1.本发明涉及具有高抗微生物活性的合成融合蛋白的生产和用途。本发明的蛋白可用于各种领域：[0002]-在环境消毒中，本发明的蛋白可用于制备消毒剂溶液，该消毒剂溶液可用于临床、医院和家庭领域，用于繁忙交通环境，用于进气和排气系统或空调或atu处理装置的过滤器，用于食物制备的环境。总之，在所有必需采取抗微生物预防的区域。[0003]-单独用于医学、兽医学或化妆品领域，或作为抗细菌、抗真菌、抗病毒制剂的基础，或用于对抗支原体感染和植原体感染，通过气雾剂用于局部、皮肤或粘膜使用。作为漱口水、牙膏和护肤霜的成分。[0004]-在农业和植物药物领域中，根据本发明的蛋白可用于相同的目的，以对抗植物物种中的感染，既可直接使用，也可通过农杆菌渗入(agro-infiltration)使用。
背景技术：
：：[0005]许多细菌和许多病毒具有共同的攻击机制，即靶生物结构，其由具有结构功能的蛋白构成，位于质膜内部以赋予其机械抵抗力。在两种物种之间的相互生化反应结束时，获得渗透，这种渗透最终通过裂解导致细胞壁的破坏。这种生物化学作用被证明是一种共同的特征，其需要植物界中存在的以下一类酶的单一保守机制的作用：[0006][0007]多聚半乳糖醛酸酶，它能够通过细菌和真菌典型的内切糖苷酶(纤维素酶)分裂纤维素两个杂环之间的键，对受侵染的植物组织具有溶解作用。然而，在其它情况下，特别是关于病毒攻击，生物结构的融合允许病毒遗传物质传递至真核细胞中，该融合通过刺突(spikes)通过与膜受体结合使遗传物质引入而发生。这两种感染机制都需要与允许病原体进入植物真核细胞或植物细胞的不同特性的表面蛋白相互作用。[0008]多聚半乳糖醛酸酶(pg)是纤维素酶，它们是属于糖基化酶类的蛋白，并催化水解反应：pg在果实成熟过程中发挥重要作用。[0009]在成熟过程中，原果胶在果胶酯酶的作用下降解成果胶酸。随后，果胶酸(半乳糖醛酸的聚合物)被pg水解和溶解，从而软化果肉。植物生物已经发展了基于多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(pgip)的防御系统，其能够抑制果胶酯酶反应。(jaillono,etal.nature,2007sep27.pmid17721507)。[0010]在各种类型的pgip中，有一种具有降解活性，由一系列重复的亮氨酸组成，，这些亮氨酸形成所谓的“亮氨酸拉链”，pgip识别果胶酶并通过接触释放过氧化氢来降解它们。释放的离子种类(h++o22-)与复合物的外部结构紧密接触，并开始氧化和还原，以转移和获得原子的外层电子，糖蛋白成分与上述两种离子物质接触。这种富含亮氨酸的重复序列(lrr)由长度为20-30个氨基酸的2-45个基序组成，通常呈弓形或马蹄形[1]。[0011]lrr可以存在于蛋白中，也可来自真核病毒，这似乎为蛋白-蛋白相互作用的形成提供了结构框架[2，3]。[0012]lrr蛋白组的分析序列表明产生许多亚家族的不同的lrr的存在。这种分类的意义在于，在植物门之间，不同亚家族的重复从来不会同时发生，而很可能是独立进化的。然而，现在很清楚，所有主要的lrr类都有弯曲的马蹄形结构，在凹面有一个平行的β片，在凸面主要是螺旋元素。[0013]已经鉴定了至少六个以不同长度和重复共有序列为特征的lrr蛋白家族。[0014]lrr残基的11个片段(lxxlxlxxn/cxl)，对应于β链和相邻的环区域，在lrr蛋白中是保守的，而重复序列的其余部分(本文定义为变量)可能非常不同。一些种类的pgip的形状由氨基酸的线性序列与“环”中的两半形成，以形成马蹄状蛋白。[0015]凹面和相邻的环是lrr蛋白上最常见的蛋白相互作用表面。一些蛋白-配体lrr复合物的3d结构表明，lrr结构域的凹面对于α-螺旋相互作用是理想的，因此支持了早期的结论，即伸长和弯曲的lrr结构为实现不同的蛋白-蛋白相互作用提供了出色的框架[2]。[0016]分子计算模型的预测表明，比先前提出的lxxlxlxxn/cxl更短的保守模型lxxlxl，足以使具有20至30个重复残基的的蛋白具有独特的马蹄形曲率[5]。[0017]以上提到的具有防御功能的pgip亚家族分为两类：细胞质的或锚定至细菌膜上的。后者含有一部分肉豆蔻酸，这使得它能够锚定至细胞膜上，从而将它定向成直接与真菌细菌和病毒典型的外源葡聚糖和/或肽-葡聚糖结构接触。这种接触引发了氧化还原反应，破坏了这些结构的结合，破坏了寄生的微生物[6]。[0018]糖基转移酶是催化糖部分从活化供体分子转移至特定受体分子，形成糖苷键的酶。糖基转移酶可根据底物和反应产物的立体化学分类为保留酶或转化酶[sinnott,ml(1990)catalyticmechanismsofenzymaticglycosyltransfer.chem.rev.90,1171-1202]。来自莲花(nelumbonucifera)5e9u_a的糖基转移酶(称为gtf1的还原酶)具有进行二糖、寡糖和多糖的生物合成的通用功能。[0019]冠状病毒是20世纪60年代鉴定的一类病毒，最初被描述为能够引起普通感冒的病毒。[0020]sarscov-2，特别是sars相关冠状病毒/sars-cov种类的病毒，属于冠状病毒家族，具有由约30kb的单链rna螺旋组成的病毒基因组。病毒体有四种结构蛋白，称为：蛋白s(刺突)、e(包膜)、m(膜)和n(核衣壳)；sars-cov-2刺突蛋白是负责冠状病毒进入宿主细胞的糖蛋白，其由两个功能亚基(subunit)组成，s1和s2亚基。s1亚基由n-末端结构域(ntd)和受体结合结构域(rbd)组成。s1亚基的功能是结合宿主细胞上的受体。s2亚基的功能是融合病毒和宿主细胞的膜。s1亚基和s2亚基交界处的切割位点被称为蛋白酶的s1/s2切割位点。[0021]这种糖-蛋白复合物开始与细胞受体融合，然后建立融合键，最终导致遗传材料在真核细胞内的传递，随后发生病毒的衣壳破坏和逆转录。[0022]考虑到经济上的重要性，近年来已经开发了许多能够抵抗上述微生物攻击的产品。[0023]迫切需要对抗这些类型的感染的新方法，这些类型的感染对于控制可传播性的危险方面越来越成问题。目前使用的能够在环境中抑制细菌和/或病毒负荷传播的抗菌产品是由非常具有侵蚀性的化学物质承担的，例如：na+hclo-(次氯酸钠)、苯扎氯铵，或者通过戊二醛或例如含有0.1％至0.5％之间的活性游离氯活性的某些种类的酸的物质。[0024]然而，这些具有氧化还原活性的化学物质具有较短的寿命，因为通过与大气中的氧气o2结合，它们很快变成惰性的。[0025]例如用次氯酸盐：[0026][0027]惰化反应如上。[0028]如果没有待还原的生物结构，则会很快发生以上反应，因此必须重复各种能力的消毒过程，包括重复喷洒各种类型的表面。同样，任何需要高密度人群的活动都有可能发生区域传染，如果它有用于空气分配的液压系统，系统中的设备必须每小时输送数千立方米的处理量，则必须再次进行系统的和全身的消毒。技术实现要素：[0029]本发明的主题是用于抵抗病原微生物(例如革兰氏阳性、支原体、植原体、显微真菌)和病毒例如sars-cov-2(冠状病毒科)攻击和增殖的生物方法。