使用重组末端脱氧核苷酸转移酶生成具有经修饰的碱基的核酸的制作方法

本公开总体上涉及产生核酸，例如产生具有经修饰的碱基的核酸的领域。

背景技术：

技术实现思路

1、本文公开了修饰核酸的方法的实施方案。在一些实施方案中，该方法包括：(a)提供单链脱氧核糖核酸(ssdna)和包含经修饰的碱基的核苷三磷酸。该方法可包括：(b)使该ssdna和包含经修饰的碱基的该核苷三磷酸与重组末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)接触以生成ssdna支架。该ssdna支架可包括结合有一个或多个核苷酸的ssdna，该一个或多个核苷酸包括来自该核苷三磷酸的经修饰的碱基。重组tdt可以包含与seq id no:1至少80％同一的氨基酸序列。重组tdt可在功能上等同于seq id no:12的家牛(bos taurus)tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his420的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸取代突变。

2、在一些实施方案中，该方法进一步包括：(c)使ssdna支架与第一衔接子寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸接触以生成核酸载体。使ssdna支架与第一衔接子寡核苷酸接触可包括使ssdna支架与包含第一衔接子寡核苷酸和第一聚合物的第一衔接子接触。使ssdna支架与第二衔接子寡核苷酸接触可包括使ssdna支架与包含第二衔接子寡核苷酸和第二聚合物的第二衔接子接触。第一衔接子可包含共价连接的第一衔接子寡核苷酸和第一聚合物。第二衔接子可包含共价连接的第二衔接子寡核苷酸和第二聚合物。ssdna支架可包含第三聚合物。第一衔接子寡核苷酸可包含第一衔接子序列或其反向互补序列。第二衔接子寡核苷酸可包含第二衔接子序列或其反向互补序列。核酸载体可包含附接至第一衔接子寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸的ssdna支架。在一些实施方案中，该方法进一步包括：(d)提供核酸模板，该核酸模板包含第一衔接子序列或其反向互补序列、第二衔接子序列或其反向互补序列、和核酸杂交序列。该方法可包括：(e)使核酸载体与核酸模板接触以生成核酸载体，该核酸载体具有经由核酸模板的核酸杂交序列与核酸载体的模板捕获位点杂交的核酸模板。该方法可包括：(f)对与核酸模板杂交的核酸载体执行扩增以生成多个经扩增的核酸，该多个经扩增的核酸均包含第一衔接子寡核苷酸和第二衔接子寡核苷酸，该第一衔接子寡核苷酸和该第二衔接子寡核苷酸经延伸以包含核酸模板的序列或其反向互补序列。扩增可以是例如桥式扩增或排除扩增。该方法可包括：(g)使用多个经扩增的核酸确定核酸模板的序列。

3、本文公开了修饰核酸的方法的实施方案。在一些实施方案中，该方法包括：(a)提供第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸。该方法可包括：(b)使第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸与重组末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)在第一反应中在第一温度下接触达第一反应时间以生成第二核酸。该第二核酸可包含结合有以下的第一核酸：一个或多个包含来自第一核苷三磷酸的第一经修饰的碱基的第一核苷酸。重组tdt可以包含与seq id no:1至少80％同一的氨基酸序列。重组tdt可在功能上等同于seq idno:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his420的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸取代突变。

4、在一些实施方案中，该第一核酸和该第二核酸中的一者或多者包括单链核酸、具有3'悬垂部的双链核酸、具有3'凹部的双链核酸，或它们的组合。该第一核酸和该第二核酸中的一者或多者可包括脱氧核糖核酸(dna)。该第一核酸和该第二核酸中的一者或多者的至少50％的核苷酸可包括脱氧核糖核苷酸。该第一核酸和该第二核酸中的一者或多者可包括单链脱氧核糖核酸(ssdna)。该第一核酸和该第二核酸中的一者或多者可包含至少一个核糖核苷酸。

