题是利用本发明的多肽、核酸、宿主细胞、载体和/或vlp的有益特性的治疗方法。在优选实施方案中，本发明提供了一种用于预防和/或治疗感染性疾病的方法，其包括向受试者(优选人)施用治疗有效量的如上所定义的药物组合物的步骤，其中，药物组合物包含本发明的vlp，vlp含有引起感染性疾病的感染原的抗原或其表位。另一实施方案是一种用于预防和/或治疗肿瘤或癌症疾病的方法，其包括向受试者(优选人)施用治疗有效量的如上所定义的药物组合物的步骤，其中药物组合物包含本发明的vlp，vlp含有一种或多种肿瘤抗原或其表位。
[0356]
根据另一优选实施方案，本发明提供了一种用于预防和/或治疗感染性疾病的方法，其包括向受试者(优选人)施用治疗有效量的如上所定义的药物组合物的步骤，其中药物组合物包含本发明的vlp，vlp含有一种或多种抗体或抗体片段(例如其互补位)，其识别引起感染性疾病的感染原的抗原、特别是表位。另一实施方案是一种用于预防和/或治疗肿瘤或癌症疾病的方法，其包括向受试者(优选人)施用治疗有效量的如上所定义的药物组合物的步骤，其中药物组合物包含本发明的vlp，vlp含有一种或多种抗体或抗体片段(例如其互补位)，其识别肿瘤或癌症抗原、特别是其表位。
[0357]
本发明进一步涉及一种用于产生如本文所述的多肽的方法，其包括在允许所述多肽表达的条件下，在合适的培养基中培养重组宿主细胞的步骤，其中宿主细胞包含载体，该载体包含编码多肽的核酸。
[0358]
优选地，用于产生本发明的多肽的方法进一步包括从宿主细胞和/或培养基中回
收表达的多肽的步骤。甚至更优选地，该方法还包括通过本领域已知的纯化手段(例如离心、凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱等)纯化回收的多肽的步骤。
[0359]
本发明还提供了一种用于产生如本文所定义的vlp的方法，其包括在允许多肽组装成如前概述的vlp的条件下孵育多肽的溶液的步骤。vlp的正确形成能够通过用电子显微镜检查样品溶液来测试。
附图说明
[0360]
图1示出了说明使用本发明的腺病毒五邻体基座蛋白冠型结构域(“addobody”)通过从随机化addobody文库中选择/进化来生成高亲和力单价和/或多价结合子分子的示意图。addobody文库能够通过环的随机化选择或全部来生成。从该addobody文库中，能够通过应用选择/进化技术(例如噬菌体展示、mrna展示、酵母展示、杆状病毒衣壳展示或核糖体展示或其他技术)鉴定能结合任何抗原的特异性结合子。
[0361]
图2示出了说明使用本发明的腺病毒五邻体基座蛋白冠型结构域(“addobody”)通过反向疫苗学生成多价疫苗的示意图。冠型示意性地显示在最左侧。冠型结构域以绿色着色。已经鉴定了用于在addobody中插入异源肽和多肽序列的四个不同位点(在此示意性地缩写为“环”)。这些环的随机化产生了addobody文库，其能够用于鉴定受感染患者或免疫动物的血清中普遍存在的抗体特异性结合的环序列。这种表位序列的鉴定能够用于生成单价或多价addomer超抗原，用于治疗目的。
[0362]
图3示出了(a)由某些腺病毒血清型的基座蛋白形成的十二面体表示通用支架。示出了高分辨率低温电子显微镜(cryo-em)结构(6hcr)。视图沿中心五邻体轴向下。每种颜色代表一种不同的五邻体基座蛋白。(b)addomer包含60个拷贝的腺病毒五邻体基座蛋白。五邻体基座蛋白具有双结构域构架；冠型结构域(顶部)和多聚化结构域(下部)。多聚化结构域采用果冻卷折叠。冠型结构域包含暴露的高度可变环。结构域能够分成两个独立的蛋白质实体。冠型结构域本身可以大量产生和纯化。另外，冠型结构域能够工程化，以允许展示异源肽序列(参见图1和图2)。(c)在图1和2的示意图中表示了冠型结构域。多聚化结构域的除去产生了根据本发明的自主蛋白结构域(“addobody”)，其能够大量产生、纯化和结晶。
[0363]
图4示出了用于表达基于人腺病毒血清型3(adh3)的本发明的addobody的构建体pproex htb addomer2_head的示意图。
[0364]
图5示出了addobody构建体addomer2_head的monoq洗脱图。
[0365]
图6示出了monoq洗脱的addobody构建体addomer2_head的尺寸排阻色谱。
[0366]
图7示出了根据图6的尺寸排阻色谱的峰馏分的sds聚丙烯酰胺凝胶分析。
[0367]
图8示出了在冷冻干燥之前和之后，根据图6的尺寸排阻色谱的合并峰馏分的样品的sds聚丙烯酰胺凝胶分析。
[0368]
图9示出了addobody构建体addomer2_head的示例性单晶。
[0369]
图10示出了addobody构建体addomer2_head的x射线溶液结构的顶视图。
[0370]
图11示出了无晶胞的addobody构建体addomer2_head的x射线溶液结构的顶视图。
[0371]
图12示出了addobody构建体addomer2_head的x射线溶液结构的侧视图。
[0372]
图13示出了无晶胞的addobody构建体addomer2_head的x射线溶液结构的侧视图。
具体实施方式
[0373]
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明：
[0374]
实施例1：
[0375]
人腺病毒血清型3(had3)的腺病毒五邻体基座冠型结构域的克隆、表达和纯化
[0376]
使用图4中所示的限制性位点将以下序列克隆到表达载体pproex中：
[0377]
编码本发明的addobody(命名为addomer2_head)的核苷酸序列(其带有his标签序列)
[0378]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp (seq id no:27)。
[0379]
所得载体具有以下序列(以粗体示出orf起始和终止，编码序列用小写字符表示)：
[0380]
[0381]
[0382][0383]
(seq id no:31)
[0384]
如下产生和纯化多肽：
[0385]
缓冲液和储备溶液
[0386]
1000x氨苄青霉素储备液：将1g氨苄青霉素溶于10ml dh2o中，通过0.2μm滤膜过滤