[0030]事实上，本发明的主题是一种合成蛋白，其使用编码衍生自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制剂和来自莲花(nelumbonucifera)5e9u_a的糖基转移酶(gtf1还原酶)活性亚基的基因序列制备，由于其酶活性，这种合成蛋白已经令人惊讶地被证明能够通过在细菌/病毒糖苷表面产生粘附现象来增强还原效果。[0031]因此，本发明的主题是由具有seqidno3的序列编码和具有seqidno4的氨基酸序列的合成融合蛋白。[0032]seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列。[0033]本发明还涉及具有seqid4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的序列的蛋白。[0034]本发明还涉及由具有seqidno3的序列编码和具有seqidno4序列的合成融合蛋白，其用于医学领域。[0035]特别是在医学、兽医学或化妆品领域中，单独使用或作为抗病毒抗真菌抗细菌制剂的基础，或用于对抗支原体感染和植原体感染，通过气雾剂用于局部、皮肤或粘膜使用。作为漱口水、牙膏和护肤霜的成分。[0036]本发明还涉及生产和纯化合成融合蛋白的方法，该融合蛋白由具有seqidno3的序列编码和具有seqidno4序列。[0037]所述方法包括以下基本步骤：[0038]i.在包含选择标记物的表达载体中，插入包含以下至少一项的核酸：seqidno3的序列、与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列和与seqidno.3具有至少95％同一性的序列；[0039]ii.使用所述载体转化适于使用所述载体的感受态细胞；[0040]iii.筛选用所述载体转化的感受态细胞，并在培养物中繁殖它们；[0041]iv.对第iii点中的感受态细胞进行裂解；[0042]v.从第iv点获得的裂解物中筛选并纯化根据本发明的蛋白。[0043]本发明还涉及由具有seqidno3的序列编码的且具有seqidno4序列的合成融合蛋白，用于治疗植物物种的感染，优选用于农业和植物药物；根据本发明的蛋白可以用于相同的目的，既可以直接使用，也可以通过农杆菌(a.tumefaciens)渗入技术使用。[0044]本发明还涉及用于处理植物病原体，优选植物体和真菌的方法，其中所述方法包括在植物或其部分上施用根据本发明的蛋白或施用包含根据本发明的蛋白的组合物。[0045]由具有seqidno3的序列编码的且具有seqidno4序列的合成融合蛋白用于处理环境和表面的用途也是本发明的一个目的。本发明的合成融合蛋白可用于制备消毒剂溶液，该消毒剂溶液可用于临床、医院和家庭领域，用于繁忙交通环境，用于进气和排气系统或空调或atu的过滤器，用于食物制备的环境。[0046]一般地，在所有必需采取抗微生物预防的区域。[0047]本发明还涉及用于控制或消除环境或表面的病毒、革兰氏阳性细菌、支原体、植原体、微小孢子和卵孢子真菌，优选金黄色葡萄球菌和sars-cov-2的方法，其中所述方法包括在表面或其部分上施用根据本发明的蛋白或施用包含根据本发明的蛋白的组合物。[0048]本发明还涉及用于破坏包括在病毒、革兰氏阳性细菌、支原体和微小孢子和卵孢子真菌中的糖蛋白的方法。[0049]本发明还涉及包含不同浓度的所述蛋白的组合物，所述蛋白构成可用于人类和动物环境消毒的各种领域的抗微生物溶液，作为用于局部、皮肤或鼻粘液用途的抗细菌/抗真菌制剂的基础。[0050]根据本发明的详细描述，进一步的目的和优点将变得显而易见。附图说明[0051]图1：根据本发明的表达载体的实施方案。椭圆形突出显示的是编码用于插入目标pgip-gtf1的序列的酶的限制性位点。特别地，描述了在毕赤酵母(pichiapastoris)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)中表达的载体。[0052]图2：来自莲花(nelumbonucifera)的gtf1的结构。突出显示选择并插入融合蛋白的亚基。[0053]图3：图a：gelsdspage显示了在纯化柱上分离后纯化的蛋白的存在。[0054]图b：免疫转移印迹抗his-标签突出显示了正确克隆的融合蛋白的存在和水平。通过免疫印迹技术检测，突出显示的条带表明存在组氨酸尾与pgip+gtf1融合复合物结合。[0055]对于两图：1蛋白电泳分子量标准(marker)-2对照+白蛋白-3电泳缓冲液阴性对照-4超声处理的细胞沉淀物-5用his标签柱纯化的测试样品-6蛋白电泳分子量标准。[0056]图4：pgip+gtf1杀菌/杀病毒效力水平，表明在48和72小时的距离下在显微镜下观察到的效果；[0057]图a：在光学显微镜下观察到与融合蛋白接触48h后不存在金黄色葡萄球菌细菌，与蛋白和生物结构接触时释放过氧化物气泡；[0058]图b：在光学显微镜下观察到在72h因生物识别效应和h2o2释放而裂解的生物结构；[0059]图c：在时间为0时的金黄色葡萄球菌培养物的光学显微镜视图。[0060]图5：免疫印迹试验，检测与pgip+gtf1ad接触1h、24h、48h后，与pgip+gtf1接触后的sarscov2的刺突蛋白。[0061]图a：不含蛋白酶抑制剂，[0062]图b：含有蛋白酶抑制剂，[0063]对于两图：m蛋白电泳分子量标准(marker)-1sarscov2刺突蛋白-2缓冲液-316μlseqid4的蛋白-410μlseqid4的pgip/gtf1蛋白-5缓冲液-6sars-cov2刺突蛋白-7sars-cov2刺突蛋白+来自seqid4的pgip/gtf1蛋白-8sars-cov2刺突蛋白-9sars-cov2刺突蛋白+seqid.4的pgip/gtf1蛋白，10sars-cov2刺突蛋白，11sars-cov2刺突蛋白+seqid4的pgip/gtf1蛋白。[0064]图6：a、b、c、d图显示了农杆菌粘附(agro-adhesion)实验，其中将根据本发明的纯化的分子量为62kda重量的pgip/gtf1蛋白喷洒(4ml，含有400μg混合有0.0005％非离子型叶面粘合剂)在已经被葡萄生单轴霉(viticulturalplasmopara)污染的葡萄(vitisvinifera)叶的表面上，分别为：[0065]图a：0时，[0066]图b：接触后10小时，[0067]图c：接触后24小时，[0068]图d：接触后48小时。[0069]图7：根据本发明的pgip/gtf1融合蛋白的结构。[0070]图8：曲霉(aspergillus)，与400μg粗提取物接触，图8a为接触48h后，图8b为接触72h后，与对照图8c相比。[0071]图9：pri201an的载体图，突出显示了两个多克隆位点mcs1和mcs2。由于cam35s病毒启动子和noster终止子的存在，这种类型的载体允许相同的pgip+gtf1基因的双重超表达。[0072]图10：a.叶片组织上的灰霉菌(b.cinerea)感染。b.通过用载体pri201an修饰的农杆菌渗入10h后阻断感染的效果，农杆菌在损伤处传播，开始合成pgip+gtf1。