用于工程化细胞的嵌合受体的制作方法

1.本发明涉及工程化细胞，特别是工程化t细胞(例如，调节性t细胞)和此类细胞的治疗用途。具体而言，本发明涉及工程化细胞，特别是工程化t细胞(例如，调节性t细胞)，其对具有有限il-2可用性的微环境不敏感并且具有稳定的细胞(例如，treg)表型。所述细胞被工程化以表达嵌合受体，并且本文提供编码嵌合受体的核酸，特别是编码嵌合抗原受体(car)的核酸。


背景技术：

2.调节性t细胞(treg)是具有抑制功能的免疫细胞，可控制细胞病变性免疫反应，对维持免疫耐受至关重要。treg的抑制特性可用于治疗，例如改善和/或预防炎症性疾病、自身免疫性疾病和移植中的免疫介导的器官损伤。treg免疫疗法通常涉及treg的分离、培养和扩增，然后输注到患者体内。作为该过程的一部分，treg可以与细胞因子、药物、其他细胞或抗原一起孵育，以提高它们的活力及功能和/或赋予它们增强的对特定抗原的反应性。这些相同的目标可以通过基因工程化treg以靶向预定抗原(例如通过嵌合抗原受体(car))来实现。
3.生长因子白细胞介素2(il-2)对于treg的稳态(生成、增殖、存活)以及它们的抑制功能和表型稳定性至关重要。活化的常规t细胞(tcon)是体内il-2的主要来源。相比之下，treg不能产生il-2，而是依赖于旁分泌获得由存在于微环境中的tcon产生的il-2。
4.il-2的可用性对在体外扩增并转移到患者内的treg的治疗效果具有重要影响。这是由于以下原因：1)体外扩增方案通常需要高浓度的il-2，这使得treg高度依赖该细胞因子；
5.2)由于免疫抑制药物的施用，患者的il-2浓度经常降低；以及3)在发炎的组织微环境中，对il-2的获得通常是有限的。肝移植是一个特别具有挑战性的适应症，因为已知发炎的肝脏中的il-2水平会降低，而钙调磷酸酶抑制剂的常规使用会进一步加剧这种情况，其大大降低了tcon产生il-2的能力。低剂量外源性il-2的施用可恢复由钙调磷酸酶抑制剂诱导的treg功能障碍，并促进treg在肝脏中的积累。然而，低剂量treg的治疗用途的一个问题是同时活化tcon的风险，这会增强组织损伤。
6.wo 2017/218850描述了组成型表达stat5的工程化treg，以提供生产性il-2信号。然而，使用这种方法可以预见到几个挑战。组成型stat5表达提供了工程化treg可能发挥非特异性的强大的免疫抑制的风险，并且由于它们的高增殖率，它们可能会过度生长内源性treg池并减少其tcr库，这可以导致自身免疫。最后，考虑到已知stat5上的突变会促进t细胞幼淋巴细胞白血病，并且stat5在许多癌症中被组成型活化，这些工程化treg可能造成转化的风险。
7.调节性t细胞表达foxp3，常规t细胞可以通过在这些细胞中表达foxp3离体分化为调节性表型。foxp3表达的缺失与调节性t细胞中抑制功能的缺失和可能恢复到效应表型有关。
8.因此，仍然需要产生对具有有限il-2可用性的微环境不太敏感的工程化treg的方法，以及提高工程化treg在已施用免疫抑制药物的受试者中增殖、存活和发挥作用的有效性的方法。


技术实现要素：

9.本发明人开发了一种工程化调节性t细胞(treg)，其能够在treg与预定抗原结合时提供生产性il-2信号并且具有稳定的调节表型。因此，本发明的工程化treg解决了与过继转移的treg的高il-2依赖性相关的问题，而不需要施用外源性il-2，并通过以抗原特异性方式提供生产性il-2信号，同时保持表型和功能。特别地，生产性il-2信号可以通过在细胞内表达的嵌合受体的内结构域中包含特定基序(即stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序)来提供。发明人已经特别确定，在嵌合受体(例如，car)的内结构域中的特定基序之间使用接头可以提供增强的il-2信号，这引起工程化细胞的存活增加。特别地，在包含stat5和jak1和/或jak2基序的内结构域中的亚结构域或序列与包含jak3结合基序的内结构域中的亚结构域或序列之间可以存在接头。
10.本发明进一步特别提供了通过外源性foxp3和car的共表达而具有稳定表型和il2信号传导能力的treg细胞，所述car具有包含stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序的内结构域。
11.因此，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码嵌合受体(特别是嵌合抗原受体(car))的多核苷酸序列，其中所述嵌合受体(特别是所述car)包含内结构域，所述内结构域含有(i)stat5结合基序，以及jak1结合基序和/或jak2结合基序，和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接。
12.在另一方面，所述核酸分子可以额外地编码foxp3，因此本发明提供了一种核酸，其包含(a)编码foxp3的第一多核苷酸序列，以及(b)编码嵌合受体(特别是嵌合抗原受体(car))的第二多核苷酸序列，其中所述嵌合受体包含内结构域，所述内结构域含有(i)stat5结合基序，以及jak1结合基序和/或jak2结合基序，和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接。
13.尽管所述第一多核苷酸序列在核酸分子内可以位于相对于第二多核苷酸的5'或3'，特别地，第一多核苷酸序列相对于所述第二多核苷酸序列位于5'(即上游)。技术人员将理解，共表达序列可以适宜地位于所述核酸分子内的所述第一多核苷酸序列和所述第二多核苷酸序列之间。
14.在第二方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的核酸分子。
15.在第三方面，本发明提供了一种工程化细胞(特别是例如treg的t细胞或nk细胞)，其包含本发明的核酸分子或本发明的载体。
16.在第四方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的工程化细胞(例如，treg细胞)。
17.在第五方面，本发明提供了用于治疗的本发明的工程化细胞(例如，treg细胞)或本发明的药物组合物。
18.在另一个方面，本发明提供了一种工程化细胞(例如，treg细胞)，其用于诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫疾病或过敏性疾病、促进组
织修复和/或组织再生或者改善或治疗炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)，其中所述工程化细胞(例如，treg细胞)包含本发明的核酸分子或本发明的载体。
19.在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的工程化细胞(例如，treg)，用于诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防gvhd、自身免疫疾病或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善或治疗炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)。
20.本发明进一步涉及一种诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防gvhd、自身免疫疾病或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善或治疗炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)的方法，其包括将根据本发明的工程化细胞(例如，treg)或药物组合物施用于受试者的步骤。
21.本发明还提供了根据本发明的工程化细胞(例如，treg)在制备用于诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防细胞移植排斥和/或体液移植排斥、治疗和/或预防gvhd、自身免疫疾病或过敏性疾病、促进组织修复和/或组织再生或者改善或治疗炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)的药物中的用途。
22.更概括地说，在这些不同方面，工程化细胞可以用于治疗或预防癌症，或感染性、神经退行性、炎症性、自身免疫性或过敏性疾病，或者与不希望的或有害的免疫反应相关的任何病症。特别地，当细胞是treg或其他免疫抑制细胞时，该细胞可以用于诱导免疫抑制(即抑制不希望的或有害的免疫反应)，例如改善和/或预防炎症性疾病中的免疫介导的器官损伤、自身免疫或过敏性疾病或病症，以及在移植中。
23.特别地，本发明的细胞可以用于治疗肌萎缩侧索硬化(als)。
24.适当地，受试者(特别是人类受试者)可以是移植接受者并且本发明是针对诱导对移植物(例如移植的器官)的耐受性。特别地，受试者可以是正在接受免疫抑制治疗的移植接受者。
25.本发明进一步提供了一种生产本发明的工程化细胞(例如，treg细胞)的方法，其包括将本发明的核酸分子或本发明的载体引入细胞中(例如，多能细胞，特别是ipsc、tcon细胞，或treg细胞中)，以及从该方法获得的细胞。
26.更概括地说，本发明提供了一种生产工程化细胞(例如，treg细胞)的方法，其包括将(a)编码foxp3的第一多核苷酸序列，以及(b)编码嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))的第二多核苷酸序列引入细胞(例如，treg细胞)中，其中所述嵌合受体(例如，car)包含内结构域，所述内结构域含有(i)stat5结合基序，以及jak1结合基序和/或jak2结合基序，和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接，并且其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列包含在相同或不同的核酸分子中。
27.所述细胞也可以是多能细胞(如ipsc)或tcon。编码foxp3的核酸的引入可以使其分化或转化为treg细胞。额外的试剂可以进一步由本发明的核酸编码，或在单独的核酸上编码，以进一步帮助分化的任何必要步骤(特别地，额外的转录因子)。替代地或额外地，可以将其他试剂(例如tgfβ)添加到培养物中以帮助分化。
28.特别地，所述treg可以通过cd25的表达和免疫抑制活性来定义。
29.所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可以在相同或不同的载体中。
30.本发明进一步提供了一种增加treg细胞的抑制活性和/或持久性的方法，其包括将本发明的核酸分子或本发明的载体引入tcon细胞或treg细胞，或包括引入一种或多种核
tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rb内结构域；cd3z信号传导结构域和egfp。(d)il2r构建体1：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd28铰链结构域；cd28 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rg；截短的il2rb内结构域；cd3z信号传导结构域和egfp。(e)il2r构建体1：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd28铰链结构域；cd28 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rb内结构域；cd3z信号传导结构域；fp2a切割结构域和egfp。
38.图3
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抗hla.a2 il2r car-treg的生成
39.示意图显示了抗hla.a2 il2r car-treg的生成和扩增。(a)用抗cd3/cd28磁珠分离和活化分离的cd4+cd25hicd127low细胞。活化三天后，用含有hla.a2-car和gfp报告基因的慢病毒转导treg。每2天添加新鲜培养基和1000iu/ml il-2。将转导和未转导的treg培养10天，测量gfp以评估转导效率。用新鲜的抗cd3/cd28磁珠进一步扩增treg。(b)在活化后第10天，未转导的或用不同car构建体转导的treg的倍数变化扩增。
40.图4
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抗hla.a2 il2r构建体随时间推移的转导效率的量化
41.在细胞活化后的不同时间点，对未转导和用car构建体转导的treg进行gfp表达分析。(a)转导后7天hla-a2 il2r cartreg的gfp表达的代表性等高线图。(b)转导后7天对活cd4+细胞中的gfp
+
car treg的量化。(c)hla-a2 il2r car treg的gfp表达随着时间的推移的量化。
42.图5
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转导的treg上抗hla.a2 il2r car构建体的细胞表面表达的量化
43.通过pe缀合的hla-a*0201/cingvcwtv dextramer(immudex，哥本哈根，丹麦)分析未转导和转导的treg上car构建体的膜表达。(a)转导后7天gfp+dextramer+car treg的代表性等高线图。(b)在转导后第7天对gfp+treg中的dextramer+细胞的量化。
44.图6
–
多克隆细胞扩增后car treg的表型特征
45.在抗cd3/cd28活化磁珠和il-2的存在下培养和扩增treg 15天。通过facs对未转导和转导的treg上的treg相关标记foxp3、helios、ctla4和tigit进行分析，以评估培养第15天的表型谱系稳定性。
46.图7
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抗hla.a2 il2r car treg的抗原特异性的评估
47.在存在不同刺激的情况下，将未转导和转导的treg培养18小时。分析cd69和cd137活化标志物以评估特异性和非特异性细胞活化。(a)代表性的等高线图显示了cd69的表达对用hla.a1或hla.a2分子转导的k562细胞培养时的反应。gfp信号用于选择转导的treg。(b)仅用培养基(未刺激)、抗cd3/cd28磁珠(非特异性刺激)、k562-hla.a1和k562-hla.a2细胞培养18小时后，对treg上的cd69和cd137表达的量化。(c)代表性的直方图显示了用hla.a1和hla.a2 b细胞系培养18小时后treg上的cd69表达。使用了不同的细胞与细胞的比例。
48.图8
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stat5磷酸化分析作为il2r car信号传导的指标
49.转导的car treg在不含il2的培养基中静息过夜。在仅用培养基、1000iu/ml il-2或在基于hla.a2-ig的人工apc(按照doi:10.3791/2801描述的方案生产)存在的情况下培养10分钟和120分钟后，通过facs分析评估treg的stat5磷酸化。(a)等高线图显示了仅用培养基、hla.a2磁珠以1:1的比例和1000iu/ml il-2培养10分钟后，转导的car-treg上gfp和磷酸化stat5的表达。(b)直方图显示了用hla.a2磁珠1:1比例或仅培养基(未刺激)培养120分钟的treg的stat5的磷酸化。
50.图9
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在不存在il-2的情况下，非特异性和hla.a2特异性活化后的treg存活率的评估
51.在不存在il-2的情况下，用抗cd3/28活化磁珠和k562.a2表达细胞培养具有不同构建体的car转导treg。在活化后7天通过facs分析评估细胞存活率。(a)car-treg的代表性直方图显示了在没有il-2的情况下活化后第7天，基于活性染料染色的gfp+细胞的细胞存活率。(b)在不存在il-2的情况下用抗cd3/28磁珠和k562-hla.a2细胞培养7天后，gfp+treg上的活细胞百分比。
52.图10
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treg抑制效力测试：通过分析b细胞上共刺激分子的调节来评估treg的免疫调节功能
53.分析与treg共培养后b细胞cd80和cd86的表达，以评估treg降低抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。将固定数量的表达a2的活b细胞(20k/孔)与滴定数量的treg产物(a2阴性供体)(200k、100k、50k、25k、12.5k)共培养过夜。b细胞上cd86和cd80共刺激标志物的facs分析。
54.图11a
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说明性的hla-a2特异性car构建体设计
55.编码hla-a2特异性car(表示为a2 car)的说明性载体的示意图：构建体f-c：表示编码5'-foxp3-p2a-a2 car-3'的构建体；构建体r-c：表示编码5'-r-p2a-a2 car-3'的构建体，其中r是另一个基因；构建体c：表示仅编码a2 car的构建体；构建体c-r：表示编码5'-a2 car-p2a-r-3'的构建体，其中r是另一个基因。
56.图11b
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foxp3/hla-a2 car-treg的生成
57.示意图显示了foxp3/hla-a2 car-treg的生成和扩增。phoenix-gp(p.gp)细胞是一种稳定表达gag pol的逆转录病毒包装细胞系，以1
×
106个细胞/10mm接种在细胞培养皿。第二天，分离出cd4+cd25hicd127low细胞，并在没有il-2的情况下用抗cd3/cd28磁珠活化。在同一天，使用fugene转染试剂，以包膜和编码foxp3/hla.a2-car的构建体转染p.gp细胞。活化两天后，用含有并补充il-2的g-逆转录病毒转导treg。每2天向细胞补充额外的培养基和il-2。hla.a2 dextramer用于评估第6天的转导效力。用新鲜的抗cd3/cd28磁珠进一步扩增treg。
58.图12
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hla-a2特异性car和foxp3在转导的treg中的表达
59.图12显示了与模拟对照treg相比，在用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg中，通过流式细胞术测定的hla-a2特异性car(a2 car)表达水平、foxp3表达水平和另一个基因r的表达水平。
60.图12a显示了模拟treg和用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg的dextramer(hla)对ssc-a的cd3+cd4+门控facs图。用每个构建体转导的treg表达hla-a2特异性car。
61.图12b显示了模拟treg和用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg的foxp3表达与另一基因r表达的cd3+cd4+dextramer+门控facs图。基因r在用构建体r-c和构建体c-r转导的treg中高水平表达。foxp3在所有treg中都有表达，但在构建体f-c中明显更高，特别是与仅表达hla-a2特异性car(构建体c)相比。
62.图13
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hla-a2特异性car和foxp3在转导和扩增的treg中的表达
63.图13显示了与模拟对照treg相比，在用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体
c-r转导的扩增的treg中，通过流式细胞术测定的hla-a2特异性car(a2 car)表达水平、foxp3表达水平和另一个基因r的表达水平。
64.图13a显示了模拟扩增的treg和用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导并随后扩增的treg的dextramer(hla)对ssc-a的cd3+cd4+门控facs图。用每种构建体转导的treg在扩增后仍然表达hla-a2特异性car。
65.图13b显示了对于模拟扩增的treg和用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导并随后扩增的treg的foxp3表达相对于另一个基因r表达的cd3+cd4+dextramer+门控facs图。在扩增后用构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg中foxp3表达降低。相反，foxp3表达在扩增后转导构建体f-c的treg中没有降低。因此，foxp3表达在扩增后的构建体f-c中显著更高，特别是与仅表达hla-a2特异性car(构建体c)相比时。
66.图14
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本发明的car的示意图
67.图14显示了本发明的car的示意图，其包含内结构域，内结构域含有由接头连接的截短的il2rγ结构域和截短的il2rβ结构域。
68.图15
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抗hla.a2 il2r car构建体的示例性设计
69.图15显示了示例性抗hla.a2 car构建体的示意图，该构建体包括il2r内结构域和柔性接头序列的不同组合。对照(seq id no:182)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域(seq id no:194)；cd8跨膜(tm)(seq id no:195)；cd28信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-ci(seq id no:183)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cii(seq id no:184)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-ciii(seq id no:185)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-civ(seq id no:186)：hla.a2scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；(ggggs)3柔性接头(seq id no:155)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cv(seq id no:187)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；(ggggs)4柔性接头(seq id no:158)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cvi(seq id no:188)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；(gly)6柔性接头(seq id no:159)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cvii(seq id no:189)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；(gly)8柔性接头(seq id no:160)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cviii(seq id no:190)：hla.a2 scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；kesgsvsseqlaqfrsld柔性接头(seq id no:166)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cix(seq id no:191)：hla.a2scfv抗原识别结构域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；egkssgsgseskst柔性接头(seq id no:167)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。qtx01-cx(seq id no:192)：hla.a2 scfv抗原识别结构
域；cd8铰链结构域；cd8 tm；cd28信号传导结构域；截短的il2rγ信号传导结构域；gsagsaagsgef柔性接头(seq id no:168)；截短的il2rβ信号传导结构域；cd3ζ信号传导结构域。
70.图16
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抗hla.a2 il2r car和rqr8的细胞表面表达，以及foxp3在转导的treg中的细胞内表达。
71.图16显示了(a)在转导的treg上表达位于膜上的car构建体的cd4
+
cd25
+
treg细胞的百分比。(b)car构建体每种treg条件的平均荧光强度(mfi)几何平均值(geo mean)。(c)表达位于膜上的报告分子rqr8(seq id no:193)的cd4
+
cd25
+