[0387]
1m iptg储备液：将2.4g iptg溶于10ml dh2o中，并通过0.2μm滤膜过滤。
[0388]
10x pbs缓冲液储备液：
[0389]-80g nacl
[0390]-2g kcl
[0391]-7.62g na2hpo4[0392]-0.77g kh2po4在1l超纯h2o中，设定ph 7.4
[0393]
使用前1:10稀释10x pbs，得到1x pbs。
[0394]
[在下文中，表述ad3head用于addobody]
[0395]
描述了每1l培养物的表达和纯化方案。如果需要更多的表达培养物，应相应地扩大规模。通常，一个大制备应制成3-5l表达培养物，并将纯化的蛋白质冷冻储存。
[0396]
1.bl21(de3)细菌转化
[0397]
将编码addomer头部或“冠型”结构域(addobody)的pproex_htb_ad3head质粒转化到bl21(de3)感受态细胞中，并且铺板到含有作为选择标记的氨苄青霉素的lb琼脂糖板上
[0398]
1.1板制备：
[0399]
·
在微波炉中加热lb琼脂糖
[0400]
·
在流动的自来水下冷却瓶子
[0401]
·
加入1000x氨苄青霉素储备液(100μl至100ml lb琼脂糖)
[0402]
1.2转化
[0403]
·
将bl21(de3)细胞置于冰上20min解冻
[0404]
·
将5μl质粒dna(约0.67μg)加入到细胞中并在冰上孵育1h
[0405]
·
在42℃下进行热激45s，并将试管在冰上冷却10min
[0406]
·
将500μl无菌lb加入管中
[0407]
·
将细胞在37℃培养箱中以180rpm旋转孵育1h
[0408]
·
将100μl细胞培养物铺板于含有氨苄青霉素的lb琼脂糖板上，并在37℃孵育过夜
[0409]
·
将剩余的400μl细胞在37℃培养箱中以180rpm旋转孵育过夜，如果需要重新铺板，则作留为备用
[0410]
2.细菌预培养
[0411]
·
将单菌落接种到含有带50μl氨苄青霉素的50ml dyt培养基的无菌烧瓶中
[0412]
·
在37℃以180rpm旋转孵育过夜
[0413]
3.表达培养物的诱导
[0414]
·
将od 3-4的50ml预培养物接种到含有1ml氨苄青霉素(1000x储备液)的1l预热的dyt培养基中
[0415]
·
在37℃培养箱中以180rpm旋转孵育培养物
[0416]
·
每小时进行od测量，直到其再次达到1od(需要约3h)
[0417]
·
从每个摇瓶中取出预诱导样品(参见下文)
[0418]
·
然后用1ml iptg储备液诱导培养物，并在30℃孵育3h。
[0419]
·
从每个摇瓶中取出诱导后样品(参见下文的框)
[0420]
跑sds-page凝胶(12％)
[0421]
4.细胞收获
[0422]
·
将1l培养物分配至两个塑料瓶中，并精确平衡用于离心
[0423]
·
在4℃下以3500g离心20min
[0424]
·
弃去上清液，将沉淀物重悬于20ml用过的培养基中，然后转移到50ml falcon管中
[0425]
·
在台式离心机中以3000g离心10min
[0426]
·
弃去培养基，并在纸巾上轻敲falcon管，以除去剩余的培养基
[0427]
·
在液氮中快速冷冻沉淀物，储存在-20℃，直到纯化
[0428]
5.使用talon树脂通过imac分批纯化
[0429]
缓冲液：
[0430]
pbs(1x)(参见上文)
[0431]
高盐洗涤缓冲液：ph 7.4(在4℃冰上设定)
[0432]-50mm tris-》0.622g trizma碱
[0433]-1m kcl-》7.45g kcl
[0434]-5mm咪唑-》0.034g咪唑，终体积100ml dh2o
[0435]
洗脱缓冲液：ph 7.4(在4℃冰上设定)
[0436]-200mm咪唑-》1.36g，终体积100ml 1x pbs
[0437]
·
测量收获的沉淀物重量，每克沉淀物加入10ml 1x pbs并重悬。
[0438]
·
超声处理细胞两次，持续5min：脉冲超声处理10s开启，15s关闭(冰上)
[0439]
·
以3000g离心10min
[0440]
·
将上清液转移到新的falcons管中，并再次以3000g离心10min
[0441]
·
将澄清的上清液装载到平衡过的talon树脂上(参见下文)。
[0442]
5.2树脂平衡(hispur talon树脂)
[0443]
·
将1ml“浆液”加入到15ml falcon管中，并用5ml dh2o洗涤，以1000rpm离心5min，弃去上清液
[0444]
·
用5ml 1x pbs洗涤浆液，以1000rpm离心5min，弃去上清液
[0445]
5.3结合和洗涤步骤
[0446]
·
将澄清的裂解液装载到平衡过的树脂的顶部，并在冷室中4℃等速旋转孵育过夜。
[0447]
·
第二天，以1000rpm离心5min，并收集流通液(ft)
[0448]
·
向树脂中加入高盐洗涤缓冲液(7ml)，在冷室中4℃旋转孵育20min。
[0449]
·
将falcon管以1000rpm离心5min，收集上清液(hs)。
[0450]
·
洗涤：向树脂中加入7ml 1x pbs，然后以1000rpm离心5min，收集上清液(w1)。
[0451]
·
将1x pbs的洗涤步骤再重复两次，并收集上清液(w2，w3)。
[0452]
·
将树脂重悬于1ml 1x pbs中，并转移到1.5ml eppendorf管中。以1000rpm离心5min，并弃去上清液。
[0453]
5.4洗脱
[0454]
·
向树脂中加入5ml洗脱缓冲液，在冷室中4℃孵育20min，同时旋转。
[0455]
·
管以13000rpm离心5min，将上清液收集到新的管中(e1)。
[0456]
·
向树脂中加入5ml洗脱缓冲液，在冷室中4℃孵育20min，同时旋转。
[0457]
·
管以13000rpm离心5min，将上清液收集到新的管中(e2)。
[0458]
·
向树脂中加入5ml洗脱缓冲液，在冷室中4℃孵育20min，同时旋转。
[0459]
·
管以13000rpm离心5min，将上清液收集到新的管中(e3)。
