生成多样化病毒文库的制作方法

生成多样化病毒文库
1.本发明涉及一种用于产生病毒文库的方法，其包含第一培养步骤和第二培养步骤。这些步骤旨在分别促进同一病毒科的双链dna病毒之间的种内重组和种间重组。
2.病毒在广泛的应用中拥有巨大的潜力，例如溶瘤病毒、疫苗、抗病毒药物和基因治疗载体。迄今为止，大多数产生具有所需性质的病毒的方法都依靠对特定病毒基因组复杂性的逐步了解。然后设计对病毒基因组序列的修饰以将所需特征引入基因组，希望这将使该病毒适合于特定应用。
3.需要一种新的方法来加速具有多样化特性的病毒的生成过程，以提供具有高度多样性的文库，从中可以选择针对特定应用而言具有最期望特性的最佳病毒。
4.使用多样化病毒文库的一个实例是开发新的溶瘤载体。由于肿瘤能够对治疗产生抗性，因此在开发癌症治疗方法方面一直存在着重大挑战。目前的疗法，包括化疗和放疗，会产生毒性副作用，并且通常功效有限。为了克服这些问题，已经使用溶瘤病毒作为一种新的方法。天然存在的或遗传修饰的溶瘤病毒能够在肿瘤内选择性复制，通过细胞裂解感染和杀死癌细胞而不影响正常细胞，以及根据肿瘤抗原的释放引发抗肿瘤免疫应答。为了确保溶瘤病毒不在正常细胞中复制，选择非致病性病毒株，或通过插入或缺失基因来对病毒基因组进行遗传工程。基因工程溶瘤病毒的实例包括t-vec，一种缺失γ34.5和α47基因的疱疹病毒，其被fda批准用于黑素瘤。然而，迄今为止，基因工程溶瘤病毒在临床上的成功有限。
5.尽管存在大于60种血清型的野生型人腺病毒(ad)，但ad5及其变体是用作溶瘤腺病毒的显性ad型。绝大多数其它血清型尚未被开发用作溶瘤病毒。
6.产生更多溶瘤病毒的一种方法是使用病毒池进行生物选择或“定向进化”，以生成新的溶瘤病毒血清型。这涉及通过汇集不同的病毒血清型和/或随机引入突变来模拟病毒的天然选择(例如描述于bauzon和hermiston,“溶瘤病毒：定向进化的动力(oncolytic viruses:the power of directed evolution)”；《病毒学进展(advances in virology)》,2012卷,文章id 586389)。kuhn等人展示了使用定向进化来生成一种新型非ad5溶瘤病毒用于治疗结肠癌(“定向进化生成用于治疗结肠癌的新型溶瘤病毒(directed evolution generates a novel oncolytic virus for the treatment of colon cancer)”；《公共科学图书馆
·
综合(plos one)》3(6):e2409(2008)；以及wo2008/080003)和卵巢癌(“ovad1，一种通过三维定向进化为卵巢癌开发的新型强效选择性嵌合溶瘤病毒(ovad1,a novel,potent,and selective chimeric oncolytic virus developed for ovarian cancer by 3d-directed evolution)”《分子治疗溶瘤剂(mol.ther.oncolytics)》；4:55-66)。kuhn和hermiston等人，汇集具有或不具有嵌合病毒coload1的不同ad亚组(ad3、ad4、ad5,ad9,ad11p,ad16,ad35,ad40)。将随机突变引入病毒池的子样品中，然后加入到未突变的病毒颗粒池。组合的病毒池在人肿瘤细胞系上传代，以引起重组来增加多样性。这导致生成了coload1(ad3/ad11p)和ovad1(ad3/coload1)嵌合肿瘤病毒，与ad5相比，它们效力提高，治疗窗口更大。“定向进化”造成coload1的基因组被修饰，包括e3和e4区域缺失、e2b区域改变和定位于病毒的e4orf4区域缺失。嵌合病毒的效力增加可以通过病毒基因组的改变来解
释。在wo2008/080003中描述的另一个实例中，描述了一种使用亚硝酸引入点突变以获得每个病毒基因组约10个突变，随后重组病毒池的方法。
7.仍然需要改进方法来提高病毒池的多样性，为筛选/生物选择改进的细胞特异性肿瘤病毒提供起点。