treg细胞百分比。(d)每种treg条件下rqr8(seq id no:193)的qbend/10mfi值。(e)在转导的treg上表达细胞内foxp3转录因子的cd4
+
cd25
+
treg细胞的百分比。(f)显示了每种treg条件下foxp3的mfi值。条形图显示了平均值+标准偏差(sd)。n＝2至16位个人捐赠者。
72.图17
–
抗hla.a2 il2r car treg中的抗原特异性活化能力的评估
73.图17显示了转导的car treg与hla-a1
+
k562(a1)；hla-a2
+
k562(a2)；抗cd3/cd28包被的磁珠(磁珠；非特异性刺激)或仅培养基(未刺激)培养后，通过流式细胞术测定的t细胞活化标志物(a)cd69和(b)cd137的水平。条形图显示了平均值+sd。n＝2至16位个人捐赠者。
74.图18
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在不存在il-2的情况下，非特异性和hla.a2特异性活化后的treg存活率的评估，归一化为相对的car表达
75.图18显示了在不存在il2；hla-a1
+
k562(a1)；hla-a2
+
k562(a2)；或仅培养基(未刺激)的情况下，在各种刺激物存在下共培养后转导的car treg的存活能力。活的cd4
+
cd25
+
qbend/10
+
treg群的百分比显示为归一化的a2
+
dextramer
+
(car)表达的相对mfi。从图中显示的数值中预先减去来自“仅培养基”的培养物得出的存活率百分比。条形图显示了平均值。虚线显示了在hla-a2
+
k562存在下培养的con 1treg存活率百分比的平均值。trs-78、trs-95和trs-96是个人捐赠者的匿名名称。n＝3。
76.图19
–
在不存在il-2的情况下，非特异性和hla.a2特异性活化后的treg存活率的评估，在hla.a2参与后归一化为cd69表达
77.图19显示了在不存在il2；hla-a1
+
k562(a1)；hla-a2
+
k562(a2)；或仅培养基(未刺激)的情况下，在各种刺激物存在下共培养后转导的car treg的存活能力。活的cd4
+
cd25
+
qbend/10-treg群的百分比显示为在hla.a2参与后归一化为cd69表达的相对百分比。从图中显示的数值中预先减去来自“仅培养基”的培养物得出的存活率百分比。条形图显示了平均值。虚线显示了在hla-a2
+
k562存在下培养的对照treg存活率百分比的平均值。trs-95和trs-96是个人捐赠者的匿名名称。n＝2。
78.图20
–
stat5磷酸化分析作为il2r car信号传导的指标(elisa)
79.图20显示了使用光学密度(od
450
)测量通过elisa检测转导的car treg与a2磁珠结合后的pstat5的水平。从图中显示的数值中预先减去来自“仅培养基”的培养物得出的od
450
读数。trs-96是个人捐赠者的匿名名称。条形图显示了平均值+sd。该实验是用技术复制品进行的。n＝1。
80.图21
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stat5磷酸化分析作为il2r car信号传导的指标(蛋白质印迹)
81.图21显示了通过蛋白质印迹的转导的car treg的pstat5蛋白的水平。该图显示了通过体积或阳性检测百分比测量的pstat5蛋白水平的归一化(为上样对照)的密度分析。从
图中显示的数值中预先减去来自“仅培养基”的培养物的pstat5蛋白背景检测。trs-96是个人捐赠者的匿名名称。条形图显示了平均值。n＝1。
具体实施方式
82.工程化细胞(例如，调节性t细胞(treg))
83.如本文所用，“工程化细胞”是指已被修饰以包含或表达多核苷酸的细胞，所述多核苷酸不是由细胞天然编码，或换言之所述多核苷酸非天然存在于细胞中，或其中多核苷酸的表达产物不是由细胞天然编码。用于工程化细胞的方法在本领域中是已知的并且包括但不限于细胞的遗传修饰，例如通过转导(如逆转录病毒或慢病毒转导)，包括脂质体转染、聚乙二醇、磷酸钙和电穿孔的转染(如基于dna或rna的瞬时转染)。可以使用任何合适的方法将核酸序列引入细胞。根据本发明，如两亲性细胞穿透肽的非病毒技术可以用于引入核酸。
84.相应地，编码如本文所述的嵌合受体(例如，car)的多核苷酸不是由相应的未修饰细胞天然表达的。适当地，工程化细胞是已经被修饰以将多核苷酸引入细胞的细胞，例如，通过转导或转染。适当地，工程化细胞是已经被修饰的细胞或者其基因组已经被修饰的细胞，例如通过转导或转染。适当地，工程化细胞是已经被修饰的细胞或者其基因组已经通过逆转录病毒转导而被修饰的细胞。适当地，工程化细胞是已经被修饰的细胞或者其基因组已经通过慢病毒转导而被修饰的细胞。
85.如本文所用，术语“引入”是指将外源dna或rna插入细胞的方法。如本文所用，引入的术语包括转导方法和转染方法。转染是通过非病毒方法将核酸引入细胞的过程。转导是通过病毒载体将外源dna或rna引入细胞的过程。根据本发明的工程化细胞可以通过以包括用病毒载体转导、用dna或rna转染的多种方法中的一种将编码如本文所述的嵌合受体(例如，car)的dna或rna引入而产生。可以在引入编码本文所述的嵌合受体(例如，car)的多核苷酸之前或之后活化和/或扩增细胞，例如通过用抗cd3单克隆抗体或抗cd3和抗cd28单克隆抗体处理。treg也可以在抗cd3和抗cd28单克隆抗体与il-2组合存在的情况下扩增。适当地，il-2可以用il-15代替。可用于treg扩增方案的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式维甲酸(atra)和tgfβ。如本文所用，“活化”是指细胞已被刺激，引起细胞增殖。如本文所用，“扩增”是指细胞或细胞群已被诱导以增殖。细胞群的扩增可以通过例如计数存在于群中的细胞数量来测量。细胞的表型可以通过本领域已知的方法来确定，如流式细胞术。
86.本发明的工程化细胞可以是任何细胞，但特别地可以是免疫细胞，如t细胞或nk细胞。特别地，所述细胞可以是tcon或treg。所述细胞可以是tcon或treg的前体。
87.或者，工程化细胞可以是多能细胞(如ipsc)。技术人员将理解，此类工程化多能细胞将能够分化成任何细胞类型，并且特别地可以分化成免疫细胞，如t细胞(例如，treg)或nk细胞。分化可以通过中间细胞群发生，例如，多能细胞可以分化为tcon，tcon可以转化为treg。这种工程化的多能细胞可以用作同种异体产品策略的一部分。ipsc在商业上广泛可得使用，并且可以衍生自体细胞成纤维细胞、cd34+造血干细胞等。
88.本发明的工程化细胞可以是细胞群的一部分。适当地，工程化细胞群包含至少70％的工程化细胞，如至少75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的工程化细胞。或者，如果细胞是免疫细胞，细胞群可以包含至少70％的免疫细胞，如至少75％、80％、85％、
90％、95％、97％、98％或99％的免疫细胞(例如，t细胞或nk细胞)。
89.调节性t细胞(treg)是具有免疫抑制功能的免疫细胞，其控制细胞病变性免疫反应，对维持免疫耐受至关重要。
90.如本文所用，术语treg是指具有免疫抑制功能的t细胞。如本文所用的t细胞是淋巴细胞，其包括任何类型的t细胞，如αβt细胞(例如cd8或cd4+)、γδt细胞、记忆t细胞、treg细胞等。
91.适当地，免疫抑制功能可以指treg减少或抑制由免疫系统响应于诸如病原体、同种异体抗原或自身抗原的刺激而促进的多种生理和细胞效应中的一种或多种的能力。这种效应的实例包括常规t细胞(tconv)增殖和促炎细胞因子分泌的增加。任何此类效应都可以用作免疫反应强度的指标。在存在treg的情况下，tconv的相对较弱的免疫反应表明treg有抑制免疫反应的能力。例如，细胞因子分泌的相对减少表明免疫反应较弱，因此表明treg抑制免疫反应的能力。treg还可以通过调节抗原呈递细胞(apc)(如b细胞、树突细胞和巨噬细胞)上的共刺激分子的表达来抑制免疫反应。cd80和cd86的表达水平可用于评估活化treg在体外共培养后的抑制效力。
92.用于测量免疫反应强度的指标，从而测量treg的抑制能力的测定法是本领域已知的。具体地，抗原特异性tconv细胞可以与treg共培养，并且将相应抗原的肽添加到共培养物中以刺激来自tconv细胞的反应。tconv细胞的增殖程度和/或它们响应于肽的添加而分泌的细胞因子il-2的量可以用作共培养的treg的抑制能力的指标。
93.与本发明的treg共培养的抗原特异性tconv细胞与在没有本发明的treg的情况下培养的相同的tconv细胞相比，可以少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。例如，与本发明的treg共培养的抗原特异性tconv细胞与在存在非工程化treg的情况下培养的相同的tconv细胞相比，可以少增殖5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、90％、95％或99％。与非工程化treg或与缺乏外源性foxp3但工程化以包含相同嵌合受体(例如，car)、且所述嵌合受体的内结构域中缺失stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序的treg相比，本发明的treg可以具有增加的抑制活性(例如至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的增加的抑制活性)。
94.与本发明的treg共培养的抗原特异性tconv细胞与在不存在本发明的treg的情况下(例如在存在非工程化treg或缺乏外源性foxp3但工程化以包含相同嵌合受体(例如，car)、且所述嵌合受体的内结构域中缺失stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序的treg的情况下)培养的相应tconv细胞相比，可以少表达至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％的效应细胞因子。
95.效应细胞因子可以选自il-2、il-17、tnfα、gm-csf、ifn-γ、il-4、il-5、il-9、il-10和il-13。
96.适当地，效应细胞因子可以选自il-2、il-17、tnfα、gm-csf和ifn-γ。
97.适当地，treg是表达标志物cd4、cd25和foxp3(cd4
+
cd25
+
foxp3
+
)的t细胞。“foxp3”是叉头盒p3蛋白的简称。foxp3是转录因子的fox蛋白家族的成员，在调节性t细胞的发育和功能中作为调节途径的主要调节因子发挥作用。
98.treg也可以表达ctla-4(细胞毒性t淋巴细胞相关分子4)或gitr(糖皮质激素诱导
的tnf受体)。treg细胞存在于外周血、淋巴结和组织中，包括源自胸腺的天然treg(ntreg)细胞和外周生成的诱导treg(itreg)细胞。
99.适当地，可以在不存在表面蛋白cd127或与表面蛋白cd127的低水平表达组合(cd4
+
cd25
+
cd127-或cd4
+
cd25
+
cd127
low
)的情况下使用细胞表面标志物cd4和cd25来鉴定treg。使用此类标志物来鉴定treg在本领域中是已知的并且记载于例如liu等中(jem；2006；203；7(10)；1701-1711)。
100.treg可以是cd4
+
cd25
+
foxp3
+
t细胞。
101.treg可以是cd4
+
cd25
+
cd127-t细胞。
102.treg可以是cd4
+
cd25
+
foxp3
+
cd127-/low t细胞。
103.treg可以是天然的或胸腺来源的、适应性的或外周来源的，或者是体外诱导的(abbas,a.k.等,2013.nature immunology,14(4),第307-308页)。
104.适当地，treg可以是天然treg(ntreg)。如本文所用，术语“天然treg”是指胸腺来源的treg。天然treg是cd4-cd25
+
foxp3
+
helios
+
neuropilin 1
+
。与itreg相比，ntreg具有更高的pd-1(程序性细胞死亡1，pdcd1)、神经纤毛蛋白1(nrp1)、helios(ikzf2)和cd73的表达。根据helios蛋白或神经纤毛蛋白1(nrp1)的分别表达，可以将ntreg与itreg区分开来。
105.treg可以具有去甲基化的treg特异性去甲基化区(tsdr)。tsdr是调节foxp3表达的重要甲基化敏感元件(polansky,j.k.等,2008.european journal ofimmunology,38(6),第1654-1663页)。
106.其他合适的treg包括但不限于tr1细胞(其不表达foxp3，并具有高il-10产量)、cd8
+
foxp3
+
t细胞以及γδfoxp3
+
t细胞。
107.用于确定细胞标志物存在的方法是本领域公知的，包括例如流式细胞术。
108.适当地，所述细胞(如treg)是从获自受试者的外周血单核细胞(pbmc)中分离的。适当地，获得的pbmc所来自的受试者是哺乳动物，优选人。适当地，所述细胞与将被施用工程化treg的受试者相匹配(例如hla相匹配)或是自体的。适当地，待治疗的受试者是哺乳动物，优选人。所述细胞可以从患者自己的外周血(第一方)或在造血干细胞移植的情况下从供体外周血(第二方)或从没有关系的供体的外周血(第三方)中离体生成。适当地，所述细胞对将被施用工程化treg的受试者而言是自体的。
109.适当地，treg是从获自受试者的外周血单核细胞(pbmc)中分离的。在优选的实施方案中，treg分离自从受试者获得的外周血单核细胞(pbmc)并且与待治疗的受试者相匹配或是自体的。
110.或者，treg可以从脐带血或胸腺中分离，例如，从小儿胸腺中分离。
111.适当地，treg是从待治疗的受试者中分离的。
112.适当地，所述treg是treg群的一部分。适当地，treg群含至少70％的treg，如至少75％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的treg。这样的群可以被称为“富集的treg群”。
113.在一些方面，treg可以源自诱导型祖细胞(例如ipsc)或胚胎祖细胞向treg的离体分化中。本发明的核酸分子或载体可以在分化为treg之前或之后被引入诱导型祖细胞或胚胎祖细胞中。用于分化的合适方法是本领域已知的并且包括在haque等,jvis exp.,2016,117,54720(通过引用并入本文)中公开的方法。
114.如本文所用，术语“常规t细胞”或tcon或tconv(在本文中可互换使用)是指表达αβ
t细胞受体(tcr)以及共受体的t淋巴细胞，所述共受体可以是分化簇4(cd4)或分化簇8(cd8)，且不具有免疫抑制功能。常规t细胞存在于外周血、淋巴结和组织中。适当地，工程化treg可以以多种方法(包括用病毒载体转导，或用相同或不同载体上的dna或rna转染)中的一种，通过引入编码foxp3的dna或rna以及编码如本文所述的嵌合受体(例如，car)的dna或rna至tcon而生成。或者，工程化treg可以通过在il-2和tgf-β的存在下体外培养cd4+cd25-foxp3-细胞而从tcon生成。
115.与没有外源性foxp3但工程化以表达相同嵌合受体(例如，car)、且所述嵌合受体的内结构域中缺失stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序的treg细胞相比，本发明的treg可以具有增加的持久性。如本文所用，“持久性”定义了treg在特定环境中可以存活的时间长度，例如在体内(例如在人类患者或动物模型中)。与用嵌合受体(例如，car)工程化但内结构域缺失stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和jak3结合基序且没有外源性foxp3的treg相比，本发明的treg可以具有至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的增加的持久性。
116.foxp3
117.在本发明中，通过将如本文所述的编码foxp3多肽的核酸分子或载体引入细胞中，任选地增加细胞(例如treg)中的foxp3表达。因此，本发明还提供了一种增加细胞中(例如在treg中或cd4+细胞中)foxp3的方法。
[0118]“foxp3”是叉头盒p3蛋白的简称。foxp3是转录因子的fox蛋白家族的成员，在调节性t细胞的发育和功能中作为调节途径的主要调节因子发挥作用。如本文所用的“foxp3”涵盖了foxp3的变体、同种型和功能片段。
[0119]“增加的foxp3表达”意指与未修饰的相应细胞(或细胞群)相比，细胞(或细胞群)中foxp3 mrna和/或蛋白质的水平增加。例如，根据本发明修饰的细胞(或此类细胞群)中的foxp3 mrna和/或蛋白质的水平与未根据本发明修饰的相应细胞(或此类细胞群)中的水平相比可以增加到至少1.5倍、至少2倍、至少5倍，至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍。优选地，所述细胞是treg或者所述细胞群是treg群。适当地，根据本发明修饰的细胞(或此类细胞群)中的foxp3 mrna和/或蛋白质的水平与未根据本发明修饰的相应细胞(或此类细胞群)中的水平相比可以增加到至少1.5倍、2倍或5倍以上。优选地，所述细胞是treg或者所述细胞群是treg群。
[0120]
用于测量特定mrna和蛋白质水平的技术是本领域公知的。可以通过诸如affymetrix ebioscience prime flow rna试验、rna印迹法、基因表达系列分析(sage)或定量聚合酶链式反应(qpcr)等技术来测量细胞群(如treg)中的mrna水平。可以通过诸如流式细胞术、高效液相色谱法(hplc)、液相色谱-质谱法(lc/ms)、蛋白质印迹法或酶联免疫吸附试验(elisa)等技术来测量细胞群中的蛋白质水平。
[0121]“foxp3多肽”是具有foxp3活性的多肽，即能够结合foxp3靶dna并作为调节treg发育和功能的转录因子而起作用的多肽。具体地，foxp3多肽可以具有与野生型foxp3(seq id no.52)相同或相似的活性，例如可以具有野生型foxp3多肽活性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％。因此，与野生型foxp3相比，由本文所述的核酸或载体编码的foxp3多肽可以具有增加或减少的活性。用于测量转录因子活性的技术是本领域公知的。例如，可以通过chip测量转录因子dna结合活性。转录因
子的转录调节活性可以通过量化其调节的基因的表达水平来测量。基因表达可以通过使用诸如rna印迹法、sage、qpcr、hplc、lc/ms、蛋白质印迹法或elisa等技术测量由基因产生的mrna和/或蛋白质的水平来量化。由foxp3调节的基因包括细胞因子，如il-2、il-4和ifn-γ(siegler等，annu.rev.immunol.2006,24:209-26，通过引用并入本文)。如下文详细讨论的，foxp3或foxp3多肽包括其功能片段、变体和同种型，例如seq id no:52的功能片段、变体和同种型。
[0122]“foxp3的功能片段”可以指与全长foxp3多肽或多核苷酸具有相同或相似活性的foxp3多肽或编码foxp3多肽的多核苷酸的部分或区域。功能性片段可以具有全长foxp3多肽或多核苷酸的活性的至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的活性。本领域技术人员将能够基于foxp3的已知结构和功能特征来生成功能片段。这些描述于例如song,x.等,2012.cell reports,1(6),第665-675页；lopes,j.e.等,2006.the journal of immunology,177(5),第3133-3142页；以及lozano,t.等,2013.frontiers in oncology,3,第294页中。此外，在wo2019/241549(通过引用并入本文)中描述了n和c末端截短的foxp3片段，例如，具有如下讨论的序列seq id no:150。
[0123]“foxp3变体”可以包括氨基酸序列或核苷酸序列，其可以与foxp3多肽或编码foxp3多肽的多核苷酸(例如seq id no:52)具有至少50％、至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％的同一性，优选至少95％或至少97％或至少99％的同一性。foxp3变体可以具有与野生型foxp3多肽或多核苷酸相同或相似的活性，例如可以具有野生型foxp3多肽或多核苷酸活性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％或150％的活性。本领域技术人员将能够基于foxp3的已知结构和功能特征和/或使用保守取代来生成foxp3变体。与野生型foxp3相比，foxp3变体在treg细胞内可以具有相似或相同的周转时间(或降解率)，例如野生型foxp3在treg中的周转时间(或降解率)的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。与野生型foxp3相比，一些foxp3变体可以具有减少的周转时间(或降解速率)，例如，在seq id no:52的第418位和/或第422位氨基酸处具有氨基酸取代的foxp3变体，例如s418e和/或s422a，如wo2019/241549(通过引用并入本文)中所描述的。
[0124]
foxp3多肽序列
[0125]
适当地，如本文所述的核酸分子或载体编码的foxp3多肽可以包含或由人foxp3的多肽序列组成，如uniprotkb登录号q9bzs1(seq id no:52)或其功能片段或变体：
[0126]
foxp3，uniprotkb登录号q9bzs1(seq id no:52)：
[0127]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgp
[0128]
在本发明的一些实施方案中，foxp3多肽包含或由与seq id no:52至少70％相同的氨基酸序列或其功能片段组成。适当地，foxp3多肽包含或由与seq id no:52至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或其功能片段组
成。在一些实施方案中，foxp3多肽包含或由seq id no:52或其功能片段组成。
[0129]
在一些实施方案中，如上所述，foxp3多肽可以包含在seq id no:52的残基418和/或422处的突变，如下：
[0130]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkreqrpsrcsnptpgp(seq id no:147)；
[0131]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrparcsnptpgp(seq id no:148)；或者
[0132]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkarpglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqqlvlekeklsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkreqrparcsnptpgp(seq id no:149)。
[0133]
在本发明的一些实施方案中，foxp3多肽可以在n末端和/或c末端被截短，从而产生功能片段。具体地，foxp3的n末端和c末端截短的功能片段可以包含或由以下氨基酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的功能变体组成：
[0134]
ggahassssl npmppsqlql ptlplvmvap sgarlgplph lqallqdrph fmhqlstvda hartpvlqvh plespamisl tppttatgvf slkarpglpp ginvaslewv srepallctf pnpsaprkds tlsavpqssy pllangvckw pgcekvfeep edflkhcqad hlldekgraq cllqremvqs leqqlvleke klsamqahla gkmaltkass vassdkgscc ivaagsqgpv vpawsgprea pdslfavrrh lwgshgnstf peflhnmdyf kfhnmrppft yatlirwail eapekqrtln eiyhwftrmf affrnhpatw knairhnlsl hkcfvrvese kgavwtvdel ef(seq id no:150)
[0135]
适当地，foxp3多肽可以是seq id no:52的变体，例如天然变体。适当地，foxp3多肽是seq id no:52的同种型。例如，foxp3多肽可以包含相对于seq id no:52的第72-106位氨基酸的缺失。或者，foxp3多肽可以包含相对于seq id no:52的第246-272位氨基酸的缺失。
[0136]
适当地，foxp3多肽包含seq id no:151或其功能片段：
[0137]
示例性的foxp3多肽(seq id no:151)：
[0138]
mpnprpgkpsapslalgpspgaspswraapkasdllgargpggtfqgrdlrggahasssslnpmppsqlqlptlplvmvapsgarlgplphlqallqdrphfmhqlstvdahartpvlqvhplespamisltppttatgvfslkar
pglppginvaslewvsrepallctfpnpsaprkdstlsavpqssypllangvckwpgcekvfeepedflkhcqadhlldekgraqcllqremvqsleqveelsamqahlagkmaltkassvassdkgsccivaagsqgpvvpawsgpreapdslfavrrhlwgshgnstfpeflhnmdyfkfhnmrppftyatlirwaileapekqrtlneiyhwftrmfaffrnhpatwknairhnlslhkcfvrvesekgavwtvdelefrkkrsqrpsrcsnptpgpegrgslltcgdveen