[0460]
·
将树脂重悬于1ml洗脱缓冲液(“树脂”)中。取12μl。
[0461]
·
每个步骤的样品(12μl+4μl pglb)在sds-page凝胶(12％)上电泳。
[0462]
6.透析和tev裂解
[0463]
·
在透析和tev裂解(使用洗脱缓冲液作为空白以校正咪唑)之前，用nanodrop(a280)测量蛋白质浓度。
[0464]
·
取12μl样品(“透析前”样品)。
[0465]
·
加入20μl tev蛋白酶
[0466]
·
用2mm
□‑
mesh(
□‑
mesh必须在通风橱下使用)在冷室中的透析袋中针对1x pbs透析。
[0467]
·
30min后更换为具有新1x pbs和
□‑
mesh的新烧杯。
[0468]
·
在4℃下继续透析过夜
[0469]
·
取12μl样品(“透析后”样品)。
[0470]
·
回收包含addobody的样品，以透析缓冲液作为空白测量蛋白质的浓度，确定样品体积并插入表i(参见附录)。
[0471]
7.除去未切割的蛋白质和tev(反向talon)
[0472]
·
将透析过的样品装载到1ml平衡过的talon树脂(如前所述平衡树脂)中，并在冷室中4℃旋转孵育1h。
[0473]
·
用nanodrop测量浓度。取12μl样品(“浓缩前”)。
[0474]
·
使用amicon millipore蛋白质浓缩器(mwco 10kda)浓缩样品。在4℃下以3000g进行离心至500μl。
[0475]
·
取12μl样品(“浓缩后”)。
[0476]
·
用nanodrop测量浓度。确定样品的体积并插入表i(附录)。
[0477]
·
每个步骤的样品(12μl+4μl pglb)在sds-page凝胶(12％)上电泳。
[0478]
8.反向离子交换色谱(iex)
[0479]
用akta pure系统使用mono q 5/50gl柱进行离子交换色谱。
[0480]
[备注：这是“反向”iex，因为addobody通过柱(ft)下降，相反，预期杂质结合。]
[0481]
缓冲液a：1x pbs(新制成并过滤)
[0482]
缓冲液b：含1m nacl的1x pbs
[0483]-(对于1l缓冲液b，称出58.44g(1mol)nacl并加入到1l 1x pbs中，通过搅拌溶解)。
[0484]
·
δ柱压力：4.00mpa
[0485]
·
在进样之前用1x pbs(15ml，即15个柱体积)平衡柱。
[0486]
·
流速1ml/min
[0487]
·
用分馏器收集样品，馏分体积为1ml。
[0488]
·
用缓冲液a以1ml/min流速洗涤柱。
[0489]
·
500μl样品在台式离心机中以13000rpm离心
[0490]
·
取12μl探针(iex in)
[0491]
·
样品进样。
[0492]
·
应用线性梯度：
[0493]
20min内0-100％b
[0494]
100％b，持续5min
[0495]
0％b，持续5min
[0496]
(0％b，持续5min是用于重新平衡柱)。
[0497]
·
收集1ml馏分。
[0498]
addobody以ft 1-10ml洗脱体积洗脱(并且在20ml洗脱体积附近有次峰)。
[0499]
示例性洗脱图在图5中示出。
[0500]
·
合并包含addobody的馏分。以缓冲液a作为空白用nanodrop测量浓度。确定样品的体积并插入表i(附录)。
[0501]
9.尺寸排阻色谱(sec)
[0502]
缓冲液a：1x pbs(新制成并过滤)
[0503]
合并来自离子交换运行的对应于主峰的馏分，并如前所述用amicon millipore蛋
白质浓缩器(mwco 10kda)浓缩。
[0504]
重要提示：小心不要过度浓缩，蛋白质可能会沉淀。如果你使用3-5l表达培养物，你可能需要使用两个浓缩器，逐步监测浓度，并确保你未观察到沉淀。
[0505]
用akta pure系统使用hiload 16/600superdex 200pg柱对500μl等份的浓缩样品进行尺寸排阻色谱。
[0506]
·
δ柱压力：0.3mpa
[0507]
·
在进样之前用1x pbs平衡柱至总体积5ml
[0508]
·
流速：1ml/min
[0509]
·
样品施加：用2ml排空环路
[0510]
·
分馏收集样品，馏分体积：1ml
[0511]
·
在台式离心机中以13000rpm离心500μl样品等份。
[0512]
·
每次进样取12μl探针(sec in)。
[0513]
·
进样500μl的剩余部分。
[0514]
示例性色谱图在图6中示出，峰馏分的sds聚丙烯酰胺凝胶分析在图7中示出。
[0515]
10.冷冻和储存
[0516]
·
合并来自sec的对应于主峰的馏分。
[0517]
·
以缓冲液a作为空白用nanodrop测量浓度。确定样品的体积并插入表i(附录)。
[0518]
·
取12μl样品(“concfreeze in”)
[0519]
·
使用amicon millipore蛋白质浓缩器(mwco 10kda)浓缩至5mg/ml终浓度。
[0520]
·
取12μl样品(“concfreeze out”)
[0521]
将蛋白质在低蛋白结合管中以100μl等份快速冷冻并储存在-20℃。
[0522]
冷冻前后合并的馏分的sds聚丙烯酰胺凝胶分析在图8中示出(冷冻前：conc.in；冷冻后：conc.out)，其示出了addobody构建体addomer2_head是稳定的。
[0523]
实施例2
[0524]
addobody构建体addomer2_head的结晶和x射线结构确定
[0525]
将截短的(即成熟的)多肽addomer2_head(根据seq id no:27的氨基酸序列，缺少含his标签的序列msyyhhhhhhdydipttenlyf(seq id no:39))
[0526]
gamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp(seq id no:28)
[0527]
结晶并进行x射线衍射。
[0528]
结晶条件：坐滴，peg3350 20％(w/v)，0.1m柠檬酸盐ph 5.5，蛋白质浓度：5mg/ml，液滴尺寸：0.5μl蛋白质和0.5μl储器。