5、在一些实施方案中，该第二核酸包含结合有包含第一经修饰的碱基的第一核苷酸中的两个或更多个或三个或更多个第一核苷酸的第一核酸。该第二核酸中包含第一经修饰的碱基的第一核苷酸中的两个或更多个或三个或更多个第一核苷酸可以是连续的。该第一核苷三磷酸的第一经修饰的碱基可包括经修饰的腺嘌呤、经修饰的鸟嘌呤、经修饰的胞嘧啶、经修饰的胸腺嘧啶或经修饰的尿嘧啶。该第一核苷三磷酸可包括5-(15-叠氮基-4,7,10,13-四氧杂-十五烷酰基-氨基烯丙基)-2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸(叠氮化物-peg4-氨基烯丙基-dutp)、n6-(6-叠氮基)己基-3'-脱氧腺苷-5'-三磷酸(n6-(6-叠氮基)己基-3'-datp)，或它们的组合。在一些实施方案中，该第一核苷三磷酸包含共价连接的第一经修饰的碱基和第一辅助寡核苷酸。

6、在一些实施方案中，第一反应时间是至少1秒。第一温度可以是至少16℃至至少58℃。第一反应中的第一核酸的浓度可以是至少10nm。第一反应中的第一核苷三磷酸的浓度可以是至少0.1μm。第一反应中的重组tdt的浓度可以是至少10nm。

7、在一些实施方案中，提供第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸包括：提供第一核酸、包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸、和第二核苷三磷酸。使第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸与重组tdt接触可包括：使第一核酸、包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸、和第二核苷三磷酸在第一反应中在第一温度下与重组tdt接触达第一反应时间以生成第二核酸。该第二核酸可包含结合有以下的第一核酸：(i)包含来自第一核苷三磷酸的第一经修饰的碱基的第一核苷酸中的一个或多个第一核苷酸，以及(ii)一个或多个第二核苷酸。

8、在一些实施方案中，该一个或多个第二核苷酸中的每个第二核苷酸包含来自第二核苷三磷酸的第二经修饰的碱基。该第二核苷三磷酸的第二经修饰的碱基可包括经修饰的腺嘌呤、经修饰的鸟嘌呤、经修饰的胞嘧啶、经修饰的胸腺嘧啶或经修饰的尿嘧啶。该第一核苷三磷酸的该第一经修饰的碱基和该第二核苷三磷酸的该第二经修饰的碱基可包含对同一未修饰的碱基的修饰。该第一核苷三磷酸的该第一经修饰的碱基和该第二核苷三磷酸的该第二经修饰的碱基可包含对不同的未修饰的碱基的修饰。在一些实施方案中，该第二核苷三磷酸包含共价连接的第二经修饰的碱基和第二辅助寡核苷酸。

9、在一些实施方案中，第二核苷酸中的每个第二核苷酸包含来自第二核苷三磷酸的第二未修饰的碱基。该第二核苷三磷酸的该第二未修饰的碱基可包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。该第一经修饰的碱基可包含对第二未修饰的碱基的修饰。

10、在一些实施方案中，包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸和第二核苷三磷酸以范围为约1:100至约100:1的比率与第一核酸接触。包含该第一经修饰的碱基的该第一核苷酸和该第二核苷酸可以范围为约1:100至约100:1的比率结合到该第二核酸中。

11、在一些实施方案中，提供第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸包括：提供第一核酸、包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸、和多种第二核苷三磷酸。使第一核酸和包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸与重组tdt接触可包括：使第一核酸、包含第一经修饰的碱基的第一核苷三磷酸和多种第二核苷三磷酸在第一反应中在第一温度下与重组tdt接触达第一反应时间以生成第二核酸。该第二核酸可包含结合有以下的第一核酸：包含第一经修饰的碱基的第一核苷酸中的一个或多个第一核苷酸和来自多种第二核苷三磷酸的一个或多个第二核苷酸。