[0139]
适当地，foxp3多肽包含或由与seq id no:151至少70％相同的氨基酸序列或其功能片段组成。适当地，foxp3多肽包含与seq id no:151至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或其功能片段。在一些实施方案中，foxp3多肽包含或由seq id no:151或其功能片段组成。
[0140]
适当地，foxp3多肽可以是seq id no:151的变体，例如天然变体。适当地，foxp3多肽是seq id no:151的同种型或其功能片段。例如，foxp3多肽可以包含相对于seq id no:151的第72-106位氨基酸的缺失。或者，foxp3多肽可以包含相对于seq id no:151的第246-272位氨基酸的缺失。
[0141]
foxp3多核苷酸序列
[0142]
适当地，编码foxp3多肽的多核苷酸包含或由如seq id no:152所示的多核苷酸序列组成：
[0143]
示例性的foxp3多核苷酸(seq id no:152)：
[0144]
atgcccaaccccaggcctggcaagccctcggccccttccttggcccttggcccatccccaggagcctcgcccagctggagggctgcacccaaagcctcagacctgctgggggcccggggcccagggggaaccttccagggccgagatcttcgaggcggggcccatgcctcctcttcttccttgaaccccatgccaccatcgcagctgcagctgcccacactgcccctagtcatggtggcaccctccggggcacggctgggccccttgccccacttacaggcactcctccaggacaggccacatttcatgcaccagctctcaacggtggatgcccacgcccggacccctgtgctgcaggtgcaccccctggagagcccagccatgatcagcctcacaccacccaccaccgccactggggtcttctccctcaaggcccggcctggcctcccacctgggatcaacgtggccagcctggaatgggtgtccagggagccggcactgctctgcaccttcccaaatcccagtgcacccaggaaggacagcaccctttcggctgtgccccagagctcctacccactgctggcaaatggtgtctgcaagtggcccggatgtgagaaggtcttcgaagagccagaggacttcctcaagcactgccaggcggaccatcttctggatgagaagggcagggcacaatgtctcctccagagagagatggtacagtctctggagcagcagctggtgctggagaaggagaagctgagtgccatgcaggcccacctggctgggaaaatggcactgaccaaggcttcatctgtggcatcatccgacaagggctcctgctgcatcgtagctgctggcagccaaggccctgtcgtcccagcctggtctggcccccgggaggcccctgacagcctgtttgctgtccggaggcacctgtggggtagccatggaaacagcacattcccagagttcctccacaacatggactacttcaagttccacaacatgcgaccccctttcacctacgccacgctcatccgctgggccatcctggaggctccagagaagcagcggacactcaatgagatctaccactggttcacacgcatgtttgccttcttcagaaaccatcctgccacctggaagaacgccatccgccacaacctgagtctgcacaagtgctttgtgcgggtggagagcgagaagggggctgtgtggaccgtggatgagctggagttccgcaagaaacggagccagaggcccagcaggtgttccaaccctacacctggcccctga(seq id no:152)
[0145]
在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:152至少70％相同的多核苷酸序列或其功能片段。适当地，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:152至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列或其功能片段。在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含或由seq id no:152或其功能片段组成。
[0146]
适当地，编码foxp3多肽的多核苷酸包含或由如seq id no:153所示的多核苷酸序列组成：
[0147]
示例性的foxp3多核苷酸(seq id no:153)：
[0148]
gaattcgtcgacatgcccaaccccagacccggcaagccttctgccccttctctggccctgggaccatctcctggcgcctccccatcttggagagccgcccctaaagccagcgatctgctgggagctagaggccctggcggcacattccagggcagagatctgagaggcggagcccacgcctctagcagcagcctgaatcccatgccccctagccagctgcagctgcctacactgcctctcgtgatggtggcccctagcggagctagactgggccctctgcctcatctgcaggctctgctgcaggaccggccccactttatgcaccagctgagcaccgtggacgcccacgccagaacacctgtgctgcaggtgcaccccctggaaagccctgccatgatcagcctgacccctccaaccacagccaccggcgtgttcagcctgaaggccagacctggactgccccctggcatcaatgtggccagcctggaatgggtgtcccgcgaacctgccctgctgtgcaccttccccaatcctagcgcccccagaaaggacagcacactgtctgccgtgccccagagcagctatcccctgctggctaacggcgtgtgcaagtggcctggctgcgagaaggtgttcgaggaacccgaggacttcctgaagcactgccaggccgaccatctgctggacgagaaaggcagagcccagtgcctgctgcagcgcgagatggtgcagtccctggaacagcagctggtgctggaaaaagaaaagctgagcgccatgcaggcccacctggccggaaagatggccctgacaaaagccagcagcgtggccagctccgacaagggcagctgttgtatcgtggccgctggcagccagggacctgtggtgcctgcttggagcggacctagagaggcccccgatagcctgtttgccgtgcggagacacctgtggggcagccacggcaactctaccttccccgagttcctgcacaacatggactacttcaagttccacaacatgaggccccccttcacctacgccaccctgatcagatgggccattctggaagcccccgagaagcagcggaccctgaacgagatctaccactggtttacccggatgttcgccttcttccggaaccaccccgccacctggaagaacgccatccggcacaatctgagcctgcacaagtgcttcgtgcgggtggaaagcgagaagggcgccgtgtggacagtggacgagctggaatttcggaagaagcggtcccagaggcccagccggtgtagcaatcctacacctggccctgagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcc(seq id no:153)。
[0149]
在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:153至少70％相同的多核苷酸序列或其功能片段。适当地，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含与seq id no:153至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的多核苷酸序列或其功能片段。在本发明的一些实施方案中，编码foxp3多肽或变体的多核苷酸包含或由seq id no:153或其功能片段组成。
[0150]
适当地，编码foxp3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以是密码子优化的。适当地，编码foxp3多肽或其功能片段或变体的多核苷酸可以是为在人细胞中表达而密码子优化的。
[0151]
嵌合受体(cr)
[0152]
如本文所用，“嵌合受体”或“cr”是指可赋予细胞结合特异性的工程化受体。嵌合受体可以结合配体(通常是生物分子)，特别是抗原或另一个生物分子(例如，细胞因子或任何其他可溶性分子)。因此，通常，本发明的嵌合受体可以包含能够结合配体的配体结合结构域(特别是配体结合外结构域)。
[0153]
如本文所指的嵌合受体具体包括赋予细胞抗原特异性的car，如下文详细讨论的。
[0154]
本发明的嵌合受体可以能够结合任何生物分子，因此配体结合结构域可以包括任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的用于感兴趣的生物分子的结合配偶体(例如，其结合至诸如抗原、生物受体、抗体(例如，利妥昔单抗、抗cd34抗体)、细胞因子(例如，
il10、il7、il15、il33)、趋化因子(例如，cxc 12、ccl2、ccl4、ccl5和ccl22)，分泌因子(例如，肿瘤分泌因子(例如，前列腺特异性抗原(psa)、癌胚抗原(cea)、血管内皮生长因子(vegf)和ca125))等配体)。
[0155]
嵌合受体的配体结合结构域有充分的文献记载，例如可以在wo2012/138858、wo2017/029512等中找到实例，这些文献通过引用并入。配体结合结构域的进一步的讨论和实例可以在下面对嵌合抗原受体的详细讨论中找到，包括基于抗体的配体结合结构域和基于受体的配体结合结构域。
[0156]
在一个具体实施方案中，本文定义的嵌合受体不包含第一异二聚化结构域和第二异二聚化结构域。第一异二聚化结构域和第二异二聚化结构域(分别为ht1和ht2)在二聚化化学诱导剂(cid)的存在下，允许一对相同的嵌合受体相互作用，使得来自一个嵌合受体的ht1与来自另一嵌合受体的ht2异二聚化，引起两个信号传导结构域的二聚化，特别是使得在所述二聚化时，诱导stat5介导的信号传导。因此，本发明的嵌合受体可以不包含一对同源异二聚化结构域。
[0157]
通常，本发明的嵌合受体包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域、任选地一个或多个共刺激结构域，以及细胞内信号传导结构域(也称为内结构域)。具体地，如下文详细讨论的，本发明的嵌合受体的内结构域包含jak3结合基序、stat5结合基序以及jak1结合基序和/或jak2结合基序，在配体结合后将il2持续信号传递到细胞中。本发明的嵌合受体具体以单条连续链的形式提供。
[0158]
可以使用例如逆转录病毒载体将嵌合受体编码多核苷酸转移到细胞中，从而产生大量工程化细胞用于治疗。当嵌合受体与其配体结合时，持久/存活信号被传递到表达它的细胞中。因此，本发明的嵌合受体允许向细胞提供持续信号。
[0159]
细胞内信号传导结构域(内结构域)
[0160]
本发明的嵌合受体(例如，car)包含内结构域，其含有stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序。
[0161]“信号转导和转录激活因子5”(stat5)是一种参与il-2信号传导通路的转录因子，通过促进诸如foxp3、il2ra和bclxl基因的表达，在treg功能、稳定性和存活中发挥关键作用。为了发挥功能并转移到细胞核中，stat5需要被磷酸化。il-2连接通过经由分别存在于il-2rβ和il-2rγ链中的特定信号传导结构域活化jak1/jak2和jak3激酶引起stat5磷酸化。虽然jak1(或jak2)可以在不需要jak3的情况下磷酸化stat5，但通过jak1/jak2和jak3的转磷酸化增加了stat5的活性，从而稳定它们的活性。
[0162]
如本文所用的“stat5结合基序”是指包含酪氨酸并且能够结合stat5多肽的氨基酸基序。本领域已知的用于确定蛋白质：蛋白质相互作用的任何方法可以用于确定结合基序是否能够与stat5结合。例如，免疫共沉淀，然后是蛋白质印迹法。
[0163]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含两个(例如至少两个)或更多个如本文定义的stat5结合基序。例如，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含两个、三个、四个、五个或更多个如本文定义的stat5结合基序。优选地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含两个或三个如本文定义的stat5结合基序。
[0164]
适当地，stat5结合基序可以内源性地存在于跨膜蛋白的细胞质结构域中。例如，stat5结合基序可以来自白介素受体(il)受体内结构域或激素受体。
[0165]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含选自其中stat5是下游组分的任何白介素受体链的氨基酸序列，例如，可以使用包含il-2受体β链的氨基酸编号266至551的细胞质结构域(ncbi refseq:np_000869.1,seq id no:1)，il-7rα链的氨基酸编号265至459(ncbi refseq:np_002176.2,seq id no:2)，il-9r链的氨基酸编号292至521(ncbi refseq:np_002177.2,seq id no:3)，il-4rα链的氨基酸编号257至825(ncbi refseq:npjd00409.1,seq id no:4)，il-3rβ链的氨基酸编号461至897(ncbi refseq:np_000386.1,seq id no:5)和/或il-17rβ链的氨基酸编号314至502(ncbi refseq:np_061195.2,seq id no:6)。技术人员将理解，可以使用任何一种或多种这些序列。可以使用白介素受体链的细胞质结构域的整个区域。
[0166]
seq id no:2
–
il7ra(np_002176.2的第265至459位氨基酸)
[0167]
kkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqleesekqrlggdvqspncpsedvvitpesfgrdssltclagnvsacdapilsssrsldcresgkngphvyqdlllslgttnstlpppfslqsgiltlnpvaqgqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnq
[0168]
seq id no:7-截短的il7ra2y：
[0169]
kkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnq
[0170]
seq id no:3
–
il9r(np_002177.2的第292至521位氨基酸)
[0171]
klsprvkrifyqnvpspamffqplysvhngnfqtwmgahgagvllsqdcagtpqgalepcvqeatalltcgparpwksvaleeeqegpgtrlpgnlssedvlpagctewrvqtlaylpqedwaptsltrpappdsegsrssssssssnnnnycalgcyggwhlsalpgntqssgpipalacglscdhqgletqqgvawvlaghcqrpglhedlqgmllpsvlskarswtf
[0172]
seq id no:4
–
il4ra(npjd00409.1的第257至825位氨基酸)
[0173]
kikkewwdqipnparsrlvaiiiqdaqgsqwekrsrgqepakcphwkncltkllpcflehnmkrdedphkaakempfqgsgksawcpveisktvlwpesisvvrcvelfeapveceeeeeveeekgsfcaspessrddfqegregivarlteslfldllgeenggfcqqdmgescllppsgstsahmpwdefpsagpkeappwgkeqplhlepsppasptqspdnltctetplviagnpayrsfsnslsqspcprelgpdpllarhleevepempcvpqlsepttvpqpepetweqilrrnvlqhgaaaapvsaptsgyqefvhaveqggtqasavvglgppgeagykafssllassavspekcgfgassgeegykpfqdlipgcpgdpapvpvplftfgldrepprspqsshlpssspehlglepgekvedmpkpplpqeqatdplvdslgsgivysaltchlcghlkqchgqedggqtpvmaspccgcccgdrssppttplrapdpspggvpleaslcpaslapsgisekskssssfhpapgnaqsssqtpkivnfvsvgptymrvs
[0174]
seq id no:5
–
il3rb(np_000386.1的第461至897位氨基酸)
[0175]
rfcgiygyrlrrkweekipnpskshlfqngsaelwppgsmsaftsgspphqgpwgsrfpelegvfpvgfgdsevspltiedpkhvcdppsgpdttpaasdlpteqppspqpgppaashtpekqassfdfngpylgpphsrslpdilgqpeppqeggsqkspppgsleylclpaggqvqlvplaqamgpgqaveverrpsqgaagspslesgggpappalgprvggqdqkdspvaipmssgdtedpgvasgyvssadlvftpnsgassvslvpslglpsdqtpslcpglasgppgapgpvksgfegyvelppiegrsprsprnnpvppeakspvlnpgerpadvsptspqpegllvlqqvgdycflpglgpgplslrskpsspgpgpeiknldqafqvkkppgqavpqvpviqlfkalkqqdylslppwevnkpgevc
[0176]
seq id no:6
–
il17rb(np_061195.2的第314至502位氨基酸)
[0177]
rherikktsfstttllppikvlvvypseicfhhticyfteflqnhcrsevilekwqkkkiaemgpvqwl
atqkkaadkvvfllsndvnsvcdgtcgksegspsensqdlfplafnlfcsdlrsqihlhkyvvvyfreidtkddynalsvcpkyhlmkdatafcaellhvkqqvsagkrsqachdgccsl
[0178]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含一个或多个stat5结合基序，其包含如seq id no:1-seq id no:7所示的氨基酸序列，或与seq id no:1-seq id no:7至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的变体。例如，该变体可以能够以如seq id no:1-seq id no:7所示的氨基酸序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％结合stat5。该变体或衍生物可以能够以与seq id no:1-seq id no:7之一相似或相同的水平结合stat5，或者可以能够以如seq id no:1-seq id no:7之一所示的氨基酸序列更高的水平结合stat5(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0179]
例如，stat5结合基序可以来自il2rβ、il7rα、il-3rβ(csf2rb)、il-9r、il-17rβ、促红细胞生成素受体、血小板生成素受体、生长激素受体和催乳素受体中的任意一种或多种。嵌合受体(例如，car)可以，例如，包含来自il2rβ和il7rα两者的stat结合基序。
[0180]
stat5结合基序可以包含氨基酸基序yxxf/l(seq id no:8)；其中x是任意氨基酸。
[0181]
适当地，stat5结合基序可以包含氨基酸基序yctf(seq id no:9)、yfff(seq id no:10)、ylsl(seq id no:11)或ylslq(seq id no:12)。
[0182]
适当地，stat5结合基序可以包含氨基酸基序ylslq(seq id no:12)。
[0183]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含一个或多个stat5结合基序，其包含氨基酸基序yctf(seq id no:9)、yfff(seq id no:10)、ylsl(seq id no:11)和/或ylslq(seq id no:12)。
[0184]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含第一stat5结合基序和第二stat5结合基序，所述第一stat5结合基序包含氨基酸基序ylslq(seq id no:12)，所述第二stat5结合基序包含氨基酸基序yctf(seq id no:9)或yfff(seq id no:10)。
[0185]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含以下stat5结合基序：ylslq(seq id no:12)、yctf(seq id no:9)和yfff(seq id no:10)。
[0186]
如本文所用，“jak1结合基序和/或jak2结合基序”是指允许酪氨酸激酶jak1和/或jak2结合的盒基序(box motif)。合适的jak1结合基序和jak2结合基序由例如ferrao和lupardus(frontiers in endocrinology；2017；8(71)；其通过引用并入本文)描述。
[0187]
jak1结合基序和/或jak2结合基序可以内源性地出现在跨膜蛋白的细胞质结构域中。
[0188]
例如，jak1结合基序和/或jak2结合基序可以来自干扰素λ受体1(ifnlr1)、干扰素α受体1(ifnar)、干扰素γ受体1(ifngr1)、il10ra、il20ra、il22ra、干扰素γ受体2(ifngr2)或il10rb。
[0189]
jak1结合基序可以包含或由seq id no:13-seq id no:19所示的氨基酸基序或其能够结合jak1的变体组成。
[0190]
kvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdk(seq id no:13)
[0191]
npwfqrakmpraldfsghthpvatfqpsrpesvndlflcpqkelt(seq id no:14)
[0192]
gyiclrnslpkvlnfhnflawpfpnlppleamdmveviyinr(seq id no:15)
[0193]
plkeksiilpkslisvvrsatletkpeskyvslitsyqpfsl(seq id no:16)
[0194]
rrrkklpsvllfkkpspfifisqrpspetqdtihpldeeaflk(seq id no:17)
[0195]
yihvgkekhpanliliygnefdkrffvpaekivinfitlnisdds(seq id no:18)
[0196]
ryvtkppappnslnvqrvltfqplrfiqehvlipvfdlsgp(seq id no:19)
[0197]
与seq id no:13-seq id no:19中的任一个相比，seq id no:13-seq id no:19的变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异并且保留结合jak1的能力。
[0198]
所述变体可以与seq id no:13-seq id no:19中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同，并且保留结合jak1的能力。
[0199]
在一个优选的实施方案中，jak1结合结构域包含或由seq id no:13或其能够结合jak1的变体组成。
[0200]
例如，所述变体可以能够以相应的参考序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％结合jak1。该变体或衍生物可以能够以与相应的参考序列相似或相同的水平结合jak1，或者可以能够以比相应的参考序列更高的水平结合jak1(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0201]
jak2结合基序可以包含或由seq id no:20-seq id no:22所示的氨基酸基序或其能够结合jak2的变体组成。
[0202]
nyvffpslkpsssideyfseqplknlllstseeqiekcfiien(seq id no:20)
[0203]
ywfhtppsiplqieeylkdptqpilealdkdsspkddvwdsvsiisfpe(seq id no:21)