8.在kuhn等人(2008,同上)中，将来自ad组b的3种血清型和来自ad组c、d、e和f各自的1种血清型汇集在一起，并在据称引起血清型之间重组的条件下在靶肿瘤细胞系的培养物上进行传代。得到coload1，一种复合ad3/ad11p嵌合病毒。ad3和ad11p都是ad组b血清型，因此coload1中的重组是由组内(adb)重组产生的，即不涉及来自ad组c、d、e和f的病毒。
9.在kuhn等人的后续论文中。(《分子治疗：溶瘤剂(molecular therapy:oncolytics)》,第4卷,2017年3月,第55-66页)，产生了另一种嵌合ad病毒，ovad1。这是ad3、ad11和coload1之间重组的结果，它们都是adb血清型或嵌合体。
10.然而，本发明人现在已经认识到，不同的腺病毒物种在不同的细胞系上以不同的速率生长，并且不同的细胞系对病毒重组具有不同的倾向性。因此，可能无法通过使用单个细胞系在单一步骤中促进一组混合的腺病毒物种得到最佳的重组多样性。
11.此外，来自不同物种的病毒不太可能相互发起重组事件，因此不太可能参与多样化。然而，将来自任何给定病毒物种的一种以上血清型的病毒在一起培养，可能会导致血清型之间的重组，这可能会产生足够的新的同源性区域，以允许物种之间的重组。
12.因此，为了使文库多样性最大化，本发明的方法提供了将来自第一物种的至少两种血清型的病毒在一个或多个合适的细胞系上一起培养，以促进种内重组；并且然后仅将来自第一物种的(重组)病毒与来自第二(不同的)物种的一种或多种病毒一起培养，以便促进不同的物种内重组事件和物种间重组。特别有利的是将来自第二物种的至少两种病毒血清型一起培养或提前一起培养，以促进第二物种内的物种内重组。在该过程期间或之后，可对所得重组病毒进行进一步多样化(例如诱变)过程。
13.因此，本发明描述了使病毒文库多样性最大化的新方法。
14.病毒基因组的多样性将使得能够开发具有新特性的新病毒，其可用于诸如高效选择性溶瘤病毒、疫苗、抗病毒疗法和基因治疗载体的应用。
15.在第一方面，提供了一种用于产生病毒文库的方法，该方法包含：
16.(a)第一培养步骤，其包含在一个或多个细胞系上将来自第一双链dna病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，以及
17.(b)组合以下两者
18.(i)从步骤(a)获得的病毒，和
19.(ii)来自一种或多种其它双链dna病毒物种的每一个的相同物种的至少两种不同血清型的病毒，
20.其中第一双链dna病毒物种和每种其它双链dna病毒物种都是相同双链dna病毒科或属中的不同物种；
21.以产生病毒文库；
22.以及任选地
23.(c)第二培养步骤，其中将在步骤(b)中组合的病毒在一个或多个细胞系上一起培养；以及
24.(d)组合步骤(c)后获得的病毒或其部分，和/或从其中分离多种病毒，以产生病毒文库。
25.在一些实施例中，在步骤(b)(ii)中，对于一种或多种其它双链dna病毒物种中的每个物种，来自所述物种的不同血清型的病毒是预先一起培养的病毒，其中不同物种的病毒预先独立培养。
26.在一些优选的实施例中，本发明的方法包含以下步骤：
27.(a)第一培养步骤，其包含
28.(i)在一个或多个细胞系上将来自第一双链dna病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养；以及
29.(ii)在一个或多个细胞系上培养来自一种或多种其它双链dna病毒物种中的每一种的相同物种的至少两种不同血清型的病毒，
30.其中，对每种双链dna病毒物种，将相同物种的不同血清型的病毒一起培养，并且将不同物种的病毒独立培养；以及
31.(b)组合以下两者
32.(i)来自步骤(a)(i)的病毒，和
33.(ii)来自步骤(a)(ii)的病毒。
34.在一些实施例中，步骤(b)另外包含将来自(i)和(ii)的病毒与来自以下的病毒组合：
35.(iii)第一双链dna病毒物种；
36.(iv)与第一双链dna病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；
37.(v)一种或多种其它双链dna病毒物种；和/或
38.(vi)与其它双链dna病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。
39.在一些实施例中，步骤(d)另外包含将在步骤(c)后获得的病毒或其部分与来自以下的病毒组合：