[0073]图11：经受细胞毒性试验的细胞培养物在72小时时的条件下的光学显微镜照片，图a：人卵巢癌的a2780细胞，图b：双相性间皮瘤的msto-211h细胞。对于两组的实验：对照(包含完全培养基)-对照+缓冲液-1nm蛋白溶液-2.5nm蛋白溶液-5nm蛋白溶液-10nm蛋白溶液-20nm蛋白溶液。具体实施方式[0074]本发明涉及合成融合蛋白，称为pgip+gtf1或pgip/gtf1，其由具有seqidno3的序列编码和具有seq.idno.4的氨基酸序列，使用下列编码基因序列进行：[0075]-衍生自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制剂，以及[0076]-来自莲花(nelumbonucifera)5e9u_a的糖基转移酶(gtf1还原酶)的活性亚基，由于其酶活性，该合成融合蛋白通过在细菌/病毒糖苷表面上产生粘附现象而令人惊讶地能够增强还原作用。[0077]因此，本发明的目的是用于抵抗病毒、革兰氏阳性细菌、支原体、微小孢子和卵孢子真菌攻击和增殖的生物方法。在几次配对研究后选择基因序列，比较并根据其内在特征进行选择；特别地，根据wo2019/077477中描述的内容选择pgip序列，并且发明人根据其高酶活性选择gtf1亚基。[0078]文献显示，根据本发明选择的gtf1糖基转移酶(还原酶)的亚基也能够识别属于革兰氏阳性菌的分泌复合物seca复合物的细菌蛋白(currenttopicsinmicrobiologyandimmunologychapt.proteinandsugarexportandassemblyingrampositivebacteriaed.springerpag45-67)，由于该亚基的识别作用以及结合至该seca复合体，并通过对其粘附的上述糖蛋白复合体进行裂解作用，所以该亚基的存在提高了整个融合蛋白复合体的效率。[0079]seqidno.1：来自葡萄(vitisvinifera)的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白pgip的序列。[0080][0081]seqidno.2：来自莲花(nelumbonucifera)的颗粒结合淀粉合酶的pgip序列。[0082][0083][0084]seqidno.3：根据本发明的pgip+gtf1融合蛋白的核苷酸序列。[0085][0086]seqidno.4：根据本发明的融合蛋白的氨基酸序列。[0087][0088]根据本发明的序列在任何情况下都报道在所附的序列表中。[0089]因此，seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列。[0090]本发明还涉及具有seqid4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的序列的蛋白。[0091]本发明还涉及由具有seqidno3的序列编码的且具有seqidno4的氨基酸序列的合成融合蛋白。[0092]本发明还涉及用于生产和纯化根据本发明的合成融合蛋白的方法。[0093]所述方法包括以下基本步骤：[0094]i.在包含选择标记物的表达载体中，插入包含以下至少一项核酸：seqidno3的序列、与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列和与seqidno.3具有至少95％同一性的序列；[0095]ii.使用所述载体转化适于使用所述载体的感受态细胞；[0096]iii.筛选用所述载体转化的感受态细胞，并在培养物中繁殖它们；[0097]iv.对第iii点中的感受态细胞进行裂解；[0098]v.从第iv点中获得的裂解物中筛选并纯化根据本发明的蛋白。[0099]在一个实施方案中，为了获得表达并能够纯化根据本发明的蛋白，将具有seqidno.3的序列克隆至在细菌或酵母中表达的载体中。[0100]适用于使用的根据本发明的载体是本领域技术人员已知的，在优选实施方案中，优选使用pbe-sdna，其次是载体pgapza-a(分别由takara和thermofisher出售)。[0101]本领域技术人员已知的各种启动子可用于启动根据本发明的序列的转录。在优选的实施方案中，使用枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达系统(takara)。[0102]可以在适用于该目的并且为本领域技术人员所知的各种细菌和酵母中产生根据本发明的蛋白，在优选的实施方案中，在枯草芽孢杆菌或毕赤酵母中产生根据本发明的蛋白(creggetal.,1985；creggetal,1989，clareetal，1991a；clareetal.，1991b；romanosetal，1991)，并且在蛋白的转录过程中，蛋白的糖基化导致其天然形式或高度糖基化，这增加了其代谢能力。在毕赤酵母中，该蛋白翻译后在5个位点处高度糖基化，其分子量从62kda至200kda不等。在枯草芽孢杆菌中，高度糖基化使蛋白的重量达到120kda。这种高度糖基化可以在纯化过程中被去除。在一个实施方案中，例如使用枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达系统(takara)，为了便于其纯化，标签序列为6个组氨酸残基(his-标签)。然而，本领域技术人员已知的其它类型的标签也适用于根据本发明的目的。为了获得根据本发明的蛋白，应用的方法如下：[0103]1)来自葡萄(vitisvinifera)和莲花(nelumbonucifera)中rna提取物；[0104]2)用于扩增seqidno1和seqidno2的基因部分的rt-pcr，优选使用包含由限制性酶识别的序列的修饰引物进行(gibson方法)，以便为随后的消化提供扩增的所需序列；[0105]3)扩增后，对pcr产物进行纯化，首先进行消化以连接两个片段，随后进行连接酶反应，目的是获得包含序列idno3的片段。[0106]4)将在点3)中获得的连接酶产物纯化后，通过插入至载体进行第二次消化，所述载体优选为pbe-sdna，其次是载体pgapza-a，明确选择这些载体是因为其仅在细菌和酵母中具有非蛋白酶超表达的能力。[0107]5)将包含seqidno3序列的载体用于转化适于此目的的感受态细胞。感受态细胞优选毕赤酵母或枯草芽孢杆菌。转化优选通过电穿孔进行，因为不排除化学转化。[0108]6)选择转化的细胞，优选用抗生素，并在本领域技术人员已知的合适培养基中增殖。lb/ypd优选分别用于枯草芽孢杆菌和毕赤酵母。[0109]7)在根据微生物选择的足够的培养时间后，优选24h-48h，裂解细胞以提取总蛋白，并优选在亲和柱上继续纯化目标蛋白。[0110]可选地，将从纯化步骤获得的产物进行脂质包封，优选磷脂包封，以促进其扩散和防止自氧化，从而延长在表面上的停留时间，并有利于与微生物结构的亲和力。[0111]可选地，将从纯化步骤或从包封步骤获得的产物进行冷冻干燥。在本发明的上下文中，未加工的或粗的提取物是指已经经受离心和超声处理但没有经受亲和柱纯化的细胞裂解物。