[0204]
yafsprnslpqhlkeflghphhntllffsfplsdendvfdklsviaedses(seq id no:22)
[0205]
与seq id no:20-seq id no:22中的任一个相比，seq id no:21-seq id no:22的变体可以包含一个、两个或三个氨基酸差异并且保留结合jak2的能力。
[0206]
例如，所述变体可以能够以相应的参考序列的水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％结合jak2。该变体或衍生物可以能够以与相应的参考序列相似或相同的水平结合jak2，或者可以能够以比相应的参考序列更高的水平结合jak2(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0207]
本领域已知的用于确定蛋白质：蛋白质相互作用的任何方法可以用于确定jak1结合基序或jak2结合基序是否能够与jak1或jak2结合。例如，免疫共沉淀，然后是蛋白质印迹法。
[0208]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含如seq id no:1所示的il2rβ内结构域；或与seq id no:1具有至少80％序列同一性的变体。
[0209]
seq id no:1ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlllqqdkvpepaslssnhsltscftnqgyfffhlpdaleieacqvyftydpyseedpdegvagaptgsspqplqplsgeddayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv
[0210]
所述变体可以与seq id no:1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
[0211]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含如seq id no:23或seq id no:24
中任一所示的截短的il2rβ内结构域；或者与seq id no:23或seq id no:24中任一个具有至少80％的序列同一性的变体。
[0212]
seq id no:23(截短的il2rb
–
y510)
[0213]
ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqllplntdaylslqelqgqdpthlv
[0214]
seq id no:24(截短的il2rb
–
y510和y392)
[0215]
ncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqlldayctfpsrddlllfspsllggpsppstapggsgageermppslqervprdwdpqplgpptpgvpdlvdfqpppelvlreageevpdagpregvsfpwsrppgqgefralnarlplntdaylslqelqgqdpthlv
[0216]
所述变体可以与seq id no:23或seq id no:24至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0217]
jak1/2和jak3的转磷酸化增加了stat5的活性，因为这稳定了它们的活性。适当地，如本文所述的嵌合受体(例如，car)内结构域进一步包含jak3结合基序。如本文所用，“jak3结合基序”是指允许酪氨酸激酶jak3的盒基序。合适的jak3结合基序由例如ferrao和lupardus(frontiers in endocrinology；2017；8(71)；其通过引用并入本文)描述。
[0218]
本领域已知的用于确定蛋白质：蛋白质相互作用的任何方法都可以用于确定基序是否能够与jak3结合。例如，免疫共沉淀，然后是蛋白质印迹法。
[0219]
jak3结合基序可以内源性地出现在跨膜蛋白的细胞质结构域中。
[0220]
例如，jak3结合基序可以来自il-2rγ多肽。功能性截短或变体il2rγ多肽可以用于本文所述嵌合受体(例如，car)的内结构域内，其中功能性截短或变体il2rγ多肽保留jak3结合活性(例如，il2rγ结合活性的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。具体地，含有jak3结合基序的截短il2rγ和含有stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序的截短il2rβ包含于如本文所述嵌合受体(例如，car)的内结构域中。功能性截短可以提供减少用于表达的构建体大小的优势。
[0221]
jak3结合基序可以包含或由如seq id no:25或seq id no:26所示的氨基酸基序或其能够结合jak3的变体(例如与seq id no:25或seq id no:26具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的功能性变体或片段)组成。
[0222]
seq id no:25
[0223]
ertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvsei
[0224]
seq id no:26
[0225]
ertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseippkggalgegpgaspcnqhspywappcytlkpet
[0226]
所述变体可以与seq id no:25或seq id no:26至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
[0227]
在一个优选的实施方案中，嵌合受体(例如，car)内结构域包含一个或多个jak1结合结构域和至少一个jak3结合结构域/基序(例如至少2或3个jak3结合结构域/基序)。
[0228]
技术人员将理解，编码jak3结合结构域的多核苷酸序列可以位于编码stat5结合基序以及jak1结合基序和/或jak2结合基序的多核苷酸序列的上游或下游(5'或3')。具体地，编码jak3结合结构域的多核苷酸可以位于编码stat5结合基序以及jak1结合基序和/或
jak2结合基序的多核苷酸的上游(5')。因此，换个角度来看，在如本文所述的嵌合受体(例如，car)中，jak3结合结构域可以是stat5结合基序以及jak1结合结构域和/或jak2结合结构域的n末端或c末端。在一个实施方案中，jak3结合结构域、stat5结合基序/jak1结合结构域和/或jak2结合结构域的位置彼此直接相邻(即不通过序列在远端分开)。
[0229]
此外，技术人员将理解，jak3结合结构域、stat5结合基序以及jak1结合结构域和/或jak2结合结构域可以位于嵌合受体(例如，car)的细胞质结构域或内结构域内的任何位置，例如，靠近膜，或通过额外的序列与膜分开(例如通过一个或多个共刺激结构域)。在一个实施方案中，结构域可以延伸到跨膜区中。
[0230]
嵌合受体的各种结构域，以及结构域的各个部分(例如信号传导结构域中的基序)可以通过接头相互连接。因此，嵌合受体可以含有一个或多个接头。通常，它将包含至少一个接头。如本文所指的接头是将蛋白质的一个结构域或部分与另一个蛋白质或部分连接的氨基酸序列。接头序列可以是任何氨基酸序列，其功能是将两个结构域或其部分连接或连接在一起，从而它们可以发挥它们的功能。因此，接头可以将被连接的元件隔开。
[0231]
在一个具体实施方案中，接头或铰链可以存在于jak3结合基序、stat5结合基序/jak1结合基序和/或jak2结合基序之间。实际上，本发明人已经确定，与表达具有包含jak3结合基序、stat5结合基序/jak1结合基序和/或jak2结合基序的内结构域但没有接头的嵌合受体的细胞相比，在嵌合受体的内结构域中的jak3结合基序、stat5结合基序/jak1结合基序和/或jak2结合基序之间存在接头引起表达嵌合受体的细胞的存活率增加。存活率的增加可以是增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，并且可以通过确定在培养特定时间段(特别是培养在低il-2条件下)后活的转导细胞的数量来测量。
[0232]
就氨基酸组成和/或氨基酸序列而言，接头的性质可以变化并且不受限制。然而，接头可以是柔性接头。因此，它可以包含或由已知赋予接头柔性特征的氨基酸组成(与刚性接头相反)。
[0233]
柔性接头是本领域中公知和描述的一类接头序列。接头序列通常被称为可以用于将蛋白质或蛋白质结构域连接或结合在一起的序列，以产生例如融合蛋白质或嵌合蛋白质，或者多功能蛋白质或多肽。它们可以具有不同的特性，例如可以是柔性的、刚性的或可切割的。例如，在chen等，2013,advanced drug delivery reviews 65,1357-1369中对蛋白质接头进行了综述，其中将柔性接头的类别与刚性和可切割接头的类别进行了比较。klein等,2014,protein engineering design and selection,27(10),325-330；van rosmalen等,2017,biochemistry,56,6565-6574；以及chichili等,2013,protein science,22,153-167中也描述了柔性接头。
[0234]
柔性接头是允许在连接的结构域或组件之间进行一定程度的移动的接头。它们通常由小的非极性氨基酸残基(例如甘氨酸)或极性氨基酸残基(例如丝氨酸或苏氨酸)组成。氨基酸的小尺寸提供了灵活性并允许连接部分(结构域或组件)的移动性。极性氨基酸的掺入可以通过与水分子形成氢键来保持接头在水性环境中的稳定性。
[0235]
最常用的柔性接头具有主要由丝氨酸和甘氨酸残基组成的序列(所谓的“gs接头”)。然而，许多其他柔性接头也已被描述(例如参见chen等,2013,同上)，它们可以包含诸如苏氨酸和/或丙氨酸和/或赖氨酸和/或谷氨酸的额外的氨基酸，以提高溶解度。可以使用本领域已知和报道的任何柔性接头。
[0236]
gs接头(或更具体地在接头中的gs(“甘氨酸-丝氨酸”)结构域)的使用可以通过改变gs结构域重复的数量来容易地改变接头的长度，因此此类接头代表了一种合适类型的接头。然而，柔性接头不限于基于“gs”重复的那些，并且已经报道了包含分散在整个接头序列中的丝氨酸残基和甘氨酸残基的其他接头，包括chen等，同上。
[0237]
在一个实施方案中，接头序列包含至少一个仅由丝氨酸残基和甘氨酸残基组成的甘氨酸-丝氨酸结构域。在这样的实施方案中，接头可以包含不超过15个其他氨基酸残基，例如不超过14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、6个、7个、5个或4个其他氨基酸残基。
[0238]
甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
[0239]
(s)q-[(g)m-(s)m]n-(g)p
[0240]
其中q为0或1；m为1-8的整数；n是至少为1的整数(例如1至8，或更具体地1至6)；并且p为0或1至3的整数。
[0241]
更具体地，甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
[0242]
(i)s-[(g)m-s]n；
[0243]
(ii)[(g)m-s]n；
[0244]
(iii)[(g)m-s]n-(g)p
[0245]
其中m为2-8的整数(例如3-4)；n是至少为1的整数(例如1至8，或更具体地1至6)；并且p为0或1至3的整数。
[0246]
在一个代表性的实例中，甘氨酸-丝氨酸结构域可以具有下式：
[0247]
s-[g-g-g-g-s]n
[0248]
其中n是至少为1的整数(优选1至8，或1-6、1-5、1-4或1-3)(其中[g-g-g-g-s]是seq id no:156)。
[0249]
gs接头(或更具体地在接头中的gs(“甘氨酸-丝氨酸”)结构域)的使用可以通过改变gs结构域重复的数量来容易地改变接头的长度，因此此类接头代表了要使用的接头的一种有利类型。然而，柔性接头不限于基于“gs”重复的那些，并且已经报道了包含分散在整个接头序列中的丝氨酸残基和甘氨酸残基的其他接头，包括chen等，同上。
[0250]
接头序列可以仅由或可以由如上文描述或定义的一个或多个甘氨酸-丝氨酸结构域组成。然而，如上所述，接头序列可以包含一个或多个甘氨酸-丝氨酸结构域和额外的氨基酸。额外的氨基酸可以在甘氨酸-丝氨酸结构域的一端或两端，或在一段重复的甘氨酸-丝氨酸结构域的一端或两端。因此，可以是其他氨基酸的额外的氨基酸可以位于接头序列的一端或两端，例如它们可以位于甘氨酸-丝氨酸结构域的侧翼。在其他实施方案中，额外的氨基酸可以位于甘氨酸-丝氨酸结构域之间。例如，两个甘氨酸-丝氨酸结构域可以位于接头序列中一段其他氨基酸的侧翼。此外，同样如上所述，在其他接头中，gs结构域不需要重复，并且g残基和/或s残基，或诸如gs的短结构域可以简单地沿长度或序列分布。
[0251]
代表性的示例性接头序列如下所列：
[0252]
etsggggsrl(seq id no:161)
[0253]
sggggsggggsggggs(seq id no:162)
[0254]
s(ggggs)
1-5
(其中ggggs是seq id no:156)
[0255]
(ggggs)
1-5
(其中ggggs是seq id no:156)
[0256]
s(gggs)
1-5
(其中gggs是seq id no:163)
[0257]
(gggs)
1-5
(其中gggs是seq id no:163)
[0258]
s(gggggs)
1-5
(其中gggggs是seq id no:164)
[0259]
(gggggs)
1-5
(其中gggggs是seq id no:164)
[0260]
s(ggggggs)
1-5
(其中ggggggs是seq id no:165)
[0261]
(ggggggs)
1-5
(其中ggggggs是seq id no:165)
[0262]
g6(seq id no:159)
[0263]
g8(seq id no:160)
[0264]
kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:166)
[0265]
egkssgsgseskst(seq id no:167)
[0266]
gsagsaagsgef(seq id no:168)
[0267]
sggggsagsaagsgef(seq id no:169)
[0268]
sgggllllllllgggs(seq id no:170)
[0269]
sgggaaaaaaaagggs(seq id no:171)
[0270]
sgggaaaaaaaaaaaaaaaagggs(seq id no:172)
[0271]
sgalgglalaglllaglglgaags(seq id no:173)
[0272]
slslspgggggpar(seq id no:174)
[0273]
slslspgggggparslslspggggg(seq id no:175)
[0274]
gssgss(seq id no:176)
[0275]
gssssss(seq id no:177)
[0276]
ggssss(seq id no:178)
[0277]
gsssss(seq id no:179)
[0278]
sggggs(seq id no:180)。
[0279]
接头或铰链可以包含或由至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个或30个氨基酸组成，例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个甘氨酸残基。在一个最具体的实施方案中，本文所述的嵌合受体(例如，car)包含内结构域，其包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列，所述第一氨基酸序列衍生自含有jak3结合结构域(例如seq id no:25或seq id no:26)的il2rγ，所述第二氨基酸序列衍生自含有stat5结合基序以及jak1结合基序和/或jak2结合基序(例如seq id no:23或seq id no:24)的il2rβ，其中第一氨基酸序列和第二氨基酸序列通过接头或铰链连接或结合。例如，嵌合受体(例如，car)可以包含内结构域，其包含seq id no:25和seq id no:23，其中seq id no:25和seq id no:23通过接头或铰链连接。代表性的嵌合受体(例如，car)内结构域序列可以包含或由seq id no:54所示的序列或其功能变体组成。
[0280]
可以用于由本发明的核酸编码的嵌合受体中的接头包括：
[0281]
ggggsggggsggggs(seq id no:155)
[0282]
ggggs(seq id no:156)
[0283]
ggggsggggs(seq id no:157)
[0284]
ggggsggggsggggsggggs(seq id no:158)
[0285]
gggggg(seq id no:159)
[0286]
gggggggg(seq id no:160)
[0287]
可以使用的其他接头包括：
[0288]
kesgsvsseqlaqfrsld(seq id no:166)
[0289]
egkssgsgseskst(seq id no:167)
[0290]
gsagsaagsgef(seq id no:168)
[0291]
如图15所示的示例性构建体包含以下接头：
[0292]
构建体4(seq id no:186)：seq id no:155接头
[0293]
构建体5(seq id no:187)：seq id no:158接头
[0294]
构建体6(seq id no:188)：seq id no:159接头
[0295]
构建体7(seq id no:189)：seq id no:160接头
[0296]
构建体8(seq id no:190)：seq id no:166接头
[0297]
构建体9(seq id no:191)：seq id no:167接头
[0298]
构建体10(seq id no:192)：seq id no:168接头
[0299]
这些接头中的任何一个都可以用于具有不同内结构域stat5和jak1/2以及jak3基序序列的其他类似构建体的情况中。这些接头可以例如用于包含：seq id no:25的jak3结合基序序列或其变体
–
任何上述接头序列
–
seq id no:23的stat5结合基序/jak1和/或jak2结合基序序列或其变体的构建体中。
[0300]
因此，具体地，由本发明的核酸编码的嵌合受体(例如，car)可以包含内结构域，所述内结构域包含以下结构域/接头：
[0301]
jak3结合基序
–
seq id no:155接头
–
stat5结合基序/jak1和/或jak2结合基序
[0302]
jak3结合基序
–
seq id no:158接头
–
stat5结合基序/jak1和/或jak2结合基序
[0303]
jak3结合基序
–
seq id no:159接头
–
stat5结合基序/jak1和/或jak2结合基序。
[0304]
更具体地，由本发明的核酸编码的嵌合受体(例如，car)可以包含内结构域，所述内结构域包含以下结构域/接头：
[0305]
seq id no:25
–
seq id no:155
–
seq id no:23
[0306]
seq id no:25
–
seq id no:158
–
seq id no:23
[0307]
seq id no:25
–
seq id no:159
–
seq id no:23
[0308]
seq id no:26
–
seq id no:155
–
seq id no:23
[0309]
seq id no:26
–
seq id no:158
–
seq id no:23
[0310]
seq id no:26
–
seq id no:159
–
seq id no:23
[0311]
seq id no:25
–
seq id no:155
–
seq id no:24
[0312]
seq id no:25
–
seq id no:158
–
seq id no:24
[0313]
seq id no:25
–
seq id no:159
–
seq id no:24
[0314]
seq id no:26
–
seq id no:155
–
seq id no:24
[0315]
seq id no:26
–
seq id no:158
–
seq id no:24
[0316]
seq id no:26
–
seq id no:159
–
seq id no:24
[0317]
因此，如上所述，本发明因此提供了包含编码嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))的多核苷酸序列的核酸分子，其中所述嵌合受体(例如car)包含内结构域，所述内结构域包含(i)stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和(ii)jak3结合基序，其中
(i)和(ii)通过接头或铰链连接。还提供了包含核酸分子的载体，例如，慢病毒载体或逆转录病毒载体。
[0318]
嵌合受体(例如，car)包含内结构域，所述内结构域包含(i)stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接，接头或铰链也是由本发明提供的。如本文所述，(i)可以衍生自il2rβ，例如seq id no:23或seq id no:24，且(ii)可以衍生自il2rγ(例如seq id no:25或seq id no:26)。
[0319]
本发明还提供了一种细胞，例如t细胞(特别是treg细胞)或nk(自然杀伤)细胞，其包含：编码嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))的多核苷酸序列，其中所述嵌合受体(例如，car)包含内结构域，所述内结构域包含(i)stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接；包含所述多核苷酸序列的载体；和/或包含内结构域的嵌合受体(例如，car)，所述内结构域包含(i)stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接，以及细胞(例如t细胞或nk细胞)在治疗中的用途，特别是用于本文所述的治疗用途。本发明还提供了包含所述细胞的药物组合物。应当理解，nk细胞和tconv细胞以及包含所述细胞的药物组合物也将能够治疗癌症，例如肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和血癌(如白血病和淋巴瘤)。
[0320]
进一步提供了产生本发明的细胞的方法，其包括将编码嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))的多核苷酸序列引入细胞，其中所述嵌合受体(例如car)包含内结构域，所述内结构域包含(i)stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序和(ii)jak3结合基序，其中(i)和(ii)通过接头或铰链连接。可通过该方法获得的细胞包括在本发明中。
[0321]
如本文所述的嵌合受体(例如，car)的内结构域还可以包含转导效应子功能信号和指导细胞(例如，treg)在抗原结合时执行其特化功能所必需的基序。细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于t细胞受体的ζ链内结构域或其任何同源物(例如η链、fcεr1γ和β链、mb1(igα)链、b29(igβ)链等)、cd3多肽结构域(δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(syk、zap 70等)、src家族酪氨酸激酶(lck、fyn、lyn等)和其他参与t-细胞转导的分子，例如cd2、cd5和cd28。细胞内信号传导结构域可以包含人cd3ζ链内结构域、fcyriii、fcsri、fc受体的胞质尾、带有胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)或其组合。
[0322]
优选地，细胞内信号传导结构域包含人cd3ζ链的细胞内信号传导结构域。
[0323]
在一个实施方案中，人cd3ζ链的细胞内信号传导结构域包含或由以下序列组成：
[0324]
uniprot:p20963,cd3z_人,第31-143位
[0325]
rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkpqrrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:27)
[0326]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与seq id no:27至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
[0327]
嵌合受体(例如，car)的细胞内信号传导结构域可以包含以下cd28信号传导结构域：
[0328]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:28)
[0329]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与seq id no:28具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的信号传导基序。
[0330]
嵌合受体(例如，car)的胞内信号传导结构域可以包含以下cd27信号传导结构域：qrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp(seq id no:29)。