[0529]
代表性单晶在图9中示出。最佳晶体衍射为大约
[0530]
x射线衍射给出以下结果：
[0531]
空间群p1
[0532]
a＝102.124b＝103.837c＝177.578α＝92.308β＝94.314γ＝112.047
[0533]
溶液结构在图10至13中示出。
[0534]
晶胞含有存在于2个十聚体中的20个addobody。
[0535]
重要的是，addobody的片段a的底层区域和片段b的b环在分离的addobody中形成柔性结构。
[0536]
实施例3
[0537]
黑猩猩腺病毒的腺病毒五邻体基座冠型结构域的克隆、表达和纯化
[0538]
将编码本发明的另一种addobody(命名为chimpcrown)的核苷酸序列(其带有his标签序列)
[0539]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgtimhtnmpnvnefmysnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedileyewvefelpegnfsvtmtidlmnnaiidnylavgrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpvtelvmpgvytneafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrqpfqegfqimyedleggnipalldvdayekskkdtttetttkkelkiqpvekdskdrsynvlpdkintayrswylaynygdpekgvrswtllttsdvtcgveqaellpvysksffneqavysqqlraftslthvfnrfpenqilvrppaptittvsenvp(seq id no:28)
[0540]
如实施例1概述的克隆到表达载体pproex中。
[0541]
根据实施例1的方案进行表达和纯化。
[0542]
实施例4
[0543]
含有异源插入的人腺病毒血清型3(had3)的腺病毒五邻体基座冠型结构域的克隆、表达和纯化
[0544]
将编码本发明的经修饰的addobody的核苷酸序列(其在片段b的b环中含有来自基孔肯雅病毒stkdnfnvykatrpylah(seq id no:40)的主要中和表位，并且取代had3五邻体基座的野生型片段b中的序列hvfnrf(seq id no:41)(带有his-标签序列))
[0545]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslt stkdnfnvykatrpylahpenqilirppaptittvsenvp(seq id no:42)
[0546]
如实施例1概述的克隆到表达载体pproex中。
[0547]
根据实施例1的方案进行表达和纯化。
[0548]
总之，本发明特别涉及以下项：
[0549]
1.一种分离的工程化多肽，其包含基本上对应于五邻体基座的第一片段和第二片段的氨基酸伸展段，其中分别地，多肽的第一片段存在于在全长五邻体基座中形成果冻卷折叠结构域的第一氨基酸伸展段和第二氨基酸伸展段之间，并且其中，多肽的第二片段存在于在全长五邻体基座中形成果冻卷折叠结构域的第二片段和第三片段之间，其中，分离的工程化结构域缺少形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的氨基酸伸展段，其中可选地，多肽的第一片段和/或第二片段含有一个或多个异源修饰。
[0550]
2.项1的多肽，其具有以下通式(i)的结构：
[0551]
n-a-l-b-c(i)
[0552]
其中
[0553]
a表示存在于形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的第一氨基酸伸展段和
第二氨基酸伸展段之间的、对应于腺病毒五邻体基座的n-末端氨基酸伸展段的氨基酸伸展段；
[0554]
b表示插入在形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的第二和第三氨基酸伸展段之间的、对应于腺病毒五邻体基座的c-末端氨基酸伸展段的氨基酸伸展段；
[0555]
l表示选自由氨基酸、寡肽和多肽组成的组的化学基团；
[0556]
n可以存在或不存在，并且如果存在，表示由氨基酸、寡肽和多肽组成的化学基团；
[0557]
c可以存在或不存在，并且如果存在，表示由氨基酸、寡肽和多肽组成的化学基团；
[0558]
其中，可选地，片段a和/或片段b含有一个或多个异源修饰。
[0559]
3.根据项2中任一项的多肽，其中，片段a包含选自由以下组成的组中的氨基酸序列：根据以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0560][0561]
[0562]
其中，可选地，片段a含有一个或多个异源修饰。
[0563]
4.项2或3的多肽，其中，片段b包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：根据以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0564][0565]
其中，可选地，片段b含有一个或多个异源修饰。
[0566]
5.根据项2至4中任一项的多肽，其特征在于，片段a和/或片段b含有一个或多个异源修饰，其中，所述一个或多个异源修饰包含在以下位点中：
[0567]-片段a的rgd环区域；和/或
[0568]-片段a的v环；和/或
[0569]-片段a的具有以下序列(从n-至c-末端)的底层区域
[0570]
x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-d-x
7-x
8-x
9-s-y-n-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16
(seq id no:21)
[0571]
其中
[0572]
x1为i或l，优选为i；