40.(i)第一双链dna病毒物种；
41.(ii)一种或多种其它双链dna病毒物种；
42.(iii)在培养步骤(a)后获得的一种或多种病毒；
43.(iv)与第一双链dna病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；和/或
44.(v)与其它双链dna病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。
45.在一些实施例中，在步骤(a)、(b)和/或(c)中的一个或多个之前、期间或之后对病毒进行诱变。
46.优选地，双链dna病毒是腺病毒(即来自腺病毒科(adenoviridae))。
47.本发明涉及一种用于产生病毒文库(例如野生型和嵌合病毒的混合物)的方法，该方法包含如本文所定义的步骤(a)和(b)以及任选的步骤(c)和(d)。
48.本发明的方法使用双链dna病毒。优选地，双链dna病毒选自由腺病毒科(adenoviridae)、非洲猪瘟病毒科(asfarviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、痘病毒科(poxviridae)和乳头瘤病毒科(papillomaviridae)组成的组。更优选地，双链dna病毒选自腺病毒科、疱疹病毒科和痘病毒科。最优选地，病毒来自腺病毒科。
49.第一双链dna病毒和其它双链dna病毒都来自相同科或属。在一些实施例中，第一双链dna病毒和其它双链dna病毒都来自相同科内的相同属。在其它实施例中，第一双链dna病毒和其它双链dna病毒来自相同科内的一个或多个不同属。
50.如本文所用，“腺病毒”(本文也缩写为“ad”)是指属于腺病毒科(adenoviridae)的那些病毒，包括在目前已知的五个属中的任一个中：乳腺病毒(mastadenovirus)、禽腺病毒(aviadenovirus)、腺病毒(atadenovirus)、唾液腺病毒(siadenovirus)和鱼腺病毒(ichtadenovirus)。优选地，腺病毒来自乳腺腺病毒属；这包括所有人血清型。在一个实施例中，腺病毒是人腺病毒。
51.目前已经描述了人腺病毒的超过60种抗原类型或“血清型”，并且这些血清型已经根据它们的物理、化学和生物学特性被分类为7个物种，即ad物种a-g(例如wold等人《当代基因治疗(current gene therapy)》第13卷,6(2013):421-33所述)。
52.因此，本文所用的腺病毒物种是指那些目前已知的ad组a-g以及未来确认的任何ad。
53.因此，在一个实施例中，腺病毒物种是选自由ada、adb、adc、add、ade、adf和adg组成的组的人腺病毒物种。在一些实施例中，人腺病毒物种选自由adb、adc、add、ade、adf和adg组成的组。
54.属于这些腺病毒物种中的每一种的血清型如下所示：
55.ada包含ad12、ad18和ad31。adb包含ad3、ad7、ad11、ad14、ad16、ad21、ad34、ad35、ad50和ad55。adc包含ad1、ad2、ad5、ad6和ad57。
56.add包含ad8、ad9、ad10、ad13、ad15、ad17、ad19、ad20、ad22、ad23、ad24、ad25、ad26、ad27、ad28、ad29、ad30、ad32、ad33、ad36、ad37、ad38、ad39、ad42、ad43、ad44、ad45、ad46、ad47、ad48、ad49、ad51、ad53、ad54和ad56。ade包含ad4。adf包含ad40和ad41。adg包含ad52。本文提及的不同ad血清型包括这些血清型的所有不同毒株或变体。
57.在其它实施例中，双链dna病毒来自疱疹病毒科或痘病毒科。优选地，疱疹病毒科具有α疱疹病毒亚科(alphaherpesvirinae)、β疱疹病毒亚科(betaherpesvirinae)或γ疱疹病毒亚科(gammaherpesvirinae)。优选地，疱疹病毒科来自α疱疹病毒亚科。优选地，α疱疹病毒亚科具有传染性喉气管炎病毒属(iltovirus)、马德病毒属(mardivirus)、单纯疱疹病毒属(simplexvirus)、盾板病毒属(scutavirus)或水痘病毒属(varicellovirus)。