12、在一些实施方案中，该多种第二核苷三磷酸包括脱氧核糖腺嘌呤三磷酸、脱氧核糖鸟嘌呤三磷酸、脱氧核糖胞嘧啶三磷酸、脱氧核糖胸腺嘧啶三磷酸、脱氧核糖尿嘧啶三磷酸，或它们的组合。该多种第二核苷三磷酸中的两种第二核苷三磷酸可以范围为约1:100至约100:1的比率与该第一核酸接触。这些第二核苷酸中的两种第二核苷酸可以范围为约1:100至约100:1的比率结合到该第二核酸中。该多种第二核苷三磷酸中的至少一种或每种第二核苷三磷酸可包含第二未修饰的碱基。该多种第二核苷三磷酸中的至少一种或每种第二核苷三磷酸可包含第二经修饰的碱基。

13、在一些实施方案中，这些核苷酸的经修饰的碱基和未修饰的碱基可以范围为约1:100至约100:1的比率结合到该第二核酸中。经修饰的碱基可包括第一经修饰的碱基和/或结合到第二核酸中的多种第二核苷酸中的至少一种或每种第二核苷酸的碱基。未修饰的碱基可包括结合到第二核酸中的多种第二核苷酸中的至少一种或每种第二核苷酸的碱基。

14、在一些实施方案中，第二核酸的核苷酸碱基的至少1％包括经修饰的碱基。经修饰的碱基可以分布在整个第二核酸中。经修饰的碱基可以随机分布在整个第二核酸中。第二核酸可包含多个两个或更多个连续的经修饰的碱基。该多个连续的经修饰的碱基可包括三个或更多个连续的经修饰的碱基。在一些实施方案中，第二核酸的核苷酸碱基的至少1％包括第一经修饰的碱基。

15、在一些实施方案中，该第一核酸包含能够结合核酸模板的模板捕获位点。模板捕获位点可包含模板捕获序列。核酸模板可包含与模板捕获序列的反向互补序列具有至少90％序列同一性并且能够与该模板捕获序列杂交的序列。核酸模板可包括单链dna。

16、在一些实施方案中，第二核酸中的第一核苷三磷酸和第一核苷酸的第一经修饰的碱基中的一个或多个第一经修饰的碱基包含官能部分。第一经修饰的碱基的官能部分可以能够参与点击化学反应。第二核酸中的第一核苷三磷酸和第一核苷酸的第一经修饰的碱基可包含饱和或不饱和、取代或未取代的直链或支链脂肪族碳链。该第一经修饰的碱基的该官能部分和碱基可在通过饱和或不饱和、取代或未取代的直链或支链脂肪族碳链连接的第一经修饰的碱基的两个末端上。

17、在一些实施方案中，该方法进一步包括：提供第一辅助寡核苷酸。该方法可包括：使第二核酸与第一辅助寡核苷酸在第二反应中在第二温度下接触达第二反应时间以生成第三核酸，该第三核酸包含附接至该第一辅助寡核苷酸中的一个或多个第一辅助寡核苷酸的第二核酸。

18、在一些实施方案中，提供第一辅助寡核苷酸包括：提供该第一辅助寡核苷酸和第二辅助寡核苷酸。使该第二核酸与该第一辅助寡核苷酸接触可包括：使该第二核酸与该第一辅助寡核苷酸和该第二辅助寡核苷酸在第二反应中在第二温度下接触达第二反应时间以生成第三核酸，该第三核酸包含附接至该第一辅助寡核苷酸中的一个或多个第一辅助寡核苷酸和该第二辅助寡核苷酸中的一个或多个第二辅助寡核苷酸的该第二核酸。

19、在一些实施方案中，该第一辅助寡核苷酸包含第一衔接子序列或其反向互补序列。该第二辅助寡核苷酸可包含第二衔接子序列或其反向互补序列。在一些实施方案中，该第一衔接子序列包含p5序列。该第二衔接子序列可包含p7序列。