[0573]
x2选自由k、q和e组成的组，优选为q；
[0574]
x3为p或a，优选为p；
[0575]
x4选自由l、v和i组成的组，优选为l；
[0576]
x5选自由t、e、a、k和l组成的组，优选为e；
[0577]
x6选自由e、k、t和q组成的组，优选为k；
[0578]
x7选自由s、p和d组成的组，优选为s；
[0579]
x8选自由k、t和s组成的组，优选为k；
[0580]
x9选自由k、s、n、g和d组成的组，优选为s；
[0581]
x
10
为l或v，优选为v；
[0582]
x
11
为i或l，优选为i；
[0583]
x
12
选自由s、e和p组成的组，优选为e；
[0584]
x
13
为无氨基酸(即不存在)或为n，优选为无氨基酸；
[0585]
x
14
为d或g，优选为d；
[0586]
x
15
选自由s、k、q和t组成的组，优选为k；并且
[0587]
x
16
选自由t、n、i、k和m组成的组，优选为i；和/或
[0588]-片段b的序列(从n-末端至c-末端)t-h-v-f-x
17-r-f-p(seq id no:22)，其中，x
17
为d或n，优选为n。
[0589]
6.项5的多肽，其中，片段a的rgd环区域的n-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0590]
x
18-x
19-x
20-x
21-x
22-x
23-x
24-x
25-x
26
(seq id no:23)，其中
[0591]
x
18
选自由d、e和n组成的组，优选为d；
[0592]
x
19
选自由v、l和i组成的组，优选为v；
[0593]
x
20
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e、k、s和t组成的组，更优选为t；
[0594]
x
21
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e和k组成的组，更优选为a；
[0595]
x
22
选自由f、y和w组成的组，优选为y；
[0596]
x
23
选自由a、d、e、n和q组成的组，优选为e或q，更优选为e；
[0597]
x
24
是任意氨基酸，优选选自由a、d、e、n和k组成的组，更优选为e；
[0598]
x
25
选自由s或t组成的组，优选为s；并且
[0599]
x
26
是任意氨基酸，并且构成rgd环区域的n-末端氨基酸。
[0600]
7.项5或6的多肽，其中，片段a的rgd环区域的c-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0601]
x
27-x
28-x
29-x
30-x
31-x
32-x
33-x
34
(seq id no:24)
[0602]
其中
[0603]
x
27
是任意氨基酸，并且构成第二rgd环的c-末端氨基酸；
[0604]
x
28
选自由i、l和v组成的组，优选为i；
[0605]
x
29
选自由d、e、k、n、q和v组成的组，优选为q或k，更优选为q；
[0606]
x
30
选自由c、g和p组成的组，优选为p；
[0607]
x
31
选自由i、l和v组成的组，优选为l或v，更优选为l；
[0608]
x
32
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为e；
[0609]
x
33
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为k；并且
[0610]
x
34
选自由d和e组成的组，优选为d。
[0611]
8.根据项5至7中任一项的多肽，其中，片段a的v环的n-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0612]
x
35-x
36-x
37-x
38-x
39-x
40-x
41-x
42
(seq id no:25)
[0613]
其中
[0614]
x
35
选自由f、y和w组成的组，优选为f；
[0615]
x
36
选自由h、k和r组成的组，优选为k；
[0616]
x
37
选自由a、v、i和l组成的组，优选为a；
[0617]
x
38
选自由h、k和r组成的组，优选为r；
[0618]
x
39
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；
[0619]
x
40
选自由a、v、i、l和m组成的组，优选为m；
[0620]
x
41
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；并且
[0621]
x
42
是任意氨基酸，并且构成v环的n-末端氨基酸。
[0622]
9.根据项5至8中任一项的多肽，其中，片段a的v环的c-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0623]
x
43-x
44-x
45-x
46-x
47-x
48-x
49
(seq id no:26)
[0624]
其中
[0625]
x
43
是任意氨基酸，并且构成v环的c-末端氨基酸；
[0626]
x
44
选自由f、y和w组成的组，优选为y；
[0627]
x
45
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为e；
[0628]
x
46
选自由f、y和w组成的组，优选为w；
[0629]
x
47
选自由a、f、v、y和w组成的组，优选为f或v，更优选为f；
[0630]
x
48
选自由d、e、s和t组成的组，优选为d或e，更优选为e；并且
[0631]
x
49
选自由f、y和w组成的组，优选为f。
[0632]
10.根据项2至9中任一项的多肽，其中，异源修饰选自由以下组成的组：与片段a和/或片段b的野生型序列相比的一个或多个单氨基酸突变、一个或多个异源氨基酸和/或氨基酸伸展段对野生型氨基酸伸展段的一个或多个取代、异源氨基酸伸展段的一个或多个插入、一个或多个氨基酸的一个或多个缺失和一个或多个氨基酸修饰及其任何组合。