58.优选地，疱疹病毒来自单纯疱疹病毒属。单纯疱疹病毒作为两个主要物种存在：单纯疱疹病毒1型(hsv-1)和单纯疱疹病毒2型(hsv-2)。不同类型的疱疹病毒在本领域中通常称为“毒株”而不是“血清型”。然而，应当理解，在本发明应用于疱疹病毒时的上下文中，术语“血清型”和“多种血清型”将分别涵盖“毒株”和“多种毒株”。
59.为了本发明的目的，将hsv毒株分类为病毒基因组差异大于0.5％(参见davison aj.分类概述。在以下中：编辑arvin a,campadelli-fiume g,mocarski e,等.《人类疱疹病毒：生物学，治疗和免疫预防(human herpesviruses:biology,therapy,and immunoprophylaxis)》。剑桥：剑桥大学出版社(cambridge university press)；2007.第1章)。
60.疱疹病毒株包括但不限于hf10、f、e06、h129、17、kos、kos63、kos79和js-1。
61.优选地，痘病毒科选自以下亚科或属之一：脊索痘病毒亚科(chordopoxvirinae)、
禽痘病毒属(avipoxvirus)、羊痘病毒属(capripoxvirus)、中非痘病毒属(centapoxvirus)、宫颈痘病毒属(cervidpoxvirus)、鳄鱼痘病毒属(crocodylidpoxvirus)、兔痘病毒属(leporipoxvirus)、巨痘病毒属(macropopoxvirus)、软疣痘病毒属(molluscipoxvirus)、鼬痘病毒属(mustelpoxvirus)、正痘病毒属(orthopoxvirus)、稻鼠痘病毒属(oryzopoxvirus)、副痘病毒属(parapoxvirus)、狐蝠痘病毒属(pteropopoxvirus)、鲑痘病毒属(salmonpoxvirus)、松鼠病毒属(sciuripoxvirus)、猪痘病毒属(suipoxvirus)、蝙蝠痘病毒属(vespertilionpoxvirus)、鸭痘病毒属(yatapoxvirus)、昆虫痘病毒亚科(entomopoxvirinae)、甲型昆虫痘病毒属(alphaentomopoxvirus)、乙型昆虫痘病毒属(betaentomopoxvirus)和丙型昆虫痘病毒属(gammaentomopoxvirus)。
62.更优选地，痘病毒科来自正痘病毒属。正痘病毒属优选来自物种阿巴蒂诺猕猴痘(abatino macacapox)病毒、艾哈迈塔(akhmeta)病毒、骆驼痘(camelpox)病毒、牛痘(cowpox)病毒、鼠痘(ectromelia)病毒、猴痘(monkeypox)病毒、浣熊痘(raccoonpox)病毒、臭鼬痘(skunkpox)病毒、沙鼠痘(taterapox)病毒、牛痘(vaccinia)病毒、天花(variola)病毒或田鼠痘(volepox)病毒，更优选牛痘(vaccinia)病毒。
63.不同类型的痘苗病毒在本领域中通常称为“毒株”而不是“血清型”。然而，应当理解，在本发明应用于痘苗病毒时的上下文中，术语“血清型”和“多种血清型”将分别包括“毒株”和“多种毒株”。为了本发明的目的，痘苗病毒株分类为病毒基因组差异大于0.5％。
64.痘苗病毒株包括但不限于利斯特株(lister strain)、改良安卡拉痘苗病毒株(modified vaccinia ankara)、西部储备株(western reserve strain)、dryvax株(“惠氏(wyeth)”)、哥本哈根株(copenhagen)、lc16m8株、cv-1株和天坛株(tian tan)(参见s
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nchez-sampedro l,perdiguero b,mej
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a-arriaza j,di pilato m,esteban m.痘病毒疫苗的进化(the evolution of poxvirus vaccines).《病毒(viruses)》2015；7(4):1726-1803,2015年4月7日发布.doi:10.3390/v7041726)。