20、在一些实施方案中，该第一辅助寡核苷酸和该第二辅助寡核苷酸中的一者或多者的长度为约10个核苷酸至约100个核苷酸。第三核酸可包含约10个至约1,000,000个第一辅助寡核苷酸。第三核酸可包含约10个至约1,000,000个第二辅助寡核苷酸。在一些实施方案中，该第三核酸包含附接至第一辅助寡核苷酸中的一个或多个第一辅助寡核苷酸的第二核酸。该第三核酸可包含附接至第二辅助寡核苷酸中的一个或多个第二辅助寡核苷酸的第二核酸。

21、在一些实施方案中，提供第一辅助寡核苷酸包括提供包含该第一辅助寡核苷酸和第一聚合物的第一辅助物。使第二核酸与第一辅助寡核苷酸接触可包括使第二核酸与第一辅助物在第二反应中在第二温度下接触达第二反应时间以生成第三核酸，该第三核酸包含附接至第一辅助物中的一个或多个第一辅助物的第二核酸。提供第二辅助寡核苷酸可包括提供包含该第二辅助寡核苷酸和第二聚合物的第二辅助物。使第二核酸与第二辅助物接触可包括使第二核酸与该第二辅助物在第二反应中在第二温度下接触达第二反应时间以生成第三核酸，该第三核酸包含附接至第二辅助物中的一个或多个第二辅助物的第二核酸。第一辅助物可包含共价连接的第一辅助寡核苷酸和第一聚合物。第二辅助物可包含共价连接的第二辅助寡核苷酸和第二聚合物

22、在一些实施方案中，第一辅助寡核苷酸或第一聚合物包含第一官能部分。第二辅助寡核苷酸可包含第二官能部分。在一些实施方案中，该第一辅助寡核苷酸或该第一聚合物的该第一官能部分和该第二辅助寡核苷酸或该第二聚合物的该第二官能部分是相同的。第一辅助寡核苷酸的第一官能部分可以能够与第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分反应以形成共价键。第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分可以能够与第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分反应以形成共价键。

23、在一些实施方案中，第一辅助寡核苷酸或第一聚合物的第一官能部分能够参与点击化学反应。第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分可以能够参与点击化学反应。在一些实施方案中，第一辅助寡核苷酸或第一聚合物的第一官能部分能够参与与第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分的点击化学反应。第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分可以能够参与与第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分的点击化学反应。

24、在一些实施方案中，第一辅助寡核苷酸或第一聚合物的第一官能部分、第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分、第一核苷三磷酸的第一经修饰的碱基的官能部分和第一核苷酸的官能部分中的一者或多者独立地为叠氮化物、炔基、烯基、硫醇或硝酮。第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分和第一辅助寡核苷酸或第一聚合物的第一官能部分、或第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分和第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分、或两者可选自以下对：(i)叠氮基/炔基；(ii)炔基/叠氮基；(iii)硫醇/炔基；(iv)炔基/硫醇；(v)烯基/硫醇；(vi)硫醇/烯基；(vii)叠氮基/环辛炔基；(viii)环辛炔基/叠氮基；(ix)硝酮/环辛炔基；以及(x)环辛炔基/硝酮。第一核苷酸的第一经修饰的碱基的官能部分可以是叠氮基。第一辅助寡核苷酸或第一聚合物的第一官能部分和第二辅助寡核苷酸或第二聚合物的第二官能部分中的一者或多者可以独立地为炔基。

25、在一些实施方案中，点击化学反应包括铜催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)。共价键可以包含三唑基。cuaac可以包含cu(i)稳定化配体。该cu(i)稳定化配体可选自由以下组成的组：3-[4-({双[(1-叔丁基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基]氨基}甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基]丙醇(bttp)、3-[4-({双[(1-叔丁基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基]氨基}甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基]硫酸氢丙酯(bttps)、2-[4-({双[(1-叔丁基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基]氨基}甲基)-1h-1,2,3-三唑-1-基]硫酸氢乙酯(bttes)、2-[4-{(双[(1-叔丁基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基]氨基)甲基}-1h-1,2,3-三唑-1-基]-乙酸(bttaa)、红菲绕啉二磺酸二钠盐(bps)、n,n,n′,n″,n″-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)、三-((1-苄基-1h-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺(tbta)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta)、nε-((1r,2r)-2-叠氮基环戊氧基)羰基)-l-赖氨酸(acpk)和4-n,n-二甲基氨基-1,8-萘酰亚胺(4-dmn)。