[0633]
11.根据项2至10中任一项的多肽，其中，异源修饰提供了靶特异性结合实体。
[0634]
12.项11的多肽，其中，靶特异性结合实体选自由以下组成的组：抗原、表位、cdr、抗体、诸如抗原结合(fab)片段、fab’片段、f(ab’)2片段的抗体片段、重链抗体、单域抗体(sdab)、单链可变片段(scfv)、可变片段(fv)、vh结构域、vl结构域、单域抗体、纳米抗体、ignar(免疫球蛋白新抗原受体)、di-scfv、双特异性t细胞接合器(bite)、双亲和重靶向(dart)分子、三价抗体(triple body)、二价抗体(diabody)、单链二价抗体、互补位、替代支架蛋白、以及其融合蛋白、毒素和毒液。
[0635]
13.根据项1至3中任一项的多肽，具有以下氨基酸序列(从n-末端至c-末端)中的一种：
[0636]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp(seq id no:27)
[0637]
gamgsgiqpnvneymfsnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedilkyewfefilpegnfsatmtidlmnnaiidnyleigrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpetklimpgvytyeafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrhpfqegfkimyedleggnipalldvtayeeskkdtttetttkkelkiqplekdsksrsynvledkintayrswylsynygnpekgirswtllttsdvtcgangdsgnpvfsksfyneqavysqqlrqatslthvfnrfpenqilirppaptittvsenvp(seq id no:32)
[0638]
msyyhhhhhhdydipttenlyfqgtimhtnmpnvnefmysnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedileyewvefelpegnfsvtmtidlmnnaiidnylavgrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpvtelvmpgvytneafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrqpfqegfqimyedleggnipalldvdayekskkdtttetttkkelkiqpvekdskdrsynvlpdkintayrswylaynygdpekgvrswtllttsdvtcgveqaellpvysksffneqavysqqlraftslthvfnrfpenqilvrppaptittvsenvp(seq id no:28)
[0639]
qgtimhtnmpnvnefmysnkfkarvmvsrkapegvtvndtydhkedileyewvefelpegnfsvtmtidlmnnaiidnylavgrqngvlesdigvkfdtrnfrlgwdpvtelvmpgvytneafhpdivllpgcgvdftesrlsnllgirkrqpfqegfqimyedleggnipalldvdayekskkdtttetttkkelkiqpvekdskdrsynvlpdkintayrswylaynygdpekgvrswtllttsdvtcgveqaellpvysksffneqavysqqlraftslthvfnrfpenqilvrppaptittvsenvp(seq id no:33)。
[0640]
14.一种分离的工程化多肽，其包含腺病毒五邻体基座蛋白的α-螺旋结构域的大片段，该多肽缺少α-螺旋结构域的小片段和腺病毒五邻体基座蛋白的果冻卷折叠结构域，其中，所述大片段可选地含有一个或多个异源修饰。
[0641]
15.项14的多肽，其从n-末端至c-末端具有以下通式ii的结构：
[0642]
n-a-c(ii)
[0643]
其中
[0644]
a表示存在于形成腺病毒五邻体基座的果冻卷折叠结构域的第一和第二氨基酸伸展段之间的、对应于腺病毒五邻体基座的n-末端氨基酸伸展段的氨基酸伸展段；
[0645]
n可以存在或不存在，并且如果存在，表示由氨基酸、寡肽和多肽组成的化学基团；
[0646]
c可以存在或不存在，并且如果存在，表示由氨基酸、寡肽和多肽组成的化学基团；
[0647]
其中，可选地，片段a含有一个或多个异源修饰。
[0648]
16.项15的多肽，其中，片段a包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：根据以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0649][0650]
其中，可选地，片段a含有一个或多个异源修饰。
[0651]
17.项15或16的多肽，其特征在于，片段a含有一个或多个异源修饰，其中，所述一个或多个异源修饰包含在以下位点中：
[0652]-片段a的rgd环区域；和/或
[0653]-片段a的v环；和/或
[0654]-片段a的具有以下序列(从n-末端至c-末端)的底层区域
[0655]
x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-d-x
7-x
8-x
9-s-y-n-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16
(seq id no:21)
[0656]
其中
[0657]
x1为i或l，优选为i；
[0658]
x2选自由k、q和e组成的组，优选为q；
[0659]
x3为p或a，优选为p；
[0660]
x4选自由l、v和i组成的组，优选为l；
末端至c-末端)定义：
[0697]
x
35-x
36-x
37-x
38-x
39-x
40-x
41-x
42
(seq id no:25)