[0331]
在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含与seq id no:29具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的信号传导基序。
[0332]
额外的细胞内信号传导结构域对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且可以与本发明的替代实施方案结合使用。
[0333]
本嵌合受体(例如，car)可以包含复合的内结构域，所述复合的内结构域包含t细胞共刺激分子的细胞内部分与例如cd3ζ的融合。这种复合的内结构域可以称为第二代嵌合受体(例如，car)，其可以在抗原识别后同时传递活化和共刺激信号。最常用的共刺激结构域是cd28。这提供了最有效的共刺激信号，即引发t细胞增殖的免疫信号2。嵌合受体(例如，car)内结构域还可以包含一个或多个tnf受体家族信号传导结构域，如ox40、4-1bb、icos或tnfrsf25的信号传导结构域。
[0334]
ox40、4-1bb、icos和tnfrsf25信号传导结构域的示例性序列如下的seq id no:30-seq id no:33所示。嵌合受体(例如，car)内结构域还可以包含seq id no:30-seq id no:33中的一个或多个，或者包含seq id no:30-seq id no:33的变体。
[0335]
ox40信号传导结构域(seq id no:30)：
[0336]
alyllrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeqadahstlaki
[0337]
41bb信号传导结构域(seq id no:31)：
[0338]
krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
[0339]
icos信号传导结构域(seq id no:32)：
[0340]
cwltkkkysssvhdpngeymfmravntakksrltdvtl
[0341]
tnfrsf25信号传导结构域(seq id no:33)：
[0342]
tytyrhcwphkplvtadeagmealtpppathlspldsahtllappdssekictvqlvgnswtpgypetqealcpqvtwswdqlpsralgpaaaptlspespagspammlqpgpqlydvmdavparrwkefvrtlglreaeieaveveigrfrdqqyemlkrwrqqqpaglgavyaalermgldgcvedlrsrlqrgp
[0343]
除了上面指出的共刺激和信号传导结构域之外，内结构域可以包含另外的序列，例如cd8和/或cd28内结构域的部分。可以包含额外的序列以促进嵌合受体序列的克隆，例如从编码序列中添加或去除限制性切割位点，并促进嵌合受体或其编码序列的构建。
[0344]
嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含与seq id no:30-seq id no:33中的一个或多个的变体，其与seq id no:30-seq id no:33中的任一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
[0345]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含或由seq id no:45或变体组成，该变体与seq id no:45具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
[0346]
seq id no:45(包含cd28、il2rg-t52、il2rb-y510、cd3ζ信号传导结构域的示例性内结构域序列)
[0347]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqllplntdaylslqelqgqdpthlvrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0348]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含或由seq id no:53或变体组成，该变体与seq id no:53具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
[0349]
seq id no:53(包含cd28、il2rg-t52、il7ra-2y、cd3ζ信号传导结构域的示例性内结构域序列)
[0350]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseikkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnqrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprgsgatnfsllkqagdveenpg
[0351]
适当地，嵌合受体(例如，car)内结构域可以包含或由seq id no:154或变体组成，该变体与seq id no:154具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。
[0352]
seq id no:154(包含cd28、il2rg-t52、接头、il2rb-y510、cd3ζ信号传导结构域的示例性内结构域序列)
[0353]
rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseiggggsggggsggggsncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqllplntdaylslqelqgqdpthlvrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0354]
其他示例性的内结构域包括含有cd28胞内结构域(包括或由cd28共刺激结构域组成)、seq id no:25的jak3结合基序结构域il2rg-t52序列、接头序列、seq id no:23的stat5结合基序/jak1和/或jak2结合基序结构域序列以及cd3ζ信号传导结构域的内结构域。此类内结构域序列包含在例如构建体civ-cx中，其如图15所示并描述于下文实施例10中。
[0355]
图15/实施例10的任何构建体civ-cx的内结构域可以用于根据本文发明的任何方面的嵌合受体的情况。因此，内结构域可以包含或由分别如seq id no:198至seq id no:204所示的构建体civ至cx中任一种的内结构域序列，或seq id no:198至seq id no:204中的任意一个的变体组成，该变体与seq id no:198至seq id no:204中的任意一个具有至少85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性。这些内结构域及其可能的修饰在下面的实施例10中进一步讨论。
[0356]
任何的此类内结构域可以在嵌合受体中与cd8 tm和/或铰链结构域组合，例如如上文所示的cd8 tm和/或铰链结构域。
[0357]
变体、衍生物和片段
[0358]
除了本文提及的特定蛋白质、肽和核苷酸之外，本发明还包括其衍生物和片段的用途。
[0359]
如本文可互换使用的术语“衍生物”或“变体”，就本发明的蛋白质或多肽而言，包括序列的一个(或多个)氨基酸残基的任意取代、变化、修饰、置换、缺失和/或添加，只要所得蛋白质或多肽保留所需功能(例如，在衍生物或变体是抗原结合结构域的情况下，所需功能可以是抗原结合结构域结合其靶标抗原的能力，或者在衍生物或变体是信号传导结构域的情况下，所需功能可以是该结构域发出信号的能力(例如活化或灭活下游分子)。例如，与
相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的功能。与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有相似或相同的功能水平，或者可以具有增加的功能水平(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0360]
通常，可以进行氨基酸取代，例如1个、2个或3至10个或20个取代，只要修饰的序列保留所需的活性或能力。氨基酸取代可以包括非天然存在的类似物的使用。例如，与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的活性或能力。与相应的参考序列相比，变体或衍生物可以具有相似或相同的活性或能力水平，或者可以具有增加的活性或能力水平(例如增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。
[0361]
本发明中使用的蛋白质或肽还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，这会产生无声的变化并产生功能上等价的蛋白质。只要保留内源性功能，可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
[0362]
可以进行保守取代，例如根据下表。第二列中同一块中的氨基酸(优选第三列中同一行中的氨基酸)可以相互替换：
[0363][0364]
衍生物可以是同源物。如本文所用，术语“同源物”是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
[0365]
同源物或变体序列可以包括与目标序列至少50％、55％、65％、75％、85％或90％相同的氨基酸序列，优选至少95％或97％或99％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。尽管还可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，但在本发明的情况下，优选按照序列同一性来表达同源性。
[0366]
同源性比较可以通过肉眼进行，或者更常见的是借助现有的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的百分比同源性或同一性。
[0367]
可以计算连续序列的百分比同源性，即一条序列与另一条序列对齐，将一条序列中的每个氨基酸直接与另一条序列中的相应氨基酸进行比较，一次一个残基。这称为“无空位”(ungapped)比对。通常，这种无间隙比对仅在相对较少数量的残基上进行。
[0368]
虽然这是一种非常简单且一致的方法，但它没有考虑到例如在另一对相同的序列
中，核苷酸序列中的一个插入或缺失可能导致后续密码子无法对齐，因此当进行全局比对时，可能会导致同源性百分比大幅降低。因此，大多数序列比较方法旨在产生最佳比对，考虑可能的插入和缺失，而不会过度扣除总的同源性得分。这是通过在序列比对中插入“空位”(gap)以尝试最大化局部同源性而实现。
[0369]
然而，这些更复杂的方法将“空位罚分”分配给比对中出现的每个空位，因此，对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对，反映了两个比较序列之间更高的相关性，将获得比有很多空位的分数更高的分数。“仿射空位成本”通常用于对空位的存在收取相对较高的成本，而对空位中的每个后续残基进行较小的扣分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。但是，在使用此类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用gcg wisconsin bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分是空位-12并且每个延伸-4。
[0370]
因此，最大同源性百分比的计算首先需要产生最佳比对，同时考虑空位罚分。用于进行这种比对的合适的计算机程序是gcg wisconsin bestfit程序包(威斯康星大学，美国；devereux等(1984)nucleic acids res.12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于blast软件包(参见ausubel等(1999)出处同上
–
第18章)、fasta(atschul等(1990)j.mol.biol.403-410)和geneworks比较工具的套件。blast和fasta都可用于离线和在线搜索(参见ausubel等(1999)出处同上，第7章第58页至第7章第60页)。但是，对于某些应用程序，最好使用gcg bestfit程序。另一种称为blast 2 sequences的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见fems microbiol.lett.(1999)174:247-50；fems microbiol.lett.(1999)177:187-8)。
[0371]
虽然最终的同源性百分比可以根据同一性来衡量，但比对过程本身通常不是基于全有或全无的配对比较。取而代之的是，通常使用缩放的相似性评分矩阵，它根据化学相似性或进化距离为每个成对比较评分。这种矩阵的常用的一个实例是blosum62矩阵——blast程序套件的默认矩阵。gcg wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果有提供)(有关详细信息，请参阅用户手册)。对于某些应用程序，最好使用gcg包的公共默认值，或者在其他软件的情况下，使用默认矩阵，例如blosum62。适当地，百分比同一性是在总体参考和/或查询序列来确定的。
[0372]
一旦软件产生了最佳比对，就可以计算同源性百分比，优选序列同一性百分比。该软件通常将此作为序列比较的一部分并生成数字结果。
[0373]“片段”通常指在功能上感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此，“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0374]
此类变体、衍生物和片段可以使用标准重组dna技术(如定点诱变)来制备。在要进行插入的情况下，可以制备编码插入的合成dna以及对应于插入位点任一侧的天然存在序列的5'和3'侧翼区域。侧翼区将包含与天然存在的序列中的位点相对应的方便的限制性位点，以便可以用适当的酶切割该序列并将合成dna连接到该切口中。然后根据本发明表达dna以制备编码的蛋白质。这些方法仅说明本领域已知的用于操作dna序列的众多标准技术，也可以使用其他已知技术。
[0375]
跨膜结构域
[0376]
嵌合受体(例如，car)也可以包含跨膜结构域。跨膜结构域可以包含来自任何具有
跨膜结构域的蛋白质的跨膜序列，包括任何i型、ii型或iii型跨膜蛋白。嵌合受体(例如，car)的跨膜结构域也可以包含人工疏水序列。可以选择嵌合受体(例如，car)的跨膜结构域以便不二聚化。额外的跨膜结构域对于本领域技术人员将是显而易见的。用于嵌合受体(例如，car)构建体的跨膜(tm)区的实例是：1)cd28 tm区(pule等，mol ther,2005,11月；12(5):933-41；brentjens等，ccr,2007,9月15日；13(18pt 1):5426-35；casucci 等，blood,2013,11月14日；122(20):3461-72.)；2)ox40 tm区(pule等,mol ther,2005,11月；12(5):933-41)；3)41bb tm区(brentjens等,ccr,2007,9月15日；13(18pt 1):5426-35)；4)cd3ζtm区(pule等，mol ther,2005,11月；12(5):933-41；savoldo b，blood,2009,6月18日；113(25):6392-402.)；5)cd8a tm区(maher等，nat biotechnol,2002,1月；20(1):70-5.；imai c，leukemia,2004,4月；18(4):676-84；brentjens等，ccr,2007,9月15日；13(18pt 1):5426-35；milone等，mol ther,2009,8月；17(8):1453-64.)。
[0377]
在另一个实施方案中，可以选择跨膜结构域以包含二聚化结构域，在需要时允许嵌合受体二聚化。示例性的二聚化结构域公开于wo2019/169290中，其通过引用并入本文。
[0378]
适当地，跨膜结构域可以包含如seq id no:35所示的氨基酸序列，或与seq id no:35至少80％相同的变体。
[0379]
seq id no:35
–
cd28跨膜
[0380]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
[0381]
适当地，该变体可以与seq id no:35至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0382]
适当地，嵌合受体(例如，car)可以包含cd8α跨膜结构域。适当地，跨膜结构域可以包含如seq id no:87所示的氨基酸序列，或与seq id no:87至少80％相同的变体。
[0383]
示例性的cd8αtm结构域(第183至203位)(seq id no:87)：
[0384]
iyiwaplagtcgvlllslvit
[0385]
另一个cd8 tm结构域序列示于seq id no:195。
[0386]
iyiwaplagtcgvlllslvitlyc(seq id no:195)
[0387]
适当地，跨膜结构域可以包含如seq id no:195所示的氨基酸序列，或与seq id no:195至少80％相同的变体。
[0388]
适当地，该变体可以与seq id no:87或seq id no:195至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0389]
适当地，嵌合受体(例如，car)可以包含cd28铰链和跨膜序列。适当地，铰链和跨膜结构域可以包含如seq id no:36所示的氨基酸序列，或与seq id no:36至少80％相同的变体。
[0390]
seq id no:36
–
cd28跨膜
[0391]
ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
[0392]
适当地，该变体可以与seq id no:36至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0393]
在一个实施方案中，跨膜和细胞内信号传导结构域均来源于cd28。在一个实施方案中，跨膜和细胞内信号传导结构域包含以下序列：
[0394]
人cd28的跨膜和细胞内部分(uniprot:p10747,人cd28，第153-220位)
[0395]
fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:37)
[0396]
在一个实施方案中，跨膜和细胞内信号传导结构域包含与seq id no:37至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。
[0397]
在一个实施方案中，cd28的跨膜结构域包含序列fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no:38)。
[0398]
如前所述，跨膜结构域可以包含来自il2rβ或il2rγ的部分或全部跨膜区。
[0399]
适当地，嵌合受体(例如，car)可以编码标签，例如c-myc标签(eqkliseedl
–
seq id no:39)。适当地，标签可以掺入嵌合受体(例如，car)的胞外结构域，例如胞外结构域的铰链区。具有整合c-myc标签的示例性cd28铰链/跨膜结构域如seq id no:40所示。
[0400]
ieveqkliseedlldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no:40)。
[0401]
适当地，嵌合受体(例如，car)可以包含cd8α铰链结构域和/或cd8α跨膜结构域。此外，嵌合受体(例如，car)可以包含cd8α铰链结构域和cd28跨膜结构域。适当地，铰链和跨膜结构域可以包含如seq id no:88所示的氨基酸序列，或与seq id no:88至少80％相同的变体。
[0402]
示例性cd8α铰链结构域和cd28跨膜结构域(seq id no:88)：
[0403]
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv
[0404]
适当地，变体可以与seq id no:88至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0405]
cd8α铰链
–
tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:181)
[0406]
cd8α铰链(也称为cd8细胞外结构域)
[0407]
fvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd(seq id no:194)
[0408]
在一些实施方案中，嵌合受体(例如，car)可以包含cd8，特别是cd8α铰链序列。铰链结构域可以包含如seq id no:181或seq id no:194所示的氨基酸序列，或与seq id no:181或seq id no:194至少80％相同的变体。适当地，该变体可以与seq id no:181或seq id no:194至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0409]
适当地，嵌合受体(例如，car)可以包含cd28铰链结构域和cd8α跨膜结构域。适当地，铰链结构域和跨膜结构域可以包含如seq id no:89所示的氨基酸序列，或与seq id no:89至少80％相同的变体。
[0410]
示例性cd28铰链结构域和cd8α跨膜结构域(seq id no:89)：
[0411]
ievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpiyiwaplagtcgvlllslvit
[0412]
适当地，变体可以与seq id no:89至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0413]
嵌合受体(例如，car)可以进一步包含将其靶向内质网途径以在细胞表面上表达的前导序列。示例性的前导序列是malpvtalllplalllhaarp(seq id no:41)。这是人cd8的前导序列。
[0414]
用于本发明的示例性car如seq id no:42-seq id no:44所示。
[0415]
seq id no:42(含有hla-a2 scfv、c-myc标签、cd28、il2rb-y510、cd3ζ内结构域的
car)
[0416]
malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgggvvqpggslrvscaasgvtlsdygmhwvrqapgkglewmafirndgsdkyyadsvkgrftisrdnskktvslqmsslraedtavyycakngesgpldywyfdlwgrgtlvtvssggggsggggsggggsdvvmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqydnlpptfgggtkltvlgaaaieveqkliseedlldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsncrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqllplntdaylslqelqgqdpthlvrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppretrgggatmvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsklskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk
[0417]
seq id no:43(含有hla-a2 scfv、c-myc标签、cd28、il2rg-t52、il2rb-y510、cd3ζ内结构域的car)
[0418]
malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgggvvqpggslrvscaasgvtlsdygmhwvrqapgkglewmafirndgsdkyyadsvkgrftisrdnskktvslqmsslraedtavyycakngesgpldywyfdlwgrgtlvtvssggggsggggsggggsdvvmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqydnlpptfgggtkltvlgaaaieveqkliseedlldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseincrntgpwlkkvlkcntpdpskffsqlssehggdvqkwlsspfpsssfspgglapeisplevlerdkvtqllplntdaylslqelqgqdpthlvrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
[0419]
seq id no:44(含有hla-a2 scfv、c-myc标签、cd28、il2rg-t52、il7ra-2y、cd3ζ内结构域的car)