26、在一些实施方案中，点击化学反应包括应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(spaac)。该共价键可包含环辛-三唑基。在一些实施方案中，点击化学反应包括炔烃加氢硫醇化。该共价键可包含烯基硫化物。在一些实施方案中，点击化学反应包括烯烃加氢硫醇化。该共价键可包含烷基硫化物。在一些实施方案中，点击化学反应包括应变促进的炔烃-硝酮环加成(spanc)。该共价键可包含八氢环辛-异噁唑基。该环辛炔基可以是二苄基环辛炔(dbco)或其衍生物。在一些实施方案中，点击化学反应是生物相容的。

27、在一些实施方案中，第二温度的约20℃至约65℃。第二温度可以小于0℃。第二温度可为约-4℃至约-20℃。在一些实施方案中，第二反应时间是至少1秒。

28、在一些实施方案中，该方法进一步包括：(c)提供核酸模板，该核酸模板包括第一衔接子序列或其反向互补序列、第二衔接子序列或其反向互补序列、以及能够与第三核酸上的模板捕获位点杂交的核酸杂交序列。该方法可包括：(d)使第三核酸与核酸模板接触以生成第三核酸，该第三核酸具有经由核酸模板的核酸杂交序列与第三核酸上的模板捕获位点杂交的核酸模板。该方法可包括：(e)对与核酸模板杂交的第三核酸执行扩增以生成第四核酸，该第四核酸包含附接至第一辅助寡核苷酸中的一个或多个第一辅助寡核苷酸和第二辅助寡核苷酸中的一个或多个第二辅助寡核苷酸的第三核酸，该第一辅助寡核苷酸和该第二辅助寡核苷酸经延伸以包含该核酸模板的序列或其反向互补序列。扩增可以是例如桥式扩增或排除扩增。该方法可包括：(f)使用第四核酸确定核酸模板的序列。核酸模板的核酸杂交序列可包含模板捕获位点的反向互补序列。

29、在一些实施方案中，第一核酸、第二核酸、第三核酸和/或第四核酸包含第三聚合物。

30、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于glu191的位置处的氨基酸取代突变可包括对非极性氨基酸、疏水性氨基酸、脂肪族氨基酸或支链氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191的位置处的氨基酸取代突变可以是glu191ala、glu191arg、glu191asn、glu191asp、glu191cys、glu191gln、glu191gly、glu191his、glu191ile、glu191leu、glu191lys、glu191met、glu191phe、glu191pro、glu191ser、glu191thr、glu191trp、glu191tyr、或glu191val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191的位置处的氨基酸取代突变可以是glu191ala、glu191gly、glu191ile、glu191leu、glu191met、或glu191val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191的位置处的氨基酸取代突变可以是glu191val。

31、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193的位置处的氨基酸取代突变可以包括对极性氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193的位置处的氨基酸取代突变可以是lys193ala、lys193arg、lys193asn、lys193asp、lys193cys、lys193gln、lys193glu、lys193gly、lys193his、lys193ile、lys193leu、lys193met、lys193phe、lys193pro、lys193ser、lys193thr、lys193trp、lys193tyr、或lys193val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193的位置处的氨基酸取代突变可以是lys193asn、lys193gln、lys193ser、或lys193thr。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193的位置处的氨基酸取代突变可以是lys193asn。