[0698]
其中
[0699]
x
35
选自由f、y和w组成的组，优选为f；
[0700]
x
36
选自由h、k和r组成的组，优选为k；
[0701]
x
37
选自由a、v、i和l组成的组，优选为a；
[0702]
x
38
选自由h、k和r组成的组，优选为r；
[0703]
x
39
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；
[0704]
x
40
选自由a、v、i、l和m组成的组，优选为m；
[0705]
x
41
选自由a、v、i和l组成的组，优选为v；并且
[0706]
x
42
是任意氨基酸，并且构成v环的n-末端氨基酸。
[0707]
21.根据项17至20中任一项的多肽，其中，片段a的v环的c-末端由以下序列(从n-末端至c-末端)定义：
[0708]
x
43-x
44-x
45-x
46-x
47-x
48-x
49
(seq id no:26)
[0709]
其中
[0710]
x
43
是任意氨基酸，并且构成v环的c-末端氨基酸；
[0711]
x
44
选自由f、y和w组成的组，优选为y；
[0712]
x
45
选自由d、e、s和t组成的组，优选为e或t，更优选为e；
[0713]
x
46
选自由f、y和w组成的组，优选为w；
[0714]
x
47
选自由a、f、v、y和w组成的组，优选为f或v，更优选为f；
[0715]
x
48
选自由d、e、s和t组成的组，优选为d或e，更优选为e；并且
[0716]
x
49
选自由f、y和w组成的组，优选为f。
[0717]
22.根据项15至21中任一项的多肽，其中异源修饰选自由以下组成的组：与片段a的野生型序列相比的一个或多个单氨基酸突变、一个或多个异源氨基酸和/或氨基酸伸展段对野生型氨基酸伸展段的一个或多个取代、异源氨基酸伸展段的一个或多个插入、一个或多个氨基酸的一个或多个缺失和一个或多个氨基酸修饰及其任何组合。
[0718]
23.根据项15至22中任一项的多肽，其中，异源修饰提供了靶特异性结合实体。
[0719]
24.项23的多肽，其中，靶特异性结合实体选自由以下组成的组：抗原、表位、cdr、抗体、诸如抗原结合(fab)片段、fab’片段、f(ab’)2片段的抗体片段、重链抗体、单域抗体(sdab)、单链可变片段(scfv)、可变片段(fv)、vh结构域、vl结构域、单域抗体、纳米抗体、ignar(免疫球蛋白新抗原受体)、di-scfv、双特异性t细胞接合器(bite)、双亲和重靶向(dart)分子、三价抗体(triple body)、二价抗体(diabody)、单链二价抗体、互补位、替代支架蛋白、以及其融合蛋白、毒素和毒液。
[0720]
25.一种核酸，其编码根据先前项中任一项的多肽。
[0721]
26.一种载体，其包含项25的核酸。
[0722]
27.项26的载体，其在表达盒内含有项15的核酸。
[0723]
28.一种重组宿主细胞，其包含项24的核酸或项26或27的载体。
[0724]
29.一种用于产生根据项1至24中任一项的多肽的方法，其包括在允许所述多肽表达的条件下培养含有项28的载体的项28的宿主细胞的步骤。
[0725]
30.项29的方法，进一步包括从培养的宿主细胞中纯化多肽的步骤。
[0726]
31.一种工程化腺病毒五邻体基座蛋白，其包含与腺病毒五邻体基座蛋白的多聚化结构域(果冻卷折叠结构域)融合的根据项5至12中任一项的多肽。
[0727]
32.项31的五邻体基座蛋白，其从n-末端至c-末端具有以下通式iii的结构：
[0728]
d-a-e-b-f(iii)
[0729]
其中，a和b是如项2至4中任一项中所定义的α-螺旋冠型结构域的片段，d、e和f是腺病毒五邻体基座的形成多聚化(果冻卷折叠)结构域的氨基酸序列，其中，一个或多个异源修饰存在于片段a的底层区域和/或片段b的b环中。
[0730]
33.一种工程化腺病毒五邻体基座蛋白，其包含与腺病毒五邻体基座蛋白的多聚化结构域(果冻卷折叠结构域)融合的根据项15至24中任一项的多肽。
[0731]
34.项33的五邻体基座，其从n-末端至c-末端具有以下通式iv的结构：
[0732]
d-a-e-li-f(iv)
[0733]
其中，a是如项15或16中任一项中所定义的α-螺旋冠型结构域的大片段，d、e和f是腺病毒五邻体基座的形成多聚化(果冻卷折叠)结构域的氨基酸序列，其中可选地且优选地，一个或多个异源修饰存在于片段a的底层区域，并且其中，li是选自肽、寡肽、多肽、蛋白质和蛋白质复合物的连接子。
[0734]
35.项32或34的五邻体碱基，其中，通式(iii)或(iv)的片段d具有以下共有序列(seq id no:34)：
[0735]
(u)
1-47
ptj1grnsiry sj2j3x4pj5j6dtt j7j8ylvdnksa diaslnyqnd
[0736]
hsnfj5ttvj9q nndj
10j11
pj
12
eaj
13 tqtinj
14
dj
15
rs rwgj
16j17
lktij
18
[0737]j19
tz1z2z3z4z5z6z7z
8 z9z
10z11z12z13z14z15
[0738]
其中：片段d结束于c-末端侧上在z1之前的残基t处或在z1至z
15
中的氨基酸处；
[0739]
u是任意氨基酸或无氨基酸；
[0740]
j1为e或g；
[0741]
j2为e或s；
[0742]
j3为l或v；
[0743]
j4为a或s；
[0744]
j5为l或q；
[0745]
j6为y或e；
[0746]
j7为r或k；
[0747]
j8为v或l；
[0748]
j9为v或i；
[0749]j10
为f或y；
[0750]j11
为t或s；
[0751]j12
为a或t或i或g；
[0752]j13
为s或g；
[0753]j14
为f或l；
[0754]j15
为e或d；
[0755]j16
为a或g；
[0756]j17
为d或q；
[0757]j18
为l或m；
[0758]j19
为h或r；
[0759]
z1如果存在，则为n；
[0760]
z2如果存在，则为m；
[0761]
z3如果存在，则为p；
[0762]
z4如果存在，则为n；