[0420]
malpvtalllplalllhaarpqvqlvqsgggvvqpggslrvscaasgvtlsdygmhwvrqapgkglewmafirndgsdkyyadsvkgrftisrdnskktvslqmsslraedtavyycakngesgpldywyfdlwgrgtlvtvssggggsggggsggggsdvvmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycqqydnlpptfgggtkltvlgaaaieveqkliseedlldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsertmpriptlknledlvteyhgnfsawsgvskglaeslqpdyserlclvseikkrikpivwpslpdhkktlehlckkprknlnvsfnpesfldcqihrvddiqardevegflqdtfpqqpiltslgsnqeeayvtmssfyqnqrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprgsgatnfsllkqagdveenpg
[0421]
car可以包含与seq id no:42-seq id no:44中的任一个至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的序列。
[0422]
嵌合抗原受体(car)
[0423]
如本文所用，“嵌合抗原受体”或“car”是指可赋予细胞(例如treg)抗原特异性的工程化受体。car也称为人工t细胞受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体。优选地，如本文所
定义的car包含细胞外抗原特异性靶向区、跨膜结构域、任选地一个或多个共刺激结构域以及细胞内信号传导结构域(也称为内结构域)。
[0424]
可以使用例如逆转录病毒载体将编码car的多核苷酸转移至treg。通过这种方式，可以生成大量的抗原特异性t细胞用于过继细胞转移。当car结合靶抗原时，这会导致活化信号传输到其表达的treg。因此，car将工程化treg的特异性导向表达靶向抗原的细胞。
[0425]
抗原特异性靶向结构域
[0426]
抗原特异性靶向结构域为car提供了结合感兴趣的预定抗原的能力。抗原特异性靶向结构域优选靶向临床感兴趣的抗原。
[0427]
抗原特异性靶向结构域可以是具有特异性识别和结合生物分子(例如，细胞表面受体或其组分)的能力的任何蛋白质或肽。抗原特异性靶向结构域包括用于感兴趣的生物分子的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。示例性的抗原特异性靶向结构域包括抗体或抗体片段或衍生物、受体的细胞外结构域、细胞表面分子/受体的配体或其受体结合结构域，以及肿瘤结合蛋白。尽管如下文所讨论的，抗原特异性靶向结构域可以优选地是抗体或衍生自抗体，但也包括其他抗原特异性靶向结构域，例如由抗原肽/mhc或hla组合形成的抗原特异性靶向结构域，其能够与在移植、炎症或疾病部位有活性的tcon细胞的tcr结合。此类抗原结合结构域已在例如mekala等，blood,2005,第105卷,第2090-2092页中报道。
[0428]
在一个优选的实施方案中，抗原特异性靶向结构域是抗体或衍生自抗体。抗体衍生的靶向结构域可以是抗体的片段或抗体的一个或多个片段的基因工程产物，该片段参与与抗原的结合。实例包括可变区(fv)、互补决定区(cdr)、fab、单链抗体(scfv)、重链可变区(vh))、轻链可变区(vl)、骆驼化抗体(vhh)和单域抗体(sab)。
[0429]
在一个优选的实施方案中，结合结构域是单链抗体(scfv)。scfv可以是鼠scfv、人scfv或人源化scfv。
[0430]
关于抗体或其抗原结合片段的“互补决定区”或“cdr”是指抗体的重链或轻链可变区中的高度可变环。cdr可以与抗原构象相互作用并在很大程度上决定与抗原的结合(尽管已知一些框架区参与结合)。重链可变区和轻链可变区各含有3个cdr。“重链可变区”或“vh”是指抗体的重链的片段，其包含插入在称为框架区的侧翼延伸之间的三个cdr，框架区比cdr更高度保守并形成支撑cdr的支架。“轻链可变区”或“vl”是指抗体的轻链的片段，其包含插入在框架区之间的三个cdr。
[0431]“fv”是指带有完整抗原结合位点的抗体的最小片段。fv片段由与单个重链可变区结合的单个轻链可变区组成。“单链fv抗体”或“scfv”是指由直接相互连接或通过肽接头序列相互连接的轻链可变区和重链可变区组成的工程化抗体。
[0432]
可使用本领域公知的方法制备特异性结合预定抗原的抗体。此类方法包括噬菌体展示、产生人或人源化抗体的方法，或使用经工程改造以产生人抗体的转基因动物或植物的方法。部分或完全合成的抗体的噬菌体展示文库是可得的，并且可以筛选出可以与靶分子结合的抗体或其片段。人抗体的噬菌体展示文库也是可得的。一旦被鉴定，就可以分离和/或确定氨基酸序列或编码抗体的多核苷酸序列。
[0433]
本car可以靶向的抗原包括但不限于在与移植器官、自身免疫疾病、过敏性疾病和炎性疾病(例如神经退行性疾病)相关的细胞上表达的抗原。技术人员将理解，由于treg细
胞的旁观者效应，抗原可以简单地存在和/或表达在移植、炎症或疾病部位。
[0434]
在与神经退行性疾病相关的细胞上表达的抗原包括在神经胶质细胞上表达的抗原，例如mog。
[0435]
与器官移植相关的抗原和/或与移植器官相关的细胞包括但不限于存在于移植器官中但不存在于患者体内的hla抗原，或在移植排斥过程中表达上调的抗原，如ccl19、mmp9、slc1a3、mmp7、hmmr、top2a、gpnmb、pla2g7、cxcl9、fabp5、gbp2、cd74、cxcl10、ubd、cd27、cd48、cxcl11。
[0436]
例如，car可以包含能够结合hla-a2的抗原结合结构域(hla-a2在本文中也可以称为hla-a*02、hla-a02和hla-a*2)。hla-a*02是hla-a基因座上一个特殊的i类主要组织相容性复合体(mhc)等位基因组。
[0437]
抗原识别结构域可以结合、适当地特异性结合hla-a2内的一个或多个区域或表位。表位，也称为抗原决定簇，是被抗原识别结构域(例如抗体)识别的抗原部分。换句话说，表位是抗体结合的抗原的特定片段。适当地，抗原识别结构域结合(适当地特异性结合)hla-a2内的一个区域或表位。
[0438]
抗原识别结构域可以包含至少一个cdr(例如cdr3)，其可以从结合抗原的抗体预测，优选hla-a2(或这种预测的cdr的变体(例如具有一个、两个或三个氨基酸取代))。应当理解，含有三个或更少的cdr区(例如单个cdr或甚至其一部分)的分子可以能够保留cdr来源的抗体的抗原结合活性。含有两个cdr区的分子在本领域中被描述为能够结合靶抗原，例如以微型抗体的形式(vaughan和sollazzo,2001,combinational chemistry&high throughput screening,4,417-430)。已经描述了包含单个cdr的分子，其可以显示出对靶标的强结合活性(nicaise等，2004,protein science,13:1882-91)。
[0439]
在这方面，抗原识别结构域可以包含一个或多个可变重链cdr，例如一个、两个或三个可变重链cdr。或者或额外地，抗原识别结构域可以包含一个或多个可变轻链cdr，例如一个、两个或三个可变轻链cdr。抗原识别结构域可以包含三个重链cdr和/或三个轻链cdr(更具体地，包含三个cdr的重链可变区和/或包含三个cdr的轻链可变区)，其中至少一个cdr(优选所有cdr)可以来自结合抗原(优选hla-a2)的抗体，或者可以选自以下提供的cdr序列之一。
[0440]
抗原识别结构域可以包含可变重链和轻链cdr的任何组合，例如一个可变重链cdr和一个可变轻链cdr、两个可变重链cdr和一个可变轻链cdr、两个可变重链cdr和两个可变轻链cdr、三个可变重链cdr和一个或两个可变轻链cdr、一个可变重链cdr和两个或三个可变轻链cdr，或者三个可变重链cdr和三个可变轻链cdr。优选地，抗原识别结构域包含三个可变重链cdr(cdr1、cdr2和cdr3)或三个可变轻链cdr(cdr1、cdr2和cdr3)。
[0441]
存在于抗原识别结构域内的一个或多个cdr可以不都来自相同的抗体，只要该结构域具有上述结合活性即可。因此，可以从与抗原(例如hla-a2)结合的抗体的重链或轻链预测一个cdr，而另一个cdr的存在可以从结合相同抗原(例如hla-a2)的不同抗体预测。在这种情况下，可以优选从结合抗原(例如hla-a2)的抗体预测cdr3。然而，具体地，如果抗原识别结构域中存在多于一个cdr，则优选从结合相同抗原(例如hla-a2)的抗体预测cdr。可以使用来自不同抗体的cdr的组合，特别是来自与相同所需区域或表位结合的抗体。
[0442]
在一个特别优选的实施方案中，抗原识别结构域包含从与抗原(例如hla-a2)结合
的抗体的可变重链序列预测的三个cdr，和/或从与抗原(例如hla-a2)结合的抗体的可变轻链序列预测的三个cdr(优选相同的抗体)。
[0443]
在一些实施方案中，抗原识别结构域是抗体或源自抗体(例如是fab、scfv或sdab)，其中该抗体包含一个或多个选自seq id no:90-seq id no:146的cdr区或其衍生物。换言之，在一些实施方案中，抗原识别结构域包含一个或多个选自seq id no:90-seq id no:146或其衍生物的cdr区。适当地，抗原识别结构域包含三个选自seq id no:90-seq id no:146或其衍生物的cdr区。
[0444]
[0445][0446]
优选地，抗原结合结构域包含选自相同可变链的cdr(cdr1、cdr2和cdr3)或其衍生物。例如，抗原结合结构域可以包含seq id no:90-seq id no:92、seq id no:93-seq id no:95、seq id no:96-seq id no:98、seq id no:99-seq id no:101、seq id no:102-seq id no:104、seq id no:105-seq id no:107、seq id no:108-seq id no:110、seq id no:111-seq id no:113、seq id no:114-seq id no:116、seq id no:117-seq id no:119、seq id no:120-seq id no:122、seq id no:123-seq id no:125、seq id no:126-seq id no:
no:57至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0465]
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[0466]
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[0467]
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[0471]
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[0473]
抗原结合结构域可以包含选自seq id no:58至seq id no:72的可变轻结构域或与seq id no:58至seq id no:72至少80％相同的变体。该变体与seq id no:58至seq id no:72至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0474]
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[0475]
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[0504]
抗原结合结构域可以包含seq id no:34、seq id no:73-seq id no:86或与seq id no:34、seq id no:73-seq id no:86至少80％相同且能够结合hla-a2的变体。该变体与seq id no:34、seq id no:73-seq id no:86至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0505]
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[0506]
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[0507]
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qydsypptfgrtkveikr
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[0523]
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asvgdrvtitcrtsqgissalawyqqkpgkapklliydasslesgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqfnnypltfgggtkvdik
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[0529]
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[0531]
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[0532]
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[0533]
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[0534]
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[0535]
抗原结合结构域可以包含seq id no:73或与seq id no:73至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:73至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0536]
抗原结合结构域可以包含seq id no:34或与seq id no:34至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:34至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0537]
抗原结合结构域可以包含seq id no:74或与seq id no:74至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:74至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0538]
抗原结合结构域可以包含seq id no:75或与seq id no:75至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:75至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0539]
抗原结合结构域可以包含seq id no:76或与seq id no:76至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:76至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0540]
抗原结合结构域可以包含seq id no:77或与seq id no:77至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:77至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0541]
抗原结合结构域可以包含seq id no:78或与seq id no:78至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:78至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0542]
抗原结合结构域可以包含seq id no:79或与seq id no:79至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:79至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0543]
抗原结合结构域可以包含seq id no:80或与seq id no:80至少80％相同的变体。
适当地，该变体与seq id no:80至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0544]
抗原结合结构域可以包含seq id no:81或与seq id no:81至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:81至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0545]
抗原结合结构域可以包含seq id no:82或与seq id no:82至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:82至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0546]
抗原结合结构域可以包含seq id no:83或与seq id no:83至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:83至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0547]
抗原结合结构域可以包含seq id no:84或与seq id no:84至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:84至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0548]
抗原结合结构域可以包含seq id no:85或与seq id no:85至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:85至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0549]
抗原结合结构域可以包含seq id no:86或与seq id no:86至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:86至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。
[0550]
在另一个实施方案中，抗原结合结构域可以包含seq id no:196或与seq id no:196至少80％相同的变体。适当地，该变体与seq id no:1096至少85％、90％、95％、97％、98％或99％相同。seq id no:196是以下实施例10中构建体civ至cix中使用的scfv序列。
[0551]
seq id no:196
[0552]
qvqlvqsgggvvqpggslrvscaasgvtlsdygmhwvrqapgkglewvafirndgsdkyyadsvkgrftisrdnsektvslqmsslraedtavyycakngesgpldywyldlwgrgtlvtvssggggsggggsggggstdvvmtqspsslsasvgdrvtitcqssldishylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgthftftisslqpedfatyycqqydnlpltfgggtkleik
[0553]
药物组合物
[0554]
还提供了包含本发明的工程化细胞(例如，treg)的药物组合物。
[0555]
药物组合物是包含或由治疗有效量的药物活性剂即细胞(例如，t细胞(treg))组成的组合物。它优选包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括它们的组合)。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是公知的，并且例如在remington's pharmaceutical sciences,mack publishing co.(a.r.gennaro编辑.1985)中有所描述。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的给药途径和标准药学实践来选择。药物组合物可以包含或额外添加任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂。
[0556]“药学上可接受的”包括制剂是无菌且无热原的。载体、稀释剂和/或赋形剂必须在与treg相容且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。通常，载体、稀释剂和赋形剂是生理盐水或输注介质，它们将是无菌且无热原的，然而，也可以使用其他可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
[0557]
药学上可接受的载体的实例包括例如水、盐溶液、醇类、硅氧烷、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸甘油单酯和甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
[0558]
根据本发明的细胞(例如，treg)或药物组合物可以以适合治疗和/或预防本文所
述疾病的方式施用。施用的数量和频率将由受试者的状况、受试者疾病的类型和严重程度等因素决定，虽然适当的剂量可以通过临床试验确定。可以相应地配制药物组合物。
[0559]
如本文所述的细胞(例如，treg)或药物组合物可以胃肠外施用，例如静脉内施用，或者它们可以通过输注技术施用。细胞(例如，treg)或药物组合物可以以无菌水溶液的形式施用，该水溶液可以含有其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。水溶液可以适当缓冲(优选ph为3至9)。可以相应地配制药物组合物。在无菌条件下制备合适的非肠道制剂很容易通过本领域技术人员公知的标准制药技术完成。
[0560]
药物组合物可以在输注介质例如无菌等渗溶液中包含本发明的细胞(例如，treg)。药物组合物可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0561]
细胞(例如，treg)或药物组合物可以单剂量或多剂量施用。特别地，细胞(例如，treg)或药物组合物可以单次一次性剂量施用。可以相应地配制药物组合物。
[0562]
药物组合物可以进一步包含一种或多种活性剂。
[0563]
药物组合物可以进一步包含一种或多种其他治疗剂，例如淋巴耗竭剂(例如胸腺球蛋白、campath-1h、抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mtor抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如抗cd40/cd40l、ctal4ig)和/或抑制特定细胞因子(il-6、il-17、tnfα、il18)的药物。
[0564]
取决于疾病和待治疗的受试者以及给药途径，细胞(例如，treg)或药物组合物可以以不同的剂量(例如以细胞/kg或细胞/受试者测量)施用。在任何情况下，医生将会确定最适合任何个体受试者的实际剂量，并且会随着特定受试者的年龄、体重和反应而变化。然而，通常地，对于本发明的细胞(例如，treg)，每位受试者可以施用5
×
107至3
×
109个细胞或108至2
×
109个细胞的剂量。
[0565]
可以适当地修饰细胞(例如，treg)以用于药物组合物。例如，可以在注入受试者之前在适当的时间进行冷冻保存和解冻细胞(例如，treg)。
[0566]
本发明进一步包括使用包含本发明的细胞(例如，treg)和/或药物组合物的试剂盒。优选地，所述试剂盒用于本文所述的方法和用途，例如本文所述的治疗方法。优选地，所述试剂盒包括试剂盒组分的使用说明。
[0567]
治疗方法
[0568]
本发明提供了一种用于诱导对移植物耐受、治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥、治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、或促进组织修复和/或组织再生、或改善炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)的方法，其包括向受试者施用本发明的工程化细胞(例如，treg)或药物组合物的步骤。
[0569]
如本文所用，“诱导对移植物的耐受”是指诱导接受者对移植器官的耐受。换句话说，诱导对移植的耐受意味着降低接受者对供体移植器官的免疫反应水平。诱导对移植器官的耐受可以减少移植接受者所需的免疫抑制药物的量，或者可以使免疫抑制药物的停药成为可能。
[0570]
例如，可以将工程化细胞(例如，treg)施用于患有疾病的受试者，以减轻、减少或改善疾病的至少一种症状，如黄疸、尿色深、瘙痒、腹部肿胀或压痛、疲劳、恶心或呕吐和/或食欲不振。至少一种症状可以减轻、减少或改善至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者至少一种症状可以完全缓解。