65.第一培养步骤包含将来自第一双链dna病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养。在第一培养步骤中，一起培养的血清型都来自相同的病毒物种。该步骤的目的是促进相同物种病毒之间的血清型间重组。
66.在第一培养步骤中，来自不同物种的病毒被独立地培养，例如在不同/分开的培养容器中。
67.一起培养的每个物种的血清型数目可以是2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多，优选至少3种、至少4种或至少5种血清型。
68.在一个实施例中，样品中至少两种血清型的比例大致相等(即感染性颗粒或基因组拷贝数相等)。这可以使得在用作在细胞系上生长的起始材料的病毒亚组样品中存在相等比例的血清型。
69.来自每个不同物种的病毒在一个或多个合适的细胞系上独立培养，细胞系允许该物种的病毒生长和复制(优选最佳生长和/或复制)。在一些实施例中，每种病毒物种独立地(即分别地)在单个细胞系上生长。在其它实施例中，每种病毒物种独立地(即分别地)在多个细胞系上生长。在一些实施例中，多个细胞系一起生长(例如在同一培养容器中)。在其它实施例中，多个细胞系独立生长(例如在不同的培养容器中)。
70.在第一培养步骤结束时，在一个或多个细胞系上培养的病毒可以组合(汇集)。在每种情况下，来自不同物种的病毒分别培养。
71.适于生长病毒的细胞系包括无限增殖化细胞系，如从天然存在的癌症中分离的那些。在一个实施例中，优选的细胞系是癌细胞系。合适的癌细胞系包括a549、ht29、hek293、hct116、mm1s、skov3、mmr、jjn3、rpmi-8226和u266。用于生长腺病毒血清型的合适的癌细胞系包括例如a549、ht29、hek293、hct116、skov3和mm1s细胞。用于生长特定病毒亚组的其它合适细胞系是本领域技术人员已知的。在一些实施例中，细胞系在病毒感染前生长至亚汇合。
72.在一个实施例中，细胞系是dna修复缺陷型细胞系，合适地是dna修复酶或dna损伤传感缺陷的细胞系，例如hct116细胞。
73.对于每种病毒血清型，将存在促进该特定血清型的最大病毒生长和/或重组的优选细胞系。优选的细胞系是在7天内表达该特定血清型的细胞进入受体和/或支持高水平病毒基因组复制(定义为与第0天输入相比病毒基因组增加》200倍)的细胞系。那些以相似动力学进入并在细胞内复制的病毒具有更大的重组机会。测定最大病毒生长的方法是本领域已知的；本文描述了一些。
74.在另一实施例中，物种是adb，并且优选的细胞系是a549或hct116，最优选a549。在一个实施例中，物种是adc，并且优选的细胞系是mm1s、hek293或a549，最优选a549。在另一个实施例中，物种是add，并且优选的细胞系是ht29或a549，最优选ht29。
75.在第一培养步骤中，将来自每个不同物种的病毒在一个或多个允许这些病毒复制的合适细胞系上独立地培养。用病毒感染细胞系和病毒在细胞系上生长的方法是本领域熟知的(例如shashkova ev,may sm,barry ma.作为抗癌剂的人腺病毒血清型5、6、11和35的表征(characterization of human adenovirus serotypes 5,6,11,and 35as anticancer agents).《病毒学(virology)》.2009；394(2):311-320.doi:10.1016/j.virol.2009.08.038；和freedman jd,hagel j,scott em等人表达双特异性抗体的溶瘤腺病毒在癌症活检中靶向t细胞细胞毒性(oncolytic adenovirus expressing bispecific antibody targets t-cell cytotoxicity in cancer biopsies).《embo分子医学(embo mol med.)》2017；9(8):1067-1087.doi:10.15252/emmm.201707567).