[0763]
z5如果存在，则为v或i；
[0764]
z6如果存在，则为n；
[0765]
z7如果存在，则为e或d；
[0766]
z8如果存在，则为y或f；
[0767]
z9如果存在，则为m；
[0768]z10
如果存在，则为f或s或y；
[0769]z11
如果存在，则为t或s；
[0770]z12
如果存在，则为s或n；
[0771]z13
如果存在，则为k；
[0772]z14
如果存在，则为f；
[0773]z16
如果存在，则为k。
[0774]
36.项35的五邻体基座，其中，片段d包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0775]
[0776][0777]
37.根据项32至36中任一项的五邻体基座，其中，通式(iii)或(iv)的片段e具有以下序列(seq id no:35)：
[0778]z17z18z19z20z21z22z23z24z25z26 z
27
qvywslpdj
20 mj
21
dpvtfrst j
22
qj
23j24
nj
25
pvvgj
26 elz
28z29z30
[0779]
其中：片段e起始于n-末端侧上在z
17
至z
27
中的氨基酸处或在z
27
之后的氨基酸q处；
[0780]
氨基酸伸展段b结束于c-末端侧上在z
28
之前的氨基酸l处或在z
28
至z
30
中的氨基酸处；
[0781]z17
如果存在，则为l或s；
[0782]z18
如果存在，则为t或p或c；
[0783]z19
如果存在，则为t或p；
[0784]z20
如果存在，则为p或s或a或r；
[0785]z21
如果存在，则为n或d；
[0786]z22
如果存在，则为g或v；
[0787]z23
如果存在，则为h或t；
[0788]z24
如果存在，则为c；
[0789]z25
如果存在，则为g；
[0790]z26
如果存在，则为a或v或s；
[0791]z27
如果存在，则为e或q；
[0792]j20
为l或m；
[0793]j21
为q或k；
[0794]j22
为q或r或s；
[0795]j23
为v或i；
[0796]j24
为s或n；
[0797]j25
为y或f；
[0798]j26
为a或v；
[0799]z28
如果存在，则为m或l；
[0800]z29
如果存在，则为p；
[0801]z30
如果存在，则为v或f。
[0802]
38.项37的五邻体基座，其中，片段e包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0803]
[0804][0805]
39.根据项32至38中任一项的五邻体碱基，其中通式(iii)或(iv)的片段f具有以下序列(seq id no:36)：
[0806]z31z32z33
altdhgt lplrssij
27
gv qrvtj
28
tdarr rtcpyvyka lgivj
30
pj
31
vls srtf
[0807]
其中：片段f起始于n-末端侧上在z
31
至z
33
中的氨基酸处或在z
33
之后的氨基酸a处；
[0808]z31
如果存在，则为n；
[0809]z32
如果存在，则为v；
[0810]z33
如果存在，则为p；
[0811]j27
为r或s或g；
[0812]j28
为v或i；
[0813]j29
为y或h；
[0814]j30
为a或s；
[0815]j31
为r或k。
[0816]
40.项39的五邻体基座，其中，片段f包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：以下表格的氨基酸序列和与以下表格中示出的相应氨基酸序列具有至少85％、更优选至少90％、甚至更优选95％、特别优选至少98％、最优选至少99％的同一性的氨基酸序列：
[0817][0818]
41.一种根据项32至40中任一项的工程化腺病毒五邻体基座蛋白的五聚体复合物。
[0819]
42.一种病毒样颗粒(vlp)，其包含12个根据项41的五聚体复合物。
[0820]
43.根据项1至24中任一项的多肽或项42的vlp作为药物的用途。
[0821]
44.一种药物组合物，其包含根据项1至24中任一项的多肽或根据项32至40中任一项的工程化腺病毒五邻体基座蛋白或根据项42的vlp、以及任选的至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
[0822]
45.一种用于产生项42的vlp的方法，其包括在允许多肽组装成vlp的条件下孵育根据项32至40中任一项的五邻体基座的溶液的步骤。
[0823]
46.根据项1至24中任一项的多肽或根据项42的vlp，用于治疗和/或预防感染性疾病、免疫性疾病、肿瘤或癌症。
[0824]
47.一种鉴定靶分子的结合序列的方法，其包括以下步骤：
[0825]
(ia)制备载体的文库，每个载体含有编码多肽的核苷酸序列，该多肽在表达盒中具有候选结合序列，由所述核苷酸序列编码的每个多肽在如项5至9中任一项所定义的rgd环区域和/或v环和/或底层区域和/或b环中的一个或多个中包含作为异源修饰的选结合序列，其中由每个载体中的核苷酸序列编码的候选结合序列不同，使得载体含有编码随机化候选结合序列的核苷酸序列的随机化文库；或
[0826]
(ib)制备载体文库，每个载体含有编码多肽的核苷酸序列，该多肽在表达盒中具有候选结合序列，由所述核苷酸序列编码的每个多肽在如项17至21中任一项所定义的rgd环区域和/或v环和/或底层区域中的一个或多个中包含作为异源修饰的候选结合序列，其中，由每个载体中的核苷酸序列编码的候选结合序列不同，使得载体含有编码随机化候选结合序列的核苷酸序列的随机化文库；
[0827]
(ii)在宿主细胞或无细胞体系、优选无细胞体系中表达由来自步骤(ia)或(ib)的载体的文库的核苷酸序列编码的多肽；
[0828]
(iii)可选地在从宿主细胞或无细胞体系、优选无细胞体系纯化之后，使步骤(ii)中表达的多肽与靶分子接触；以及
[0829]
(iv)检测已经与靶分子结合的多肽。
[0830]
48.项47的方法，进一步包括确定与靶分子结合的多肽的解离常数(kd)的步骤。