[0112]在一个实施方案中，毕赤酵母和枯草芽孢杆菌的工程化通过电穿孔或通过转化能够接收质粒的细菌来实现(化学方法)。[0113]在一个实施方案中，将pgip+gtf1的编码序列克隆在具有根据本发明的质粒表达结构的5’‑3’“读框(inframe)”中。[0114]在可选的实施方案中，将在点3)获得的连接产物插入适用于农杆菌的载体中，该载体随后用于电穿孔；优选地，载体是载体pri-201an(takara)，其具有两个多克隆位点，因此为载体提供了双重表达pgip-gtf1的能力，并且纯化后的载体在非致瘤细菌农杆菌lb4404(takara)中进行电穿孔。[0115]为了证实根据本发明蛋白的正确生产，用包含seqidno.3表达盒的载体转化感受态细菌，能够制备根据本发明的蛋白且被6个组氨酸标签标记，转化后的细菌在足够的培养时间后裂解。在通过在冰上以》20kh的频率超声处理5min进行机械裂解之后，将裂解物传递至至多100mm的咪唑梯度纯化柱中，以在第一次洗脱后分离蛋白复合物。[0116]将不同的样品在sd-page凝胶上电泳。在图3中，尤其可以观察到超声处理的细胞的上清液、浓度为100μg/μl的超声处理的细胞沉淀物(或粗提取物)(泳道4)与阳性对照白蛋白(泳道2，具有能用5μg/μl的抗his-标签抗体检测的特性)以及与纯化的白蛋白(泳道5)的电泳情况。在电泳结束时，对凝胶进行蛋白印迹以将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。将膜与抗his-标签一级抗体和用过氧化物酶标记的二级抗体一起孵育，用于检测ecl中的蛋白。在图3a(有色凝胶)中，可以观察到泳道5中存在条带，其突出显示了分子量为62kda的确定和过表达的纯化物(pgip/gtf1的非糖基化形式)的存在。在图3b中，免疫印迹显示在泳道4(未经纯化的超声处理的细胞沉淀物)中存在重量为200kd的过表达的高度糖基化蛋白；在泳道5b中检测到非糖基化形式的63kda的纯化蛋白。[0117]该实验证明了融合蛋白的存在，并被很好地表征，并且从现在起可以使用。为了验证根据本发明的蛋白在对抗或破坏上述微生物中的功效，设置了各种实验，其中在各种纯化和未纯化的条件下，将蛋白与代表性的细菌、真菌、植原体接触，以及与sarscov-2产生的刺突蛋白接触。[0118]金黄色葡萄球菌[0119]图4显示了将浓度为1μg的粗提取物加入至浓度为1000bact/ml的金黄色葡萄球菌亚种(atcc6538p)的细菌培养物中，在48和72小时观察到可能的生物杀灭效果的实验。[0120]这个实验的目的是观察可能的抗菌效果。从图4所示的照片中可以看出，与初始培养物相比(在图c中以t0表示)，观察到细菌体的逐渐破坏，产生了由h++和o22-产生的微小气泡。特别地，图4a显示了金黄色葡萄球菌凝固酶阳性培养物与蛋白粗提取物接触48小时后的光学显微镜照片，图4b展示了接触72h后相同培养物的照片。[0121]可以看出，微生物的浓度降低了80％，并且观察到由裂解反应产生的气泡增加。因此，由于pgip+gtf1的还原作用，平板表面完全没有或几乎没有革兰氏阳性细菌。[0122]曲霉菌[0123]图8显示了将粗提取物加入曲霉菌(attc16404)的培养物中，在接触72小时后观察到可能的杀真菌效果的实验。图8c显示了在时间为0时带有菌丝的微观蘑菇的照片。图8a显示了与粗提取物接触72h后整个菌丝的裂解效果，照片8b显示了相对的放大图。实验证明未纯化的融合蛋白具有杀真菌作用。[0124]sars-cov2[0125]为了验证根据本发明的蛋白在抗病毒中的有效性，设置了实验(图5)，其中将根据本发明的蛋白与sars-cov2生产的刺突蛋白接触。[0126]根据本发明的蛋白用或不用pmsf和e-64蛋白酶抑制剂(分别为丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶)进行纯化、提取；添加10mm的mgcl2(镁作为共酶活化剂起作用)的两种提取物与sars-cov2刺突蛋白混合物(abcam)以5:1的比例接触；根据本发明的蛋白以1μg/μl的最终浓度存在。[0127]在1、24、48小时后观察这种接触的结果，并观察相关效果。[0128]在图5a和5b中，显示了在sds-page中凝胶电泳后进行的蛋白印迹。将膜与抗刺突抗体一起孵育。图5a显示了不使用蛋白酶抑制剂进行的实验结果，图5b显示了使用蛋白酶抑制剂进行的实验结果。[0129]在泳道6至11中，可以观察到不同接触时间的实验进程。在图5a中，在由箭头指示的最后一个泳道(11)中，注意到相对于相应的对照(10)在48h的t处没有刺突。另一方面，在图5b中，重复了相同的实验，但是使用蛋白酶抑制剂，可以观察到刺突蛋白的量减少。[0130]箭头表示在1h、24h和48h时条带强度已经降低。该实验表明，62kda非糖基化形式的纯化蛋白具有显著的抗病毒特性。[0131]该实验的结果证明了在1h时开始的蛋白裂解对covid-19刺突的温和作用，证明了该蛋白在1μg/μl的浓度下已经具有杀病毒活性。[0132]细胞毒性实验[0133]为了理解这种融合蛋白的生物学用途是否可能不会对人细胞的产生损伤，进行了生物相容性试验以验证根据本发明的蛋白的可能细胞毒性并理解最佳使用浓度。[0134]两种细胞系被用于此：人卵巢癌细胞系a2780和肺间皮细胞系msto-211h。将各培养基中的细胞保存在37℃潮湿空气中的培养箱中，使用无菌层流罩操作，并在平板中孵育细胞48和72小时。[0135]评估了两种溶液的细胞毒性：[0136]a)含有不同标量浓度的融合蛋白的溶液(储备溶液的浓度等于1.9nm)，和[0137]b)仅含有融合蛋白溶液缓冲剂的溶液。[0138]将25,000-30,000个细胞/孔(用于72h测定)或50,000个细胞/孔(用于48h测定)与5种不同的蛋白浓度(从1nm到20nm)接触，以获得数据的高斯分布。决定使用永生化细胞系，因为它们更稳定，因此反应更灵敏，并且不会发生源自皮肤的细胞系所发生的细胞衰变。[0139]如果在该实验中采用了非永生化细胞系，正常的细胞衰变将导致错误的计数，这将不得不通过反对数因子来补偿，并且与稳定的细胞系相比，这将导致错误的计算。[0140]由于本实验中所用的纯化蛋白来自imac纯化柱(10至100mm的咪唑梯度)上的纯化过程，以及来自异硫氰酸胍中的后续变性步骤，为了表征其性质，该蛋白已经通过透析盒在两种不同渗透压下用纯化缓冲液进行了纯化过程，所述两种不同渗透压由两种不同的内部/外部渗透压产生，这种内部/外部浓度差导致通过纯化从融合蛋白的位点提取盐。该溶液也用作对照，以获得考虑透析垫的测试结果。获得的结果计算为相对于对照条件的存活率百分比(对于20nm条件，存活率还根据对照+缓冲液的条件计算，并以*表示)，在下表中示出：[0141]表1：[0142][0143]*相对于对照+缓冲液的条件(视为100％)计算的值[0144]表2：[0145][0146][0147]*相对于对照+缓冲液的条件(视为100％)计算的值[0148]这些实验的结果也显示在图11中，其中可以观察到两种细胞系，特别是图a为a2780和图b为msto-211h，使用的不同蛋白浓度在72h时的细胞活力。