76.病毒“生长”或“正在生长”是指增加病毒颗粒的数量。“生长”病毒包括感染合适的细胞系并在允许病毒复制的条件下培养那些感染的细胞。可以使用诸如qpcr的技术定量病毒生长，以测量病毒基因组的数目。合适的“生长”包括病毒“传代”。
[0077]“汇集”是指混合从单独反应获得的样品。在这种情况下，“汇集”是指混合所得扩增的病毒样品。
[0078]“独立生长”是指每个病毒群单独在细胞系上生长。例如，adc病毒与add病毒分开单独在细胞系上生长。
[0079]
在用病毒感染细胞系之前，细胞系可以生长至亚汇合。在一些实施例中，细胞生长至约70％汇合。例如，细胞可以以约1x106细胞的密度在t25培养瓶中生长。
[0080]
感染优选以50至1000vp/细胞的病毒颗粒/细胞比率，更优选高达500vp/细胞。有利地，该颗粒/细胞比率被优化以促进血清型之间的重组。本文描述了这些比例，特别是对于adb、adc、add、ade、adf或adg病毒文库。
[0081]
或者，以1至100的moi(感染复数)，优选以大于10的moi感染细胞。
[0082]
优选地，在促进血清型间重组的条件下，在第一培养步骤中在合适的细胞系上培养病毒。优选地，这些条件包括多轮病毒复制，其中在每轮病毒复制中产生多个病毒。
[0083]
在一些优选的实施例中，在步骤(a)或步骤(c)期间，在第一培养或第二培养中允许进行至多30轮的病毒复制，优选在每次传代中进行至少1、2、3、4、5或至少6轮的病毒复制。例如，在5至7天内允许5轮复制。
[0084]
在一个实施例中，在细胞系(优选癌细胞系)上生长的病毒在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天后，优选在3至7天后收获。
[0085]
在一些实施例中，病毒在第一培养步骤或第二培养步骤期间传代1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，优选4至6次。
[0086]
例如，多轮“传代”涉及“生长”病毒以增加病毒基因组的数目。合适地，一轮“传代”涉及以合适的病毒颗粒：细胞比率用病毒感染细胞；使细胞在合适的条件下生长以使病毒发挥其完全细胞病变效应(即在腺病毒的情况下，裂解宿主细胞并释放病毒颗粒)；收集包含病毒颗粒的细胞和/或上清液，并将其用于另一轮“传代”。在一些实施例中，可对细胞和/或上清液进行“冻融”。
[0087]
本文所用的“冻融”是指冷冻来自病毒感染的收获细胞和/或上清液并将其解冻的过程，然后将其用作随后在亚汇合培养物上传代的起始材料。“冻融”过程导致病毒颗粒从病毒感染的细胞中最佳释放。合适地，根据本发明的冻融循环优选为至少1个循环或2个循环或3个循环。
[0088]
在一些优选的实施例中，细胞系细胞生长至亚汇合，然后以50至1000vp/细胞，优选100至500vp/细胞或1至100moi感染。
[0089]
在一些优选的实施例中，病毒传代约5次，每次在3至7天后。在一些其它优选的实施例中，病毒在第一培养步骤和/或第二培养步骤中传代2至6次，每次在2至6天后。
[0090]
在本发明的一些优选实施例中，步骤(a)包含：
[0091]
(a)第一培养步骤，其包含
[0092]
(i)在一个或多个细胞系上将来自第一双链dna病毒物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养；以及
[0093]
(ii)在一个或多个细胞系上将来自一种或多种其它双链dna病毒物种中的每一种的相同物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，其中对于每种双链dna病毒物种，将相同物种的不同血清型的病毒一起培养，并且将不同物种的病毒独立培养。
[0094]
在该实施例中，对于每个物种，将来自相同物种的至少两种不同血清型的病毒一起培养，从而促进物种内重组。
[0095]