[0571]
可以将工程化细胞(例如，treg)施用于患有疾病的受试者以减缓、减少或阻断疾病的进展。与未施用工程化细胞(例如，treg)的受试者相比，疾病的进展可以减缓、减少或阻断至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％，或者疾病的进展可能完全停止。
[0572]
在一个实施方案中，受试者是接受免疫抑制疗法的移植接受者。
[0573]
适当地，受试者是哺乳动物。适当地，受试者是人。
[0574]
移植物可以选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、带血管的复合组织移植物和皮肤移植物。
[0575]
适当地，car可以包含抗原结合结构域，其能够特异性结合hla抗原，其存在于移植物(移植物)(graft(transplant))供体中但不存在于移植物(移植物)接受者中。
[0576]
适当地，移植物是肝移植物。在移植物是肝移植物的实施方案中，抗原可以是存在于移植肝脏中但不存在于患者中的hla抗原、肝脏特异性抗原如ntcp，或者在排斥期间表达上调的抗原如ccl19、mmp9、slc1a3、mmp7、hmmr、top2a、gpnmb、pla2g7、cxcl9、fabp5、gbp2、cd74、cxcl10、ubd、cd27、cd48、cxcl11。
[0577]
适当地，抗原可以是hla-a2。
[0578]
本发明进一步提供了一种用于治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、或促进组织修复和/或组织再生、或改善炎症(例如，继发于代谢紊乱的慢性炎症)的方法。
[0579]
用于治疗疾病的方法涉及本发明的细胞的治疗用途。在这方面，可以将细胞施用于患有现有疾病或病症的受试者，以减轻、减少或改善与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、减少或阻断疾病的进展。
[0580]
适当地，治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥可以指施用有效量的本发明的细胞(例如treg)，使得移植接受者需要的免疫抑制药物的量减少，或可以能够停用免疫抑制药物。
[0581]
预防疾病涉及本发明的细胞的预防性用途。在这方面，可以将细胞施用于尚未感染疾病和/或未表现出任何疾病症状的受试者以预防疾病或者减少或预防与疾病相关的至少一种症状的发展。受试者可以具有该疾病的易感性或被认为有发生该疾病的风险。
[0582]
自身免疫或过敏性疾病可以选自包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)的炎症性皮肤病；与炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关的反应；皮炎；过敏性病症(如食物过敏、湿疹和哮喘)；类风湿关节炎；系统性红斑狼疮(sle)(包括狼疮肾炎、皮肤狼疮)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化症；神经退行性疾病，例如，肌萎缩侧索硬化症(als)；慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(cipd)和青少年糖尿病。特别地，自身免疫病症是i型糖尿病。
[0583]
适当地，本发明的治疗方法可以包括将根据本发明的工程化细胞(例如treg)、或通过根据本发明的方法可获得(例如已获得的)的工程化细胞、或核酸分子/多核苷酸或本文定义的载体(例如在如上所述的药物组合物中)施用于受试者的步骤。
[0584]
适当地，用于治疗和/或预防疾病的本方法可以包括将根据本发明的细胞(例如工程化的treg)(例如在如上所述的药物组合物中)施用于受试者。
[0585]
该方法可以包括以下步骤：
[0586]
(i)分离含有细胞的样品或提供含有细胞的样品；
[0587]
(ii)将本文定义的核酸分子或载体引入细胞；以及
[0588]
(iii)将来自(ii)的细胞施用于受试者。
[0589]
适当地，所述细胞是如本文定义的treg。
[0590]
适当地，可以在该方法的步骤(ii)之前和/或之后从含有细胞的样品中分离和/或生成富集的treg群。
[0591]
例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行分离和/或生成，以分离和/或生成富集的treg样品。可以在步骤(ii)之后进行富集，以富集包含本文所述的嵌合受体(例如，car)、多核苷酸和/或载体的细胞和/或treg。
[0592]
适当地，可以通过转导引入核酸分子或载体。适当地，可以通过转染引入核酸分子或载体。
[0593]
适当地，细胞可以是自体的。适当地，细胞可以是同种异体的。
[0594]
适当地，细胞(例如工程化treg)可以与一种或多种其他治疗剂组合施用，如淋巴耗竭剂(例如胸腺球蛋白、campath-1h、抗cd2抗体、抗cd3抗体、抗cd20抗体、环磷酰胺、氟达拉滨)、mtor抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)、抑制共刺激途径的药物(例如抗cd40/cd40l、ctal4ig)和/或抑制特定细胞因子(il-6、il-17、tnfα、il18)的药物。工程化treg可以与一种或多种其他治疗剂同时或顺序施用(即，之前或之后)。
[0595]
适当地受试者是哺乳动物。适当地，受试者是人。
[0596]
treg可以在引入编码如本文所述的car的核酸分子之前或之后被活化和/或扩增，例如通过用抗cd3单克隆抗体或抗cd3和抗cd28单克隆抗体处理。
[0597]
treg也可以在抗cd3和抗cd28单克隆抗体与il-2组合存在的情况下扩增。适当地，il-2可以用il-15替换。可以用于treg扩增方案的其他组分包括但不限于雷帕霉素、全反式维甲酸(atra)和tgfβ。
[0598]
如本文所用，“活化”是指treg或treg群已被刺激，导致treg增殖。如本文所用，“扩增”是指treg或treg群已被诱导增殖。例如，treg群的扩增例如可以通过计算群中存在的treg的数量来测量。treg的表型可以通过本领域已知的方法例如流式细胞术来确定。
[0599]
在该方法的每个步骤之后，特别是在扩增之后，可以清洗treg。
[0600]
根据本发明的工程化treg细胞群可以通过本领域技术人员已知的任何方法进一步富集，例如通过facs或磁珠分选。
[0601]
生产方法的步骤可以在封闭且无菌的细胞培养系统中进行。
[0602]
核酸分子/多核苷酸
[0603]
本文定义的核酸分子和多核苷酸可以包含dna或rna。它们可以是单链的或双链的。技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的核酸分子/多核苷酸可以编码相同的多肽。此外，应当理解，本领域技术人员可以使用常规技术进行不影响由本文定义的核酸分子/多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映任何特定宿主生物(其中将表达本发明的多肽)的密码子使用情况。
[0604]
核酸分子/多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法进行修饰。可以进行此类修饰以增强本文定义的核酸分子/多核苷酸的体内活性或寿命。
[0605]
核酸分子/多核苷酸(如dna核酸分子/多核苷酸)可以通过重组、合成或通过本领域技术人员可用的任何方式产生。它们也可以通过标准技术克隆。
[0606]
较长的核酸分子/多核苷酸通常使用重组方法产生，例如使用聚合酶链式反应(pcr)克隆技术。这将涉及制作一对引物(例如约15至30个核苷酸)，使其位于希望克隆的靶序列的侧翼，使引物与从动物或人细胞中获得的mrna或cdna接触，在导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的dna。可以设计引物以包含适当的限制酶识别位点，从而可以将扩增的dna克隆到适当的载体中。
[0607]
本发明的核酸分子/多核苷酸可以进一步包含编码可选择标志物的核酸序列。适当的可选择标志物在本领域中是公知的并且包括但不限于荧光蛋白(如gfp)。适当地，可选择标志物可以是荧光蛋白，例如gfp、yfp、rfp、tdtomato、dsred或其变体。在一些实施方案中，荧光蛋白是gfp或gfp变体。编码可选择标志物的核酸序列可以与编码本发明嵌合受体(例如，car)的核酸序列组合以核酸构建体的形式提供。这种核酸构建体可以在载体中提供。
[0608]
适当地，可选择标志物/报告子结构域可以是基于荧光素酶的报告子、pet报告子(例如碘化钠同向转运体(nis))或膜蛋白(例如cd34、低亲和力神经生长因子受体(lngfr))。
[0609]
编码如本文所述的不同多肽的核酸序列，例如嵌合受体(例如，car)和foxp3(和/或额外地或可选地，一种或多种可选择标志物)可以被一个或多个共表达位点分开，该共表达位点使得每个多肽能够作为离散实体表达。合适的共表达位点是本领域已知的并且包括例如内部核糖体进入位点(ires)和自切割肽。具体地，编码foxp3的第一多核苷酸序列和编码嵌合受体(例如，car)的第二多核苷酸序列可以通过编码自切割肽的共表达位点分开。
[0610]
其他合适的共表达位点/序列包括自切割结构域或切割结构域。这样的序列可以在蛋白质生产过程中自动切割，或可以被细胞中存在的常见酶切割。因此，在多肽序列中包含这样的自切割结构域或切割结构域使得第一多肽和第二多肽能够表达为单个多肽，其随后被切割以提供离散的、单独的功能性多肽。
[0611]
自切割序列允许多肽作为单独的或离散的组分表达和/或产生。这意味着，尽管多肽由单个核酸分子编码，但通过在编码的切割位点翻译期间或之后的“切割”，它们作为单独的多肽表达或产生，因此在细胞中的蛋白质生产过程的最后，它们作为单独的实体或单独的多肽链存在于细胞中。自切割肽序列具体包括2a和2a样肽。尽管被描述为“自切割”，但据信此类肽通过允许核糖体跳跃而起作用，使得在2a序列的c末端不形成(跳跃的)肽键，导致2a序列与其下一个下游多肽分离。因此，如本文所用，术语“切割”包括肽键形成的跳跃。
[0612]
合适的自切割结构域或切割结构域包括但不限于如seq id no:46-seq id no:51所示的那些。
[0613]
(seq id no:46)p2a肽
–
切割结构域：gsgatnfsllkqagdveenpgp
[0614]
(seq id no:47)t2a肽
–
切割结构域：gsgegrgslltcgdveenpgp
[0615]
(seq id no:48)e2a肽
–
切割结构域：gsgqctnyallklagdvesnpgp
[0616]
(seq id no:49)f2a肽
–
切割结构域：gsgvkqtlnfdllklagdvesnpgp
[0617]
(seq id no:50)弗林蛋白酶位点
–
切割结构域：rxxr(优选地：rrkr
–
seq id no:51)
[0618]
可以对上述2a序列进行修饰，以去除n末端的三个氨基酸gsg。因此，作为选择还包
括对应于seq id no:46-seq id no:49但没有n-末端gsg的序列。
[0619]
在一个实施方案中，没有n-末端gsg的seq id no:46的p2a自切割肽可以用于seq id no:197idgsg的弗林蛋白酶切割位点的情况中。
[0620]
可选择标志物的使用是有利的，因为它允许使用常用方法(如流式细胞术)从起始细胞群选择和分离细胞，所述细胞中已成功引入本发明的多核苷酸或载体(使得编码的嵌合受体(例如，car)被表达)。
[0621]
密码子优化
[0622]
本发明中使用的核酸分子/多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化先前已在wo1999/41397和wo 2001/79518中描述。不同细胞对特定密码子的使用不同。这种密码子偏好性对应于细胞类型中特定trna相对丰度的偏好性。通过改变序列中的密码子，使它们与相应trna的相对丰度相匹配，就有可能增加表达。出于同样的原因，可以通过特意选择相应的trna在特定细胞类型中很少见的密码子来减少表达。因此，可以使用额外程度的翻译控制。
[0623]
启动子
[0624]
如本文所述的第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可操作地连接到相同的启动子。“启动子”是导致基因转录起始的dna区域。启动子位于基因转录起始位点附近、dna上游(朝向正义链的5'区域)。可以使用任何合适的启动子，技术人员可以容易地进行选择。具体的启动子包括efs(或其功能性截短)、ssfv、pgk和cmv。“可操作地连接到相同的启动子”是指多核苷酸序列的转录可以从相同的启动子开始(例如，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的转录从相同的启动子开始)并且多核苷酸序列被定位和定向以用于从启动子开始转录。与启动子可操作地连接的多核苷酸处于启动子的转录调控之下。
[0625]
载体
[0626]
载体是允许或促进实体从一个环境转移到另一个环境的工具。根据本发明，例如，在重组核酸技术中使用的一些载体允许将实体，如核酸片段(例如异源dna片段(如异源cdna片段))转移到靶细胞中。载体可以是非病毒的或病毒的。用于重组核酸技术的载体的实例包括但不限于质粒、mrna分子(例如体外转录的mrna)、染色体、人工染色体和病毒。载体也可以是例如裸核酸(例如dna)。在其最简单的形式中，载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
[0627]
本发明中使用的载体可以是例如质粒、mrna或病毒载体，并且可以包括用于表达核酸分子/多核苷酸的启动子(如上所述)和任选地启动子的调节子。
[0628]
载体可以进一步包含额外的启动子，例如，在一个实施方案中，启动子可以是ltr，例如逆转录病毒ltr或慢病毒ltr。长末端重复序列(ltr)是相同的dna序列，其在逆转录转座子或由逆转录病毒rna逆转录形成的前病毒dna的任一端重复数百或数千次。病毒利用它们将其遗传物质插入宿主基因组。在ltr中发现了基因表达的信号：增强子、启动子(可以同时具有转录增强子或调节元件)、转录起始(如加帽)、转录终止子和多聚腺苷酸化信号。
[0629]
适当地，本发明的载体可以包括5'ltr和3'ltr。
[0630]
本发明的载体可以包含一种或多种可以在转录前或转录后起作用的额外的调节序列。“调节序列”是促进多肽表达的任何序列，例如作用以增加转录物的表达或增强mrna稳定性。合适的调控序列包括例如增强子元件、转录后调控元件和多腺苷酸化位点。适当
地，额外的调节序列可以存在于ltr中。
[0631]
适当地，载体可以包含例如可操作地连接到启动子的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。
[0632]
可以使用本领域已知的多种技术，如转化和转导，将包含本发明的核酸分子/多核苷酸的载体引入细胞中。本领域已知几种技术，例如用重组病毒载体(如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和单纯疱疹病毒载体)感染；直接注射核酸和基因枪转化。
[0633]
非病毒递送系统包括但不限于dna转染方法。在此，转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。非病毒递送系统可以包括脂质体或两亲细胞穿透肽，优选与本发明的多核苷酸复合。
[0634]
典型的转染方法包括电穿孔、dna基因枪法、脂质介导的转染、压缩dna介导的转染、脂质体(liposome)、免疫脂质体、脂质体(lipofectin)、阳离子试剂介导的转染、阳离子表面两亲物(cfa)(nat.biotechnol.(1996)14:556)及其组合。
[0635]
多个载体，例如编码如本文定义的不同car，或编码如本文定义的car和另外的多肽，可用于转导/转染。
[0636]
制备细胞的方法
[0637]
本发明的工程化细胞(例如，treg)可以通过引入如本文所定义的核酸分子或载体生成，通过包括用病毒载体转导和用dna或rna转染的多种方法中的一种。
[0638]
本发明的细胞可以通过以下方式制备：将本文定义的核酸分子/多核苷酸或载体引入细胞(例如通过转导或转染)。
[0639]
适当地，细胞可以来自分离自受试者的样品。
[0640]
本发明的工程化细胞(例如，treg)可以通过包括以下步骤的方法生成：
[0641]
(i)从受试者中分离含有细胞的样品或提供含有细胞的样品；以及
[0642]
(ii)用本文定义的多核苷酸、核酸或载体转导或转染含有细胞的样品，以提供工程化细胞群。
[0643]
适当地，可以在该方法的步骤(ii)之前和/或之后从含有细胞的样品中分离、富集和/或生成富含treg的样品。例如，可以在步骤(ii)之前和/或之后进行treg的分离、富集和/或生成，以分离、富集或生成富含treg的样品。可以在步骤(ii)之后从含有细胞的样品中进行分离和/或富集，以富集包含如本文所述的嵌合受体(例如，car)、核酸分子/多核苷酸和/或载体的细胞和/或treg。
[0644]
可以通过本领域技术人员已知的任何方法分离或富集富含treg的样品，例如通过facs和/或磁珠分选。可以通过本领域技术人员已知的任何方法从含有细胞的样品中生成富含treg的样品，例如从通过引入编码foxp3的dna或rna的tcon细胞和/或从来自诱导型祖细胞或胚胎祖细胞的离体分化的tcon细胞。
[0645]
适当地，细胞是如本文定义的treg。
[0646]
适当地，本发明的工程化treg可以通过包括以下步骤的方法生成：
[0647]
(i)从受试者中分离富含treg的样品或提供富含treg的样品；以及
[0648]
(ii)用本文定义的多核苷酸、核酸或载体转导或转染富含treg的样品，以提供根据本发明的工程化treg细胞群。
[0649]
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料都可以用于本公开的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
[0650]
在提供了数值范围的情况下，应理解，除非上下文另有明确说明，否则该范围的上限和下限之间的每个间隔值至下限的单位的十分之一也被具体公开。任何规定值或规定范围内的间隔值与该规定范围内的任何其他规定或间隔值之间的每个较小范围都包含在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且其中任一限制或两个限制均不包括在较小范围内、或两个限制都包括在较小范围内的每个范围也包括在本公开内，但受制于规定范围中任何明确排除的限制。在规定范围包括限制之一或两者的情况下，排除那些包括的限制之一或两者的范围也包括在本公开中。
[0651]
必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数的对象，除非上下文另有明确规定。
[0652]
如本文所用，术语“包括(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised of)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含(contains)”同义，是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、非列举的组分、元件或方法步骤。术语“包括”、“包含”和“由...组成”还包括术语“由...组成(consisting of)”。
[0653]
本文所讨论的出版物仅为了它们在本技术的提交日期之前的公开而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
[0654]
声明
[0655]
1.一种核酸，其包含(i)编码foxp3的第一多核苷酸序列和(ii)编码嵌合受体(例如嵌合抗原受体(car))的第二多核苷酸序列，其中所述嵌合受体(例如，car)包含内结构域，所述内结构域包含stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序，其中所述第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列可操作地连接到相同的启动子。
[0656]
2.根据条款1的核酸，其中所述嵌合受体(例如，car)内结构域包含两个或更多个stat5结合基序。
[0657]
3.根据条款1或2的核酸，其中所述一个或多个stat5结合基序来自白介素受体(il)受体内结构域。
[0658]
4.根据条款1至3中任一项的核酸，其中所述一个或多个stat5结合基序来自il2rβ、il7rα、il-3rβ(csf2rb)、il-9r、il-17rβ、促红细胞生成素受体、血小板生成素受体、生长激素受体和催乳素受体。
[0659]
5.根据条款1至4中任一项的核酸分子，其中stat5结合基序包含氨基酸基序yxxf/l(seq id no:8)；其中x是任意氨基酸。
[0660]
6.根据条款1至5中任一项的核酸分子，其中stat5结合基序包含氨基酸基序yctf(seq id no:9)、yfff(seq id no:10)、ylsl(seq id no:11)和/或ylslq(seq id no:12)的一个或多个。
[0661]
7.根据条款6的核酸分子，其中所述stat5结合基序包含氨基酸基序ylslq(seq id no:12)。
[0662]
8.根据条款7的核酸分子，其中内结构域包含第一stat5结合基序和第二stat5结
合基序，所述第一stat5结合基序包含氨基酸基序ylslq(seq id no:12)，所述第二stat5结合基序包含氨基酸基序yctf(seq id no:9)或yfff(seq id no:10)。
[0663]
9.根据条款8的核酸分子，其中内结构域包含以下stat5结合基序：ylslq(seq id no:12)、yctf(seq id no:9)和yfff(seq id no:10)。
[0664]
10.根据条款1至9中任一项的核酸分子，其中所述jak结合基序是jak1结合基序。
[0665]
11.根据条款10的核酸分子，其中所述jak1结合基序来自白介素受体(il)受体内结构域。
[0666]
12.根据条款1至11中任一项的核酸分子，其中所述jak1结合基序包含如seq id no:13-seq id no:19中任一条所示的氨基酸基序或与seq id no:13-seq id no:19具有至少80％同一性的变体。
[0667]
13.根据条款12的核酸分子，其中jak1结合基序是如seq id no:13所示的氨基酸基序；或与seq id no:13具有至少80％同一性的变体。
[0668]
14.根据条款1至13中任一项的核酸分子，其中car内结构域包含如seq id no:1所示的il2rβ内结构域；或与seq id no:1具有至少80％序列同一性的变体。
[0669]
15.根据条款1至14中任一项的核酸分子，其中所述嵌合受体(例如，car)内结构域包含如seq id no:23或seq id no:24中任一条所示的截短的il2rβ内结构域；或seq id no:23或seq id no:24的变体，所述变体与seq id no:23或seq id no:24具有至少80％序列同一性。
[0670]
16.根据条款1至15中任一项的核酸分子，其中所述jak3结合基序包含seq id no:25或seq id no:26或与seq id no:25或seq id no:26具有至少80％序列同一性的变体。
[0671]
17.根据条款1至16中任一项的核酸分子，其中所述嵌合受体(例如，car)内结构域包含seq id no:45、seq id no:53或seq id no:154；或与seq id no:45、seq id no:53或seq id no:154具有至少80％序列同一性的变体。
[0672]
18.根据条款1至17中任一项的核酸分子，其中jak3结合基序位于嵌合受体(例如，car)内结构域中的stat5结合基序以及jak1结合基序和/或jak2结合基序的n末端。
[0673]
19.根据条款1至18中任一项的核酸分子，其中jak3结合基序通过接头或铰链与stat5结合基序以及jak1结合基序和/或jak2结合基序连接。
[0674]
20.根据条款1至19中任一项的核酸分子，其中所述核酸分子包含所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸之间的共表达位点。
[0675]
21.一种载体，其包含条款1至20中任一项的核酸分子。
[0676]
22.一种工程化treg细胞，其包含条款1至20中任一项的核酸分子或条款21的载体。
[0677]
23.一种药物组合物，其包含条款22的工程化treg细胞。
[0678]
24.用于治疗的条款22的工程化treg细胞或条款23的药物组合物。
[0679]
25.用于诱导对移植物的耐受、用于治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、用于促进组织修复和/或组织再生、或者用于改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的条款22的工程化treg细胞。
[0680]
26.用于诱导对移植物的耐受、用于治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、用于促进组织修复和/或组织再生、或者用于改善继发于代谢紊乱的慢
性炎症的条款23的药物组合物。
[0681]
27.一种诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、或者促进组织修复和/或组织再生、或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的方法，其包括向受试者施用如条款22中所定义的工程化treg或如条款23中所定义的包含工程化treg的药物组合物中的任一个的步骤。