[0149]对于表1中获得的结果(a2780)，该实验考虑了在两种不同的永生化细胞系上计算的50％的截止值。已经表明，除去缓冲液引起的截止值，a2780细胞系的平均存活率表明，在5nm的蛋白浓度下，在48h和72h之间，平均细胞存活率只有8％的差异。而在10nm的浓度下，平均存活率增加了8％。证明在5nm和10nm之间的浓度下，除去截止值，蛋白的毒性与细胞相容。[0150]在msto211h细胞系中，注意到在5和10nm的浓度下存在趋势逆转，其中在48h存活率增加19％，而在72h存活率正常化。在这种情况下，两种蛋白浓度对该细胞系是无毒的，见表2(msto211h)。[0151]在表1、2中，在最大浓度20nm下显示了最大毒性，它们通过与50％截止值进行比较来补偿，其中在表2中，注意到死亡率为11％，通过50％截止值进行补偿，细胞存活率维持在89％。[0152]在表1中，同样，在20nm的浓度下，同样有11％的减少，该数据总是参照对照细胞对照+缓冲液的截止值进行补偿。[0153]因此可以得出结论，根据本发明的融合蛋白在体外对人细胞培养物不显示出相关的细胞毒性作用。[0154]农杆菌粘附和对支原体/植原体和寄生真菌的作用[0155]支原体是一类完全没有细胞壁的微生物。由于这一特性，它们对青霉素和所有作用于细胞壁生物合成过程的抗生素(例如头孢菌素)完全免疫。它们的细胞膜也发生了进化，以弥补肽聚糖壁的缺乏：事实上，它的组成非常特殊，与其它微生物的组成不同；首先，它富含甾醇(在细菌物种中是独一无二的)，这使它们能够保持细胞体积不变，并抵抗水分胁迫。支原体可对人类、动物和植物致病；植物的病原支原体通常被植物学家和农学家分成两大类，不考虑物种：螺原体(螺旋形，可体外培养)和植原体(形状可变，完全专性寄生，不可体外培养)；这两类在任何情况下都是柔膜菌纲(mollicutes)，因此具有上面列出的所有特征，以及其它一些典型的特征。[0156]为了验证pigp+gtf1蛋白在对抗支原体感染或侵染中的有效性，将如上定义的含有pgip+1gtf1蛋白的赤酵母粗提取物和非离子增粘剂(浓度为0.005％-0.0025％的聚1-对薄荷烯(poly-1-pmenthene)、乙醇酸提取物、异癸醇乙氧基化物)的混合物直接施用于叶子上。具体地，使用稀释度为0.005％的七甲基三硅氧烷改性的聚环氧烷；所述载体在本文被证明对于将以垂直方向散播的分子锚定植物表面上是令人惊讶地有效的。[0157]图6abcd中显示的照片描述了对葡萄(vitisvinifera)叶上霜霉病(葡萄霜霉病)感染的阻断效用，通过用上述浓度的叶面粘合剂浸泡不同时间，允许进行处理，蛋白繁殖。该试验的目的不仅证明了该蛋白在农业中的有效性，还证明了其对支原体感染，特别是葡萄霜霉病菌的作用。[0158]在图6中，事实上可以观察到pgip+gtf1在叶片上粘附的渐进效用。在图a中，可以在时间0时观察到叶子。与根据本发明的蛋白的接触使得在10小时内取消葡萄霜霉病菌在叶表面的扩散和生长(在图6b中可观察到)；随着时间的推移，可以在24小时(图c)和48小时后(图d)观察到其巩固的阻断效用。该实验证明了在单次处理后，pgip+gtf1复合物的抗害虫作用的渐进有效性。[0159]该实验证明了植原体(与支原体完全相似的微生物)在接触几个小时后如何被有效阻断。[0160]因此，根据本发明的蛋白已被证实具有抗微生物功效，即，它能够抑制细菌、真菌、病毒、支原体和植原体的生长。在另一个实施方案中，农杆菌悬浮液在叶细胞间隙中的农杆菌渗入的方法是通过喷雾或使用不带针头的注射器进行的；事实上，已经证明用这种方法可以获得高水平的瞬时基因表达(santos-rosaetal.2008；zottinietal.，2008；bertazzonetal.2011.)。特别地，将根据本发明的seqidno3的片段插入适用于农杆菌的载体中，该载体随后用于电穿孔；优选地，载体是载体pri-201an(takara)，其具有两个多克隆位点，因此为载体提供了双重表达pgip-gtf1的能力，纯化后的载体在非致瘤细菌根癌农杆菌lb4404(takara)中进行电穿孔。将由此获得的农杆菌随后直接用于叶组织，优选将稀释的产品(400μg)与浓度为0.0005％的非离子胶溶液一起制成悬浮液，并喷洒在叶上。在图10a中，我们看到被灰霉菌(一种核盘菌科的真菌)感染的叶子，在时间为0时刚刚被农杆菌渗入，在图10b中，在农业渗透10h后阻断感染的效果。在最后这张照片中，我们可以看到感染是如何被迅速阻断和限制的。[0161]因此，本发明的目的是一种组合物，其包含：用表达载体转化的农杆菌，所述表达载体包含具有seqidno3的序列或与seqidno.3具有至少90％序列同一性的序列或与seqidno.3具有至少95％同一性的序列的核酸；以及至少一种非离子增粘剂或胶，优选浓度为0.0005％。[0162]因此，根据本发明的蛋白可以被定义为抗细菌剂、抗真菌剂、抗病毒剂和消毒剂。[0163]更具体地，本发明因此涉及根据本发明的蛋白在用于各种领域的抗微生物制剂中的用途。[0164]医学和兽医领域[0165]特别地，考虑到其在细胞毒性实验中证明的安全性，本发明的目的是用于医学领域的具有seqidno.4的氨基酸序列的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白。本发明的另一个目的是所述蛋白用作由其抗微生物功能，即抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗真菌定义的药物产品。根据本发明的蛋白可用于配制成液体形式的组合物中，作为霜剂或洗剂或作为凝胶或喷雾剂用于动物和人的局部应用。局部应用包括在皮肤和粘膜上的应用。这些载体也可以是用于药物和化妆品领域的那些载体。佐剂和载体是化妆品和药学上可接受的佐剂和载体，以及用于植物药物领域的佐剂和载体。[0166]载体包括脂质载体，优选单层和多层脂质体；在优选的实施方案中，根据本发明的蛋白实际上被包装或包封在所述结构中，以允许更有效地递送至治疗位点，更好地扩散和防止自氧化，从而延长在表面上的停留时间，并促进与微生物结构的亲和力。[0167]根据本发明的蛋白优选通过局部、皮肤和/或口咽-鼻腔施用，并且可以配制成喷雾剂、用于吸入的气雾剂、凝胶剂、霜剂和洗剂。因此，本发明的目的是包含具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白的组合物；可选地，所述组合物包含盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、药学上可接受的赋形剂、载体、增稠剂和胶凝剂中的至少一种。在优选的实施方案中，根据本发明的组合物进一步包含纤维素，优选甲基纤维素。包含根据本发明的蛋白的组合物也可以配制成喷雾、半液体、霜状、半固体或固体形式、霜剂、悬浮液、乳液或肥皂。[0168]根据本发明的组合物也可以由表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白的微生物裂解物组成。