32、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu194的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu194的位置处的氨基酸取代突变可包括对非极性氨基酸、疏水性氨基酸、脂肪族氨基酸或支链氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu194的位置处的氨基酸取代突变可以是glu194ala、glu194arg、glu194asn、glu194asp、glu194cys、glu194gln、glu194gly、glu194his、glu194ile、glu194leu、glu194lys、glu194met、glu194phe、glu194pro、glu194ser、glu194thr、glu194trp、glu194tyr、或glu194val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu194的位置处的氨基酸取代突变可以是glu194ala、glu194gly、glu194ile、glu194leu、glu194met、或glu194val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu194的位置处的氨基酸取代突变可以是glu194gly。

33、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的asp242的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的asp242的位置处的氨基酸取代突变可包括对极性氨基酸或芳香族氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的asp242的位置处的氨基酸取代突变可以是asp242ala、asp242arg、asp242asn、asp242cys、asp242gln、asp242glu、asp242gly、asp242his、asp242ile、asp242leu、asp242lys、asp242met、asp242phe、asp242pro、asp242ser、asp242thr、asp242trp、asp242tyr、或asp242val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的asp242的位置处的氨基酸取代突变可以是asp242asn、asp242gln、asp242phe、asp242ser、asp242thr、asp242trp、或asp242tyr。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的asp242的位置处的氨基酸取代突变可以是asp242tyr。

34、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys287的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys287的位置处的氨基酸取代突变可以包括对极性氨基酸、带负电的氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys287的位置处的氨基酸取代突变可以是lys287ala、lys287arg、lys287asn、lys287asp、lys287cys、lys287gln、lys287glu、lys287gly、lys287his、lys287ile、lys287leu、lys287met、lys287phe、lys287pro、lys287ser、lys287thr、lys287trp、lys287tyr、或lys287val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys287的位置处的氨基酸取代突变可以是lys287asp或lys287glu。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys287的位置处的氨基酸取代突变可以是lys287glu。

35、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的phe296的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的phe296的位置处的氨基酸取代突变可包括对非极性氨基酸、疏水性氨基酸、脂肪族氨基酸或支链氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的phe296的位置处的氨基酸取代突变可以是phe296ala、phe296arg、phe296asn、phe296asp、phe296cys、phe296gln、phe296glu、phe296gly、phe296his、phe296ile、phe296leu、phe296lys、phe296met、phe296pro、phe296ser、phe296thr、phe296trp、phe296tyr、或phe296val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的phe296的位置处的氨基酸取代突变可以是phe296ala、phe296gly、phe296ile、phe296leu、phe296met、或phe296val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的phe296的位置处的氨基酸取代突变可以是phe296leu。

36、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的met299的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的met299的位置处的氨基酸取代突变可以包括对极性氨基酸、带正电的氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的met299的位置处的氨基酸取代突变可以是met299ala、met299arg、met299asn、met299asp、met299cys、met299gln、met299glu、met299gly、met299his、met299ile、met299leu、met299lys、met299phe、met299pro、met299ser、met299thr、met299trp、met299tyr、或met299val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的met299的位置处的氨基酸取代突变可以是met299arg、met299his、或met299lys。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的met299的位置处的氨基酸取代突变可以是met299lys。

37、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的thr342的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的thr342的位置处的氨基酸取代突变可以包括对极性氨基酸、脂肪族氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的thr342的位置处的氨基酸取代突变可以是thr342ala、thr342arg、thr342asn、thr342asp、thr342cys、thr342gln、thr342glu、thr342gly、thr342his、thr342ile、thr342leu、thr342lys、thr342met、thr342phe、thr342pro、thr342ser、thr342trp、thr342tyr、或thr342val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的thr342的位置处的氨基酸取代突变可以是thr342asn、thr342cys、thr342gln、thr342pro、或thr342ser。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的thr342的位置处的氨基酸取代突变可以是thr342ser。