[0682]
28.根据条款27的方法，其包括以下步骤：
[0683]
(i)从受试者中分离或提供富含treg的细胞样品；
[0684]
(ii)treg细胞的转导或转染：使用条款1至20中任一项的核酸分子；或条款21的载体；以及
[0685]
(iii)将来自(ii)的treg细胞施用于受试者。
[0686]
29.条款22中定义的工程化treg在制造用于诱导对移植物的耐受、治疗和/或预防细胞和/或体液移植排斥、治疗和/或预防移植物抗宿主病(gvhd)、自身免疫或过敏性疾病、或者促进组织修复和/或组织再生、或者改善继发于代谢紊乱的慢性炎症的药物中的用途。
[0687]
30.根据条款24至26中任一项用途的工程化treg或药物组合物；根据条款27或28的方法；或者根据条款29的用途，其中所述受试者是接受免疫抑制治疗的移植接受者。
[0688]
31.根据条款30的用途的工程化treg或药物组合物、方法或者用途，其中所述移植物选自肝、肾、心脏、肺、胰腺、肠、胃、骨髓、带血管的复合组织移植物和皮肤移植物。
[0689]
32.根据条款31的用途的工程化treg或药物组合物、方法或者用途，其中所述移植物是肝移植物。
[0690]
33.根据条款32的用途的工程化treg或药物组合物、方法或用途，其中所述car包含能够特异性结合抗原的抗原结合结构域，所述抗原选自：存在于移植肝脏中但不存在于接受者中的hla抗原、肝脏特异性抗原(如ntcp)或者在排斥或组织炎症期间表达上调的抗原(如ccl19、mmp9、slc1a3、mmp7、hmmr、top2a、gpnmb、pla2g7、cxcl9、fabp5、gbp2、cd74、cxcl10、ubd、cd27、cd48、cxcl11)。
[0691]
34.根据条款33的用途的工程化treg或药物组合物、方法或用途，其中所述car包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域能够特异性结合存在于移植供体中但不存在于移植接受者中的hla抗原。
[0692]
35.根据条款34的用途的工程化treg或药物组合物、方法或用途，其中所述抗原是hla-a2。
[0693]
36.根据条款35的用途的工程化treg或药物组合物、方法或用途，其中所述car包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含seq id no:34或seq id no:34的变体，所述变体与seq id no:34具有至少80％同一性。
[0694]
37.根据条款24至36的用途的工程化treg或药物组合物、方法或用途，其中所述自身免疫或过敏性疾病选自包括牛皮癣和皮炎(例如特应性皮炎)的炎性皮肤病、与炎症性肠病(如克罗恩病和溃疡性结肠炎)相关的反应、皮炎、过敏性病症(如食物过敏、湿疹和哮喘)、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮(sle)(包括狼疮肾炎、皮肤狼疮)、糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)、cipd、多发性硬化症、神经退行性疾病(例如als)和青少年糖尿病。
[0695]
38.一种生产工程化treg的方法，其包括以下步骤：
[0696]
(i)从受试者中分离含有细胞的样品或提供含有细胞的样品；以及
[0697]
(ii)用一种或多种核酸分子或者含有所述核酸分子的载体转导或转染所述含有细胞的样品，所述核酸分子包括(i)编码foxp3的第一多核苷酸序列和(ii)编码嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))的第二多核苷酸序列，其中所述嵌合受体(例如，car)包含内结构域，所述内结构域包含stat5结合基序、jak1结合基序和/或jak2结合基序以及jak3结合基序，以提供工程化细胞群；
[0698]
其中含有细胞的样品包含treg和/或在步骤(ii)之前或之后从含有细胞的样品富集和/或生成treg。
[0699]
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明并且不以任何方式限制本发明的范围。
[0700]
实施例
[0701]
实施例1
–
抗-hla.a2 il2r car-treg的生成
[0702]
分离cd4+cd25hicd127low细胞并用抗cd3/cd28磁珠活化。活化三天后，用含有hla.a2-car(如图2所示)和gfp报告基因的慢病毒转导treg。多克隆活化后，总treg的细胞扩增显示未转导treg或转导treg之间没有显著差异(图3)。
[0703]
实施例2
–
抗hla.a2 il2r构建体随时间的转导效力的量化
[0704]
在细胞活化后的不同时间点，分析未转导treg和用car构建体转导的treg上的gfp表达。
[0705]
分析gfp+细胞的频率以评估不同构建体在treg扩增期间的转导效力和表达持久性。含有dcar、cd28z、构建体1、2和3的treg在转导后显示出相似的表达频率。在多克隆细胞扩增期间，整个treg中gfp+细胞的百分比保持不变(图4)。
[0706]
实施例3
–
抗hla.a2 il2r car构建体在转导的treg上的细胞表面表达的量化
[0707]
通过pe缀合的hla-a*0201/cingvcwtv dextramer(immudex，哥本哈根，丹麦)分析未转导treg和转导的treg上car构建体的膜表达。在所有构建体之间，treg在细胞表面(hla-a2 dextramer+)中表达car蛋白的频率相似(图5)。
[0708]
实施例4
–
多克隆细胞扩增后car treg的表型表征
[0709]
在抗cd3/cd28活化磁珠和il-2的存在下培养和扩增treg 15天。treg相关标志物foxp3、helios、ctla4和tigit通过facs对未转导treg和转导的treg进行分析，以评估培养第15天的表型谱系稳定性。
[0710]
未转导的treg和car转导的treg在多克隆扩增后显示出与treg谱系和功能相关的蛋白质的相似表达水平(图6)。
[0711]
实施例5
–
抗hla.a2 il2r car treg的抗原特异性的评估
[0712]
在存在不同刺激的情况下，将未转导treg和转导的treg培养18小时。分析cd69和cd137活化标志物以评估特异性和非特异性细胞活化。
[0713]
基于t细胞活化标志物的表达，用cd28z、构建体1、2和3car转导的treg对hla-a2分子显示出相似的特异性。cd69和cd137的表达在未活化的细胞上或与hla-a1表达细胞培养后没有增加。由于缺少信号传导内结构域，dcar构建体没有显示出活化(图7)。
[0714]
实施例6
–
stat5磷酸化分析作为il2r car信号传导的指标
[0715]
转导的car treg在不含il2的培养基中静息过夜。在仅用培养基、1000iu/ml il-2
或在基于hla.a2-ig的人工apc(按照doi:10.3791/2801描述的方案生产)存在的情况下培养10分钟和120分钟后，通过facs分析评估treg的stat5磷酸化。
[0716]
il2r内结构域整合到car构建体中显示了通过hla-a2分子活化car后stat5的有效磷酸化。在用hla-a2磁珠培养后，在没有il2r内结构域的car-treg上没有检测到pstat5的显著增加(图8)。
[0717]
实施例7
–
在不存在il-2的情况下，非特异性和hla.a2特异性活化后的treg存活率的评估
[0718]
在不存在il-2的情况下，用抗cd3/28活化磁珠和k562.a2表达细胞培养具有不同构建体的car转导treg。在活化后7天通过facs分析评估细胞存活率。
[0719]
与hla-a2表达细胞一起培养后的参考cd28z相比，表达含有il2r内结构域的car构建体的treg显示出增加的细胞活力。在treg的多克隆活化后未观察到这些差异，这表明该效应取决于car信号传导(图9)。
[0720]
实施例8
–
treg抑制效力测试：通过分析b细胞上共刺激分子的调节来评估treg的免疫调节功能
[0721]
分析与treg共培养后b细胞cd80和cd86的表达，以评估treg降低抗原呈递细胞上共刺激分子表达的能力。
[0722]
与非转导treg或表达dcar的treg相比，表达cd28z、构建体1和构建体2car的treg显示出增强的抑制功能。b细胞上的cd80和cd86表达仅在与通过car分子发出信号的treg培养后下调(图10)。
[0723]
实施例9
–
用编码foxp3和hla-a2特异性car的构建体转导的treg表达两种基因并且以显著高于仅具有内源性foxp3的treg的水平表达foxp3
[0724]
通过cd4+和cd25+富集从pbmc中分离treg。对富集的细胞进行cd4、cd25、cd127和cd45ra染色，并通过facs进行分选。
[0725]
用四种构建体之一转导富集的treg。图11a显示了所用构建体的示意图：构建体f-c：说明了编码5'-foxp3-p2a-a2 car-3'的构建体；构建体r-c：说明了编码5'-r-p2a-a2 car-3'的构建体，其中r是另一个基因；构建体c：说明了仅编码a2 car的构建体；构建体c-r：说明了编码5'-a2 car-p2a-r-3'的构建体，其中r是另一个基因。
[0726]
图11b显示了转导方法的示意图。
[0727]
使用以下方案扩增富集和转导的细胞：
[0728]
·
第0天，在texmacs
tm
与gibco
tm dynabeads
tm human t-activator cd3/cd28中，每毫升0.25
×
106个
[0729]
·
第2天，在具有il-2和病毒、包被有纤维连接蛋白(retronectin)的培养板的texmacs
tm
中，每毫升0.1
×
106个
[0730]
·
第4-9天，在t25烧瓶/6孔板中用具有il-2的texmacs
tm
重悬至每毫升0.25
×
106个
[0731]
·
第15天，在t25烧瓶中用具有il-2的texmacs
tm
重悬至每毫升0.25
×
106个
[0732]
图12显示了与模拟对照treg相比，在用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg中，通过流式细胞术测定的hla-a2特异性car(a2 car)表达水平、foxp3表达水平和另一个基因r的表达水平。
[0733]
图12a显示了用每种构建体转导的treg表达hla-a2特异性car。hla-a2特异性car从car位于下游(构建体r-c)和car位于上游(构建体c-r)的两种构建体中表达。
[0734]
图12b显示了foxp3在所有treg中表达，但在构建体f-c中明显更高，特别是与仅表达hla-a2特异性car(构建体c)相比。
[0735]
实施例9b
–
用编码foxp3和hla-a2特异性car的构建体转导的treg保留foxp3表达
[0736]
图13显示了与模拟对照treg相比，在用构建体f-c、构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的持续扩增的treg中，通过流式细胞术测定的hla-a2特异性car(a2 car)表达水平、foxp3表达水平和另一个基因r的表达水平。
[0737]
图13a显示了用每种构建体转导的treg在持续扩增后仍表达hla-a2特异性car。
[0738]
图13b显示了用构建体r-c、构建体c和构建体c-r转导的treg在持续扩增后foxp3表达降低。相比之下，在构建体f-c转导的treg在持续扩增后foxp3表达没有减少。因此，foxp3表达在持续扩增后的构建体f-c中显著更高，特别是与仅表达hla-a2特异性car(构建体c)相比时。
[0739]
实施例10
[0740]
制造如图15所示的构建体，并按照如下对treg细胞进行分离、转导和活化。对照构建体和构建体ci至cx分别具有seq id no:182至seq id no:192所示的序列。应当注意，构建体ci-cx在本文中也可互换地称为构建体1至10，或con1至con10。
[0741]
构建体ci至cx和对照构建体都包含相同的细胞外结构域，包括细胞外铰链结构域和相同的跨膜结构域。细胞外结构域包含seq id no:41的hcd8前导序列、seq id no:196的抗hla.a2 scfv序列和seq id no:194的cd8铰链序列。跨膜结构域是seq id no:195的cd8跨膜结构域。构建体还都包含cd28共刺激结构域(包含在seq id no:28中添加单个氨基酸(倒数第二个a，其被引入以促进克隆))和cd3ζ信号传导结构域(如seq id no:27所示)。构建体在il2rβ截短结构域(il2rby510；seq id no:23)和/或il2rγ截短结构域(ilr2gt52；seq id no:25)的存在以及ilr2b和ilr2g结构域之间的接头序列方面不同。
[0742]
构建体cii的序列如下所示(seq id no:184)：
[0743][0744]
从n末端开始，该构建体的组成部分可以确认如下：
[0745]
前导序列(字号更小的字母)；scfv(普通字母)与vh和vl之间的scfv接头序列(浅色字)；间插序列(下划线)；cd8铰链结构域(粗体)；cd8 tm结构域(斜体)；cd8和cd28胞内结
构域部分(字号更小的字母)；斜体的cd28共刺激结构域(在倒数第二个位点添加了以小写字母显示的额外氨基酸a)；ilr2gt52(下划线)；添加的氨基酸le(小写字母)；ilrby510(粗体)；添加的氨基酸ct(小写字母)；cd3ζ(普通字母)。添加了以小写字母显示的氨基酸以允许克隆。
[0746]
构建体cii是一种对比的构建体，其包含截短的il2rγ(il2rgt52)和截短的il2rβ(il2rby510)结构域，其中这些结构域直接彼此连接，中间没有接头序列。
[0747]
构建体ci和ciii也是对比的构建体。ci在没有ilr2gt52和额外的氨基酸le方面区别于cii。构建体ciii在没有ilr2rby510和额外的氨基酸ct方面区别于cii。
[0748]
构建体iv至cx代表本发明的构建体并且在il2rgt52和ilr2rby510末端添加的氨基酸“le”之间存在接头序列方面区别于cii，分别对应于seq id no:155、seq id no:158、seq id no:159、seq id no:160、seq id no:166、seq id no:167和seq id no:168的接头序列，如图15所示。
[0749]
对照构建体与cii的不同之处在于不存在ilr2gt52和额外的氨基酸le，以及不存在ilr2rby510和额外的氨基酸ct。
[0750]
尽管在本文中作为实施例呈现，但这些构建体的胞内结构域的设计具有更普遍的适用性并且可以更广泛地用于根据本发明的其他嵌合受体的设计和制备。因此，如上所述的任何一种构建体civ至cx或其变体的内结构域可以用于本发明的任何嵌合受体，包括例如与任何其他细胞外结构域或抗原结合结构域和/或任何其他tm结构域一起。此外，可以修改内结构域的设计，例如添加一个或多个其他共刺激结构域，或其他细胞内特征。此外，可以修饰内结构域序列以去除全部或部分cd8和cd28胞内结构域部分(nhrppawv，seq id no:205)。
[0751]
每个构建体civ至cx的内结构域分别由seq id no:198至seq id no:204表示。
[0752]
细胞的转导和扩增
[0753]
cd4
+
cd25
+
cd127-人treg是从健康供体血液中分离出来的。使用编码构建体的慢病毒载体转导treg，如图15所示。使用dynabeads
tm human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion and activation(thermofisher scientific，马萨诸塞州，美国)和白介素-2(il-2；clinigen，特伦特河畔伯顿，英国)扩增treg。以每1ml培养体积补充300国际单位(iu)il-2。
[0754]
treg的静息
[0755]
通过磁吸技术去除treg培养物中dynabeads
tm human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion andactivation(thermofisher scientific)。清洗细胞并重悬于x-vivo
tm 15培养基(lonza)中；没有补充il-2。
[0756]
hla-a2-ig人工呈递细胞(apc)
[0757]
用无菌硼酸盐缓冲液(thermofisher scientific)清洗1ml的dynabeads
tm m-450epoxy磁珠(相当于大约4亿颗磁珠)。将40μg hla-a2-ig二聚体(bd，新泽西州，美国)和40μg抗人cd28 mab(bioxcell，新罕布什尔州，美国)加入到硼酸盐缓冲液中的dynabeads
tm m-450epoxy磁珠中并孵育24小时。24小时后，除去硼酸盐缓冲液并加入磁珠洗涤缓冲液和0.1g/l叠氮化钠(均为thermofisher scientific)。
[0758]
细胞表达测定
[0759]
在用apc缀合的hla-a*0201/cingvcwtv dextramer(immudex,哥本哈根，丹麦)染色之前，在facs中洗涤2
×
105个细胞。在pbs中洗涤细胞，并使用live/dead
tm fixable near-ir(thermofisher scientific)对死细胞进行染色。细胞在facs缓冲液中洗涤，然后用细胞表面抗体(brilliant violet 510
tm
抗人cd4(biolegend，加利福尼亚，美国)、pe/cyanine7抗人cd25(biolegend)和cd34单克隆抗体(qbend/10)-pe(thermofisher scientific))进行fc封闭和染色。然后用alexa488抗人foxp3抗体对洗涤过的细胞进行染色。在attune nxt cytometer(thermofisher scientific)上获得细胞。
[0760]
活化测定
[0761]
使用前对hla-a1和hla-a2 k562细胞进行辐照。按照如下设置活化测定共培养物：treg:hla-a1 k562；treg:hla-a2 k562；treg:dynabeads
tm human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion and activation(thermofisher scientific)或仅含培养基的treg(未刺激)。使用补充有5％热灭活人血清(merck life science uk limited)的x-vivo
tm 15培养基(lonza)建立共培养物。染色前将共培养物在37℃和5％co2下孵育18小时。18小时后，在pbs中洗涤细胞并使用live/dead
tm fixable near-ir(thermofisher scientific)对死细胞进行染色。在facs缓冲液中细胞洗涤，然后用细胞表面抗体(brilliant violet 510
tm
抗人cd4(biolegend)、cd34单克隆抗体(qbend/10)-pe(thermofisher scientific)、pe/cyanine7抗人cd69(biolegend)和apc抗人cd137(4-1bb；biolegend))进行fc封闭和染色。在attune nxt cytometer(thermofisher scientific)上获得洗涤过的细胞。
[0762]
生存率分析
[0763]
使用前对hla-a1和hla-a2 k562细胞进行辐照。按照如下建立存活率测定共培养物：treg:hla-a1 k562；treg:hla-a2 k562；tregs:dynabeads
tm human t-activator cd3/cd28 for t cell expansion and activation(thermofisher scientific)或仅含培养基的treg(未刺激)。使用10μg/ml ultra-leaf纯化的抗人il-2和5μg/ml纯化的抗人cd122(均为biolegend)在x-vivo
tm 15培养基(lonza)中建立共培养物，并添加5％热灭活人血清(merck life science uk limited)。共培养物在37℃和5％co2下共培养6天。第6天，在facs缓冲液中洗涤共培养物，然后用细胞表面抗体(brilliant violet 510
tm
抗人cd4(biolegend)、pe/cyanine7抗人cd25(biolegend)和cd34单克隆抗体(qbend/10)-pe(thermofisher scientific))进行fc封闭和染色。然后将细胞在facs缓冲液中洗涤，并使用具有7aad(biolegend)的fitc膜联蛋白v凋亡检测试剂盒，以具有fitc膜联蛋白v和7aad溶液的膜联蛋白v结合缓冲液重悬。孵育后，将膜联蛋白v结合缓冲液添加到制剂中。在attune nxt cytometer(thermofisher scientific)上获得细胞。
[0764]
pstat5 elisa和蛋白质印迹(wb)检测
[0765]
pstat5 elisa和wb测定共培养物设置如下：treg:hla-a2 k562；tregs:hla-a2-ig包被的磁珠(a2磁珠)；含有100iu/ml il-2的treg或仅含有培养基的treg(未刺激)。除添加100iu/ml的il-2外，所有共培养物均使用10μg/ml ultra-leaf纯化的抗人il-2和5μg/ml纯化的抗人cd122(均为biolegend)建立。在补充有5％热灭活人血清(merck life science uk limited)的x-vivo
tm 15培养基(lonza)中建立共培养物并孵育。随后，用pbs洗涤细胞两次，然后用放射免疫沉淀测定(ripa)缓冲液(thermofisher scientific)裂解细胞沉淀。样
品在冰上孵育，然后以14,000g离心。细胞裂解物样品储存在-80℃直至使用。
[0766]
stat5 a/b(py694/699)simplestep试剂盒检测
[0767]
将细胞裂解物样品解冻并使用pierce
tm bca蛋白检测试剂盒(thermofisher scientific)，以确定stat5 a/b(py694/699)simplestep试剂盒检测(abcam，剑桥，英国)中最佳输入量的蛋白质浓度。根据制造商的指南处理样品。
[0768]
pstat5蛋白质印迹检测
[0769]
将细胞裂解物样品解冻，然后使用pierce
tm bca蛋白检测试剂盒(thermofisher scientific)，以确定pstat5蛋白质印迹检测中最佳输入量的蛋白浓度。每孔上样等量的蛋白质。样品在70℃下处理10分钟，然后在冰上孵育2分钟。然后将样品加载到nupage
tm 4-12％bis-tris蛋白凝胶中，将其放置在带有1x nupage mes sds电泳缓冲液(均为thermofisher scientific)的xcell surelock mini-cell凝胶电泳槽中。使用iblot
tm 2干式印迹系统的干式印迹是根据制造商的指南进行的。随后，使用phospho-stat5(tyr694)(cell signaling technology,马萨诸塞州，美国)将膜封闭和染色。
[0770]
结果
[0771]
图16中的表达分析显示了所有测试的构建体(参见图15)都在treg的细胞表面上表达(n来自2至16个个体供体)(图16a)。尽管构建体的mfi各不相同，但都能够在供体之间产生高水平的转导。此外，在treg样品中观察到rqr8(seq id no:193)(与来自核酸构建体的car共表达的安全转换器)的高水平和相似水平的转导。无论car结构如何，所有细胞都具有相似水平的foxp3。
[0772]
如图17a和图17b所示，所有使用的car构建体都能够被抗原(在k562 a2细胞上表达的hla-a2)刺激，其显示了两种treg活化标志物(cd69和cd137)的水平。磁珠还能够通过它们的内源性tcr非特异性地刺激转导的treg。
[0773]
图18显示了当用不同的car构建体转导时，来自三个不同供体的treg的存活率百分比。包含在jak3结合基序和stat5结合基序/jak1结合基序之间的接头的构建体通常引起用这些构建体转导的细胞的存活水平增加。具体地，构建体4(seq id no:186))和构建体5(seq id no:187)(参见图15)显示出比构建体1(seq id no:183)更高的存活率百分比，表明当jak3结合基序与这些接头一起存在时赋予了潜在的优势。
[0774]
由于mfi和car表达之间的非线性关系，图18中显示的数据使用cd69而不是mfi重新标准化，参见图19中显示的结果。图19进一步显示了与仅具有stat5结合基序/jak1结合基序的构建体或与没有jak3结合基序或stat5结合基序/jak1结合基序的对照构建体相比，使用包含除了stat5结合基序/jak1结合基序外，还包含jak3结合结构域和接头的构建体显示存活率增加。
[0775]
图20进一步显示了根据elisa的包含jak3结合基序和接头的构建体相关的pstat5活性，图21显示了将构建体4(seq id no:186)(具有jak3结合基序和接头)与仅具有stat5结合基序/jak1结合基序的构建体1(seq id no:183)进行比较时，显示出增高的pstat5活性。pstat5活性表明细胞通过转导的构建体接收到的持续信号的存在。
[0776]
因此，实施例10中所示的数据显示了当用另外包含jak3结合基序和接头的构建体转导时，可以在treg供体中看到的存活优势和增加的pstat5活性趋势。
[0777]
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和
精神的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地限制于这些具体的实施方案。实际上，对分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。