[0169]环境消毒剂[0170]附图中所示的体外实验结果表明，根据本发明的蛋白对各种微生物，特别是革兰氏阳性菌、真菌、支原体和病毒具有显著的抗微生物活性。[0171]因此，具有seqid4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白可在人类、动物和植物领域中用作环境消毒剂和抗微生物剂。根据本发明的蛋白可以单独使用或者包含在进一步包含本领域技术人员已知的载体的组合物中，并且可以通过喷雾施用、配制成凝胶中或者施用在溶液中。因此，包含根据本发明的蛋白的组合物可以配制成喷雾、半液体、半固体、固体、悬浮液或凝胶形式，以应用于待处理的表面。该应用也可以是喷雾。这种组合物也可以在各种区域的消毒领域中用作抗微生物功能基料，例如在诊所、医院和家庭领域中，在繁忙交通环境中，在进气和排气系统或空调或atu处理装置的过滤器中，在用于食物制备的环境中。总之，在所有必需采用抗微生物预防的区域。作为非限制性实例，包含根据本发明的蛋白的组合物可以在家用卫生产品中用作消毒剂；用于皮肤消毒剂、肥皂等。例如，用于完整皮肤的消毒，例如用于在手术前阶段的手部消毒；用于在医院病房，防止院内交叉感染的传播；用于消毒剂或社区卫生产品中(例如酒店、机场、学校、医生诊所或牙科诊所)；用于外科手术器械的消毒。[0172]包含根据本发明的蛋白的组合物可以进一步包含至少一种盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、纤维素和甲基纤维素、胶凝剂(优选甲基环氧乙烷(methylorixane)或海藻酸盐，例如海藻酸钙或海藻酸钠)。因此，本发明的目的是用于控制或消除环境或表面的病毒、革兰氏阳性细菌、支原体、植原体、微小孢子和卵孢子真菌，优选金黄色葡萄球菌和sars-cov-2的方法，其中该方法包括在表面或其部分上施用以下项中的至少一种：赤酵母或枯草芽孢杆菌的微生物裂解物，该微生物表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白-具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白-包含所述蛋白的组合物。根据所进行的测试，根据本发明的蛋白在环境温度t下在表面上耐受48-72h。[0173]农业科技(agritech)[0174]附图中所示的体外实验结果表明，根据本发明的蛋白对各种微生物，特别是革兰氏阳性菌、真菌、支原体和病毒具有显著的抗微生物活性。特别地，经过在植物病原微生物的对比，已经发现根据本发明的蛋白具有相当大的活性。因此，本发明的主题是具有seqid4的氨基酸序列和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的氨基酸序列的合成融合蛋白用于治疗植物物种中的感染，优选在农业和植物药学领域中；根据本发明的蛋白可以用于同样的目的，既可以直接使用也可以通过农杆菌渗入技术使用。[0175]该蛋白可用于液体形式或冻干形式的配制组合物中。[0176]该应用可以用组合物来进行，该组合物包括通常用于植物应用的载体。[0177]在一个实施方案中，优选使用非离子胶，其具有浸渍植物叶组织以允许某些杀虫剂渗透的功能，在这种情况下，其已用于使表达pgip+gtf1蛋白的毕赤酵母粗提取物和蛋白本身均能扎根于叶。佐剂和载体是药学上可接受的，正如在植物药物领域中使用的佐剂和载体一样。[0178]载体包括单层和多层脂质体。包含根据本发明的蛋白的组合物也可以配制成液体、半液体或凝胶形式，以施用于待处理的植物。该应用也可以是喷雾。在一个实施方案中，根据本发明的蛋白包含在组合物中，该组合物还包含浓度范围为0.0005％至0.00025％的非离子增粘剂。在非离子增粘剂中，优选聚-1-对薄荷烯、乙醇酸提取物、异癸醇乙氧基化物，甚至更优选地是浓度优选为0.0005％的七甲基三硅氧烷改性的聚环氧烷。[0179]包含根据本发明的蛋白的组合物可以进一步包含以下至少一种：盐缓冲液(优选pbs)、蛋白酶抑制剂、mgcl2、纤维素和甲基纤维素、胶凝剂(优选甲基环氧乙烷或海藻酸盐，例如海藻酸钙或海藻酸钠)。根据本发明的组合物还可以由微生物的裂解物组成，该微生物表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白。因此，包含根据本发明的蛋白的组合物可以在农业领域中使用，其具有抗微生物功能，并且用于治疗栽培植物或园艺植物的疾病。因此，本发明的目的是用于治疗植物病原体的方法，其中所述方法包括在植物或其部分上施用以下项中的至少一种-微生物毕赤酵母或枯草芽孢杆菌的裂解物，该微生物表达具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白-具有seqidno4的蛋白和/或与seqidno.4具有90％，更优选95％序列同一性的蛋白-包含所述蛋白的组合物。根据所进行的测试，根据本发明的蛋白在环境温度t下在表面上耐受48-72h。在替代实施方案中，根据本发明的蛋白可用于农杆菌的感染技术。因此，本发明的目的是用于治疗植物病原体的方法，其中所述方法包括在所述植物中通过农杆菌渗入法引入表达载体，该表达载体包包含seqidno.3的核苷酸序列和/或与seqidno.3具有至少90％，更优选95％序列同一性的序列。提供以下实施例的唯一目的是说明本发明，而决不认为是限制本发明的范围。[0180]方案和实施例：[0181]pbe-sdna和pgapzalphaapr1201-an载体的克隆：[0182]1)轻轻混合新鲜的感受态细胞，并转移100μl至聚丙烯管中。[0183]2)向100μl的pr101-an细胞中加入≤10ng的量。[0184]3)在冰浴中孵育30’。[0185]4)在+42℃下孵育43”。[0186]5)放返冰浴1-2’。[0187]6)加入soc培养基至最终体积为1ml，在+37℃预孵育。[0188]7)在+37℃下以160-225rpm的速度摇动孵育1小时。[0189]9)涂布在选择性培养基的平板上，对于每个9cm直径的平板，通常少于100μl。[0190]10)在+37℃孵育过夜。[0191]11)通过在lb平板中+37℃孵育过夜来选择克隆并进行扩增，lb平板具有选择性抗生素，质粒具有卡那霉素/氨苄青霉素的特异性抗性。[0192]克隆后质粒的纯化(初级和次级)[0193]液体离心后，在250μl裂解溶液和350μl中和溶液混合后，将250μl重悬溶液加入细胞沉淀物中，然后以14,000rpm离心5min。随后，将内容物置于纯化柱中，并以14,000rpm离心1min。弃去洗脱液后，分两次加入500μl的“清洗溶液”。[0194]弃去洗脱液后，将50μl“洗脱缓冲液”放入柱中，在分光光度计上计算质粒纯度的浓度，将其保存在20℃。[0195]pbe-s质粒dnapgapzalphaa的酶切[0196]酶消化和线性化的多重反应。[0197]在20μl的最终体积中，混合：[0198]缓冲液10pgip+gtf12μlpbe-sdna/pgapzalphaada，用量范围为0.2至1μg；[0199]限制性酶，如下所示：[0200]1μlkpni，[0201]1μlxbai，[0202]无核酸酶水qb，[0203]反应按照本领域专家已知的方案进行。