38、在一些实施方案中，在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的his421的位置处的氨基酸取代突变包括对非极性氨基酸、极性氨基酸、带正电的氨基酸、带负电的氨基酸、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸、脂肪族氨基酸、小氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的his421的位置处的氨基酸取代突变可以包括对极性氨基酸、脂肪族氨基酸或亲水性氨基酸的突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的his421的位置处的氨基酸取代突变可以是his421ala、his421arg、his421asn、his421asp、his421cys、his421gln、his421glu、his421gly、his421ile、his421leu、his421lys、his421met、his421phe、his421pro、his421ser、his421thr、his421trp、his421tyr、或his421val。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的his421的位置处的氨基酸取代突变可以是his421asn、his421cys、his421gln、his421pro、his421ser、或his421thr。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的his421的位置处的氨基酸取代突变可以是his421pro。

39、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的两个或更多个位置处包含两个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的两个或更多个位置处的两个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的两者或更多者。

40、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的三个或更多个位置处包含三个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的三个或更多个位置处的三个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的三者或更多者。

41、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的四个或更多个位置处包含四个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的四个或更多个位置处的四个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的四者或更多者。

42、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的五个或更多个位置处包含五个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的五个或更多个位置处的五个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的五者或更多者。

43、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的六个或更多个位置处包含六个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的六个或更多个位置处的六个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的六者或更多者。

44、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的七个或更多个位置处包含七个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的七个或更多个位置处的七个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的七者或更多者。

45、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的八个或更多个位置处包含八个或更多个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的八个或更多个位置处的八个或更多个氨基酸取代突变可分别包括glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro中的八者或更多者。

46、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的八个位置处包含八个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的八个位置处的八个氨基酸取代突变可以分别是lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro。

47、在一些实施方案中，重组tdt在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的位置处包含九个氨基酸取代突变。在功能上等同于seq id no:12的家牛tdt中的glu191、lys193、glu194、asp242、lys287、phe296、met299、thr342和his421的位置处的九个氨基酸取代突变可以分别是glu191val、lys193asn、glu194gly、asp242tyr、lys287glu、phe296leu、met299lys、thr342ser和his421pro。

48、在一些实施方案中，该重组tdt包含与seq id no:1至少85％同一的氨基酸序列。该重组tdt包含可以与seq id no:1至少90％同一的氨基酸序列。该重组tdt包含可以与seqid no:1至少95％同一的氨基酸序列。该重组tdt包含可以与seq id no:11至少95％同一的氨基酸序列。该重组tdt包含可以与seq id no:12至少80％同一的氨基酸序列。

49、在一些实施方案中，重组tdt在47℃或更高的温度下是稳定的。重组tdt可以在50℃或更高的温度下是稳定的。重组tdt可以在55℃或更高的温度下是稳定的。重组tdt可以在58℃或更高的温度下是稳定的。在一些实施方案中，在相同的测试温度下，重组tdt的末端脱氧核苷酸转移酶活性是seq id no:12的家牛tdt的末端脱氧核苷酸转移酶活性的至少80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％或120％。测试温度可以是37℃、47℃、50℃、55℃、或58℃。

50、在一些实施方案中，重组tdt包含小泛素样修饰剂(sumo)片段。sumo片段包含可以与seq id no:13至少80％同一的氨基酸序列。重组tdt可包含在该重组tdt的n末端上的sumo片段。重组tdt可以包含与seq id no:14至少80％同一的氨基酸序列。重组tdt可以包含与seq id no:15至少80％同一的氨基酸序列。重组tdt可包含在该重组tdt的c末端上的sumo片段。

51、本文公开了通过任何修饰本公开的核酸的方法获得的第二核酸的实施方案。本文公开了通过任何修饰本公开的核酸的方法获得的第三核酸的实施方案。本文公开了通过任何修饰本公开的核酸的方法获得的第四核酸的实施方案。

52、本说明书中描述的主题的一个或多个具体实施的细节在附图和以下描述中进行阐述。根据说明书、附图和权利要求，其他特征、方面和优点将变得显而易见。本
技术实现要素：
和以下具体实施方式均不旨在限定或限制本发明主题的范围。