来自许多不同双链dna病毒物种的病毒各自独立地(即分别地)或基本上独立地在一个或多个细胞系上培养(并且然后任选地汇集)。优选为每种病毒选择一个或多个细胞系，使得该病毒物种在所述一个或多个细胞系上最佳生长。
[0096]
每种细胞系培养物包含仅一个物种或基本上仅一个物种的病毒；每种培养物包含一个物种的大多数病毒；或者每种培养物包含在该细胞系上最佳生长的病毒。在每种细胞系培养物中可以存在痕量或微量的其它物种的病毒。
[0097]
在该实施例中，培养来自一种或多种其它双链dna病毒物种中的每一种的相同物
种的至少两种不同血清型的病毒。术语“一种或多种其它物种”可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种双链dna病毒，优选1至5种，更优选3至5种其它物种。
[0098]
步骤(a)在步骤(b)之前进行。
[0099]
步骤(b)包含：
[0100]
(b)组合以下两者
[0101]
(i)从步骤(a)获得的病毒，和
[0102]
(ii)来自一种或多种其它双链dna病毒物种的每一个的相同物种的至少两种不同血清型的病毒，
[0103]
其中第一双链dna病毒物种和每种其它双链dna病毒物种都是相同双链dna病毒科或属中的不同物种。
[0104]
从步骤(a)获得并用于步骤(b)的病毒通常是从步骤(a)获得的所有或基本上所有病毒或其样品。
[0105]
术语“一种或多种其它物种”可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种双链dna病毒，优选1至5种，更优选3至5种其它物种。
[0106]
在一些实施例中，在步骤(b)(ii)中，对于一种或多种其它双链dna病毒物种中的每个物种，来自所述物种的不同血清型的病毒是预先一起培养的病毒，其中不同物种的病毒优选预先独立培养。
[0107]
在该实施例中，将相同物种的不同血清型的病毒预先一起培养(例如在一个或多个细胞系上)，以促进种内重组。不同物种的病毒优选预先独立地(即分别地)或基本上独立地培养。例如，每种培养物包含仅一个物种或基本上仅一个物种的病毒；每种培养物包含一个物种的大多数病毒；或者每种培养物包含在该细胞系上最佳生长的病毒。
[0108]
在一些实施例中，步骤(b)另外包含将来自(i)和(ii)的病毒与来自以下的病毒组合：
[0109]
(iii)第一双链dna病毒物种；
[0110]
(iv)与第一双链dna病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；
[0111]
(v)一种或多种其它双链dna病毒物种；和/或
[0112]
(vi)与其它双链dna病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。
[0113]
特别地，步骤(b)另外包括将来自(i)和(ii)的病毒与来自与第一双链dna病毒物种相同属的物种的其它病毒(包括相同属的该物种的单一血清型的病毒)组合。
[0114]
优选地，包括至少1％(例如1％至5％或5％至10％)的这些另外的病毒。
[0115]
步骤(c)任选包含：
[0116]
(c)第二培养步骤，其中将在步骤(b)中组合的病毒在一个或多个细胞系上一起培养。
[0117]
第一培养步骤的目的是促进种内重组，而第二培养步骤的目的是促进种间重组。用于第二培养步骤的细胞系可以是上述第一培养步骤中的一个或多个细胞系。在第二培养步骤中用于感染和细胞培养的参数(例如moi、病毒复制的轮次、培养和传代的持续时间)与以上对于第一培养步骤给出的那些相同，加以必要的修正。
[0118]
特别地，将来自第一物种的病毒和每个其它物种的病毒在一个或多个合适的细胞系上一起培养，细胞系允许那些物种的病毒生长和复制(优选最佳生长和/或复制)。在一些
实施例中，这些病毒在单个细胞系上一起生长。在其它实施例中，这些病毒在多个细胞系上一起生长。在一些实施例中，多个细胞系一起生长(例如在同一培养容器中)。在其它实施例中，多个细胞系独立生长(例如在不同的培养容器中)。