[0204]pr201-an中的酶切和线性化[0205]酶消化和线性化的多重反应，[0206]在20μl的最终体积中，混合：[0207]缓冲液10pgip+gtf12μldnaprpbe-sdna/pgapzalphaada，用量范围为0.2至1μg，[0208]限制性酶，如下所示：[0209]1μlxbai，[0210]1μlndei，[0211]无核酸酶水qb。[0212]产物的连接[0213]在20μl的最终体积中，混合以下物质：[0214]如上线性化的pgip+gtf1复合物基因的dna，插入的dna量为10至100ng，与所用的dnadel载体相比，摩尔比为过量的3:1，所有物质在室温下放置1小时。[0215]可选方法：使用“infusionhdcloning”(takara)mastermix试剂盒，将15μl的daligare产品插入，pgip+gtf1与载体的比例始终为3:1，加入无核酸酶水至最终体积为20μl。所有物质在+50℃保持15min。所有物质整体插入大肠杆菌stellarodh5α细胞中进行再克隆。[0216]质粒纯化[0217]1)向细胞沉淀物中加入250μl重悬溶液(jet质粒赛默飞世尔基因(jetplasmidthermofishergene))。[0218]2)250μl裂解溶液，[0219]3)350μl中和溶液，，[0220]4)以14,000rpm离心5’min，[0221]5)回收上清液，并在纯化柱中加入500μl上清液，[0222]6)以14,000rpm离心5’min，[0223]7)将500μl洗涤缓冲液加入以洗涤柱，并以14,000rpm离心1min，重复两次[0224]8)加入50μl重悬液，并以14,000rpm离心2min。纯化的质粒保存在-20℃。[0225]枯草芽孢杆菌/毕赤酵母、农杆菌的电穿孔[0226]1.将含有pigp+gtf1感受态细胞和电感受态枯草芽孢杆菌/毕赤酵母的1.5ml试管置于冰上。对于毕赤酵母，在电穿孔后，质粒pgapzalphaa用avrll在+37℃下放置15min进行线性化，体积为20μl。[0227]2.向20μl毕赤酵母、枯草芽孢杆菌和农杆菌的感受态细胞中加入6μl(1ng)二元载体质粒dna，轻轻混合。[0228]3.将0.1cm的电穿孔比色皿放在冰上。[0229]4.将genepulserii设置为25μf，200ω和2-2.5kv.*1。[0230]5.将步骤2中制备的细胞和dna转移至电穿孔和电穿孔比色皿中。[0231]6.从穿孔仪中取出比色皿，加入1ml的soc*2培养基，并转移至14ml圆底试管中。[0232]7.在30℃下以100rpm振荡孵育1小时。[0233]8.将50-100μl细胞涂布在含有50μg/ml卡那霉素/10μg博来霉素(取决于载体)*3的lb琼脂平板上，并在30℃下孵育48小时。[0234]9.在+30℃/+37℃(取决于载体)下，在含有卡那霉素/10μg博来霉素的液体lb中扩增菌落。[0235]免疫印迹[0236]为了验证pgip+gtf1蛋白的产生及其产生位点，在his-标签亲和柱上纯化后，对修饰细菌的细胞沉淀物进行超声处理，证明该蛋白存在于细胞内，测量其光谱-光度浓度，在纯化过程的洗脱过程中达到1μg/μl。his-tag阳性对照(例如白蛋白)和阴性对照，分别由10μl装载缓冲液和电泳缓冲液组成，分别加入10μl至孔n.2和孔3中。将粗提取物置于孔n.4中。孔n.5中纯化蛋白的浓度评估为1μg/μl。随后，通过电泳(图3a)和免疫印迹(图3b)进行表征。在与2μl装载缓冲液(4％sds，10％2-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125mtris-hclph6.8)混合后，将10μl提取物与阴性孔和阳性对照一起装载至5-10％丙烯酰胺梯度的预制凝胶(法玛西亚(pharmacia))的孔中，而电泳缓冲液由25mmtris、190mm甘氨酸、0.1％sds组成。电泳后，凝胶通过浸入染料溶液(625mm考马斯亮蓝；50％甲醇；10％乙酸)30min进行固定和着色。然后，在照相检测后(图3a)，用溶液(50％甲醇-10％乙酸，处理24h)对其进行脱色。蛋白印迹在电泳缓冲液中以恒定100v电泳70min，将其置于硝酸纤维素上经受380ma电流90min。为了证实电转移的结束，用丽春红染色液(ponceaus)(sigma)将膜染色，然后用双蒸水脱色直至红色完全消失。然后将膜置于100ml由1xpbs(ph7.2:80mmna2hpo4；20mmnah2po4x2h2o；100mmnacl；0.1％吐温20；8克奶粉)组成的饱和溶液中在4℃下孵育16-18小时。[0237]在用0.1xpbs和0.1％吐温20(sigma)洗涤后。在室温下，将印迹运行后得到的膜在含有5ml用pbs1:5000稀释的抗-histag小鼠单克隆初级抗体(ab-cam)的溶液中孵育1小时。然后再用5mlpbs-吐温20溶液洗涤6次，每次5min。并与另外5ml的1:10,000稀释的二级抗体(与过氧化物酶偶联的兔抗小鼠，sigma)在室温下孵育1小时。按照供应商公司的说明，用pbs-吐温20洗涤6次后，用ecl法(amersham)对抗体识别的蛋白进行可视化。该实验证实，在孔5中存在浓度为1μg/μl的分子量约为62kda的纯化蛋白。而在孔4中，鉴定到相同的分子量为200kda的高度糖基化的蛋白。[0238]平板接触金黄色葡萄球菌和粗提取物以及任何其它细菌，在冰上以》20kh的频率超声处理2min后，将细菌裂解物离心30秒。在1.5mleppendorf型管中，以14,000rpm离心10秒。根据bradford方法，根据595nm处的光谱读数报告粗提取物的浓度，获得400μg的浓度。随后，用1.5ml管以1400rpm离心2分钟后，随后将100μl上清液置于培养皿中，使其与先前在金黄色葡萄球菌凝固酶阳性的选择性培养基上培养的菌株反应，计算出粗提取物的最终浓度为100μg。pgip+gtf1和金黄色葡萄球菌在室温接触48h(图4a)和72h(图4b)，在显微镜下在载玻片上观察相对于接触时间为零时的结果(图4c)，其中细菌浓度有显著差异。[0239]刺突蛋白接触试验和相应的免疫印迹[0240]在imachis-标签柱上用10-200mm咪唑梯度纯化后，将即用型刺突蛋白(ab-cam)与纯化和分离的蛋白反应。根据bradford方法，根据在595nm处的光谱读数报告纯化蛋白的浓度，得到其浓度为1μg/μl。使用图3中表征的蛋白进行实验，实验以以下方式进行：将刺突蛋白与根据本发明的蛋白以1:5的比例配制成溶液。使该混合物反应1h、24h和48h。在与2μl装载缓冲液(4％sds，10％2-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125mtris-hclph6.8)混合后，将10μl体积的这些溶液装载至5-10％丙烯酰胺梯度的预制凝胶(法玛西亚)的孔中，而电泳缓冲液由25mmtris、190mm甘氨酸、0.1％sds组成。