PD-L1-特异性抗体和抗PD-L1-CAR-T细胞的制作方法

本发明涉及pd-l1(程序性死亡配体-1)-特异性抗体和抗pd-l1-car-t细胞，它们对于肿瘤的过继免疫基因治疗领域中是有用的。

背景技术：

1、免疫疗法正在成为一种非常有前途的癌症治疗方法。t细胞或t淋巴细胞是我们免疫系统的武装力量，不断寻找外来抗原并将异常(癌症或经感染细胞)和正常细胞区分开来。利用car(嵌合抗原受体)构建体对t细胞进行基因修饰已成为设计肿瘤特异性t细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(taa)的car-t细胞输入患者体内(称为过继细胞转移或act)是一种有效的免疫治疗方法[1,2]。与化疗或抗体相比，car-t技术的优点在于经重新编程的工程化t细胞能在患者体内实现增殖和持续存在(“一种活的药物”)[1,3,4]。

2、car通常由在n-末端部分的单克隆抗体来源的单链可变片段(scfv)、铰链、跨膜结构域和若干胞内共刺激结构域：(i)cd28，(ii)cd137(4-1bb)、cd27或其他共刺激结构域，与cd3ζ结构域串联组成(图1)[1,2]。car的演变经历了从第一代(无共刺激结构域)到第二代(有一个共刺激结构域)再到第三代car(有若干个共刺激结构域)。产生具有多个共刺激结构域的car(所谓的第三代car)增强了car-t细胞毒活性，显著改善car-t细胞的持久性，从而增强其抗肿瘤活性。

3、图1示出了car的结构。左侧示出了第一代(无共刺激结构域)的结构，中间示出了第二代(一个共刺激结构域cd28或4-1bb)的结构，以及右侧示出了第三代(两个或若干个共刺激结构域)。该图来自于golubovskaya,wu,cancers,2016[5]。

4、pd-l1，也称为分化簇274、cd274或b7同源物1、b7-h1，是一种40kda的跨膜蛋白，在疾病或其他事件期间在抑制免疫系统中起重要作用。pd-l1结构域与pd-1蛋白的结合阻断了负责免疫防御的cd8+t细胞的增殖和活性。pd-l1/pd-1的相互作用在体内，特别是在肿瘤微环境中于抑制t细胞响应中起主导作用。

5、若干类型的癌症会过表达pd-l1。在临床试验中测试了抗pd-l1单克隆抗体(mabs)和抗pd-1mabs免疫疗法[3]。pd-l1在正常组织的细胞表面通常不表达，但在许多肿瘤组织中表达升高。此外，pd-l1表达通过免疫细胞，主要通过其的产生ifn-γ而被显著上调。

6、美国食品药品监督管理局(fda)于2017年加速批准阿维鲁单抗(avelumab)用于治疗患有转移性默克尔细胞瘤的成人和12岁及以上儿童患者。阿维鲁单抗是一种阻断pd-l1的人igg1λ单克隆抗体。

7、需要一种具有高特异性和活性的抗pd-l1抗体。

技术实现思路

技术特征：

1.一种单克隆抗人pd-l1抗体或其抗原结合片段，包括：具有seq id no:3所示氨基酸的vh和具有seq id no:5所示氨基酸的vl，其中所述抗体结合至人pd-l1蛋白。

2.一种单链可变片段(scfv)，包括：具有seq id no:3所示氨基酸的vh和具有seq idno:5所示氨基酸的vl，其中所述scfv结合至人pd-l1蛋白。

3.根据权利要求2所述的scfv，进一步包括位于vh与vl之间的接头。

4.根据权利要求2所述的scfv，其具有seq id no:9所示氨基酸序列。

5.一种嵌合抗原受体融合蛋白(car)，所述嵌合抗原受体融合蛋白自n-末端到c-末端包括：

6.根据权利要求5所述的car，其中，所述scfv进一步包括位于vh与vl之间的接头。

7.根据权利要求5所述的car，其中，所述共刺激结构域是cd28或4-1bb。

8.根据权利要求5所述的car，其中，所述激活结构域是cd3ζ。

9.根据权利要求5所述的car，其具有seq id no:20或seq id no:24所示氨基酸序列。

10.一种编码权利要求5所述的car的核酸。

11.经修饰以表达权利要求5所述的car的t细胞或自然杀伤细胞。

技术总结
本发明涉及单克隆抗人PD‑L1抗体或单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:3所示氨基酸的V<subgt;H</subgt;和具有SEQ ID NO:5所示氨基酸的V<subgt;L</subgt;。本发明还涉及嵌合抗原受体融合蛋白，其自N‑末端到C‑末端包括：(i)本发明的单链可变片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。发明人已经表明，本发明的PD‑L1CAR‑T细胞在杀伤若干癌细胞系方面比阿维鲁单抗PD‑L1CAR‑T细胞更有效。PD‑L1CAR‑T在免疫疗法中可单独使用或者与其他药物联合使用。

技术研发人员：吴力军,维塔·格鲁博斯卡娅
受保护的技术使用者：普洛迈博生物技术公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12