将凝胶通过浸入染料溶液(625mm考马斯亮蓝；50％甲醇；10％乙酸)30min进行固定和着色。然后，在照相检测后，用溶液(50％甲醇-10％乙酸)将其脱色。然后将凝胶在加入50％甲醇-10％乙酸的脱色溶液中放置24小时。脱色后，将样品以恒定100v电泳70min，将其置于电泳缓冲液中的硝酸纤维素经受380ma电流90’。为了验证电转移的结果，用丽春红染色液(sigma)将膜染色，然后用双蒸水脱色直至红色完全消失。然后将膜置于100ml由1×pbs(ph7.2：80mmna2hpo4；20mmnah2po4×2h2o；100mmnacl；0.1％吐温20；8克奶粉)组成的饱和溶液中，在4℃下孵育16-18小时。用0.1xpbs和0.1％吐温20(sigma)洗涤后，将膜与用pbs1:5000稀释的小鼠抗刺突标签一级单克隆抗体(ab-cam)在室温下孵育1小时。然后再次用pbs-吐温20溶液洗涤6次，每次5min，并与1:10,000稀释的二级抗体(与过氧化物酶偶联的兔抗小鼠，sigma)在室温下孵育1小时。按照供应商公司的说明，用pbs-吐温20洗涤6次后，用ecl法(amersham)对抗体识别的蛋白进行可视化。[0241]生物相容性实验[0242]使用的材料：[0243]在补充有10％胎牛血清(gibco)的rpmi-1640培养基(sigmaaldrichr6504)中培养a2780细胞(人卵巢癌)。在补充有2.38g/l羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、0.11g/l丙酮酸钠、2.5g/l葡萄糖和10％胎牛血清的rpmi-1640培养基(sigmaaldrichr6504)中培养msto-211h(双相性人类间皮瘤)细胞。[0244]将细胞保存在37℃湿润气氛中的培养箱中，并使用无菌层流罩进行操作。评估了两种溶液的细胞毒性：[0245]a)蛋白溶液(储备溶液的浓度等于1.9微摩尔)，和[0246]b)仅含有上述蛋白溶液的缓冲剂的溶液。[0247]实验方案：[0248]为了进行处理，在以下实验条件下，将细胞接种在p24胸平板的完全培养基中：[0249]》25,000-30,000个细胞/孔，用于72h的测定[0250]》50,000个细胞/孔，用于48h的测定。[0251]接种24小时后，除去耗尽的培养基，并根据以下方案处理细胞，一式两份：[0252]对照(含有完全培养基)；对照+缓冲液(含有完全培养基，添加了处理所用的最大体积的缓冲液，对应蛋白的最大浓度的条件，20nm)；1nm蛋白溶液(含有浓度为1nm的蛋白溶液的完全培养基)；2.5nm蛋白溶液(含有浓度为2.5nm的蛋白溶液的完全培养基)；5nm蛋白溶液(含有浓度为5nm的蛋白溶液的完全培养基)；10nm蛋白溶液(含有浓度为10nm的蛋白溶液的完全培养基)；20nm蛋白溶液(含有浓度为20nm的蛋白溶液的完全培养基)。在处理48小时和72小时后，除去培养基，使用含有10mm胰蛋白酶和0.3mmedta的磷酸盐缓冲液溶液分离细胞，并立即在光学显微镜下使用必要的台盼蓝染料(溶于磷酸盐缓冲液的0.1％(w/v)的溶液)进行计数。所得结果计算为相对于对照条件的存活率百分比(对于20nm条件，存活率的值也根据对照+缓冲液的条件进行计算)。[0253]质粒和农杆菌的农杆菌农业粘附/粘附[0254](santos-rosaetal.2008；zottinietal.,2008；bertazzonetal.2011)。根据传统方法，通过酶克隆和电穿孔技术对农杆菌进行工程化改造，将目标酶pgip+gtf1的编码序列克隆至pri201an(takara)表达载体中。在优选的实施方案中，选择农杆菌属的高毒性、非致瘤性菌株gv3101，特别是lb4404(takara)。因为载体pr201-an在非常短的时间内双重表达pgip-gtf1基因而不形成虫瘿，所以该菌株具有更高的效率。使用七甲基三硅氧烷改性的聚环氧烷(silwetvelonex)非常快速地浸渍叶子，并且加入农杆菌增加了其有效性；粘合剂的作用实际上巩固了病变，并使修饰的根茎渗透非常迅速，从而使构建体立即起作用，开始阻断病变。[0255]参考文献[0256]ausubel，fm，brent，r.，kingston，re，moore，dd，seidman，jg，smith，ja，andstruhl，k.(1994)[0257]currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingassociatesandwiley-interscience，newyork[0258]baron，m.，reynes，jp，stassi，d.，andtiraby，g.(1992)aselectablebifunctionalb-galactosidase：phleomycinresistancefusionproteinasapotentialmarkerforeukaryoticcells.gene114，239-243[0259]brake，aj，merryweather，jp，coit，dg，heberlein，ua，masiarz，gr，mullenbach，transformation.plantmol.biol.13，365-373[0273]sambrook，j.，fritsch，ef，andmaniatis，t.(1989)molecularcloning：alaboratorymanual，seconded.，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyorkscorer，ca，buckholz，rg，clare，jj，andromanos，ma(1993)theintracellularproductionandsecretionofhiv-1envelopeproteininthemethylotrophicyeastpichiapastoris.gene136，111-119[0274]waterham，hr，digan，me，koutz，pj，lair，sv，andcregg，jm(1997)isolationofthepichiapastorisglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenasegeneandregulationanduseofitspromoter.gene186，37-44[0275]zaret，ks，andsherman，f.(1984)mutationallyalteredendsofyeastcyc1mrnaaffecttranscriptstabilityandtranslationalefficiency.j.mol.biol.177，107-136[0276]thilanthanbienetal.j.gen.appl.microb.175-182(2014)当前第1页12当前第1页12