[0119]
本发明的方法可以任选地另外包含以下步骤：
[0120]
(d)组合步骤(c)后获得的病毒或其部分，和/或从其中分离多种病毒，以产生病毒文库。
[0121]
在一些实施例中，步骤(d)另外包含将在步骤(c)后获得的病毒或其部分与来自以下的病毒组合：
[0122]
(i)第一双链dna病毒物种；
[0123]
(ii)一种或多种其它双链dna病毒物种；
[0124]
(iii)在培养步骤(a)后获得的一种或多种病毒；
[0125]
(iv)与第一双链dna病毒物种相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒；和/或
[0126]
(v)与其它双链dna病毒物种之一相同科、属或物种的一种或多种野生型病毒。
[0127]
分离病毒的方法是本领域熟知的(如cromeans tl,lu x,erdman dd,humphrey cd,hill vr.开发腺病毒40和41的噬菌斑测定(development of plaque assays for adenoviruses40and 41).《病毒学方法杂志(j.virol.methods.)》.2008；151(1):140-145.doi:10.1016/j.jviromet.2008.03.007).
[0128]
优选地，包括至少1％(例如1％至5％或5％至10％)的这些另外的病毒。
[0129]
在一些实施例中，在本发明的一个或多个步骤之前、期间或之后对病毒进行诱变。这进一步促进了病毒文库内的多样化。
[0130]
这种进一步的多样化方法在本领域中是熟知的(例如wechman s.l.等人“通过重复的uv照射和癌症选择开发具有增强传播能力的溶瘤性腺病毒(development of an oncolytic adenovirus with enhanced spread ability through repeated uv irradiation and cancer selection)”.《病毒(viruses)》.2016；8:6.doi:10.3390/v8060167)。
[0131]
优选地，诱变是通过uv照射。这可用于诱导病毒基因组内的突变和/或诱导可促进病毒间重组的dna断裂。
[0132]
如本文所用，术语“病毒文库”是指具有不同基因组序列的病毒的集合或混合物。在一些实施例中，“文库”可包含具有野生型病毒基因组序列的病毒，包括不同的野生型亚组或血清型基因组序列。例如，文库可包括由来自不同病毒基因组的核酸序列的组合组成的病毒基因组。
[0133]
病毒基因组序列可以是核酸序列。
[0134]“文库”还可以包含与修饰的、重组的或突变的病毒基因组序列组合的野生型基因组序列，其中病毒基因组序列不同于天然存在的或“野生型”基因组序列。
[0135]
优选地，当与在本文所述的方法中用作起始点的病毒相比时，本发明的方法生成具有至少1个新重组病毒基因组(包含至少一个新重组事件)，优选多于1个新重组病毒基因组的多样性的文库。生物信息学分析可用于测量新的重组事件并将测序的病毒文库输出物与公开的(genbank)野生型人病毒血清型进行比对。突变/dna交换或重组事件的数目越高，文库中的多样性越大。
[0136]
如本文所用，“新重组事件”意指核酸从一种病毒血清型重组到另一种病毒血清型，其中所得病毒基因组与天然存在或“野生型”基因组序列相差至少一个核苷酸。
[0137]
在另一方面，本发明提供通过根据本发明的任何方面或实施例的方法获得或可获得的文库。
[0138]
本发明还提供了通过根据本发明的任何方面或实施例的方法获得或可获得的嵌合病毒，优选嵌合腺病毒。
[0139]
鉴于本公开内容，本发明的各种其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本说明书中提及的所有文献通过引用整体并入本文。
[0140]
此处使用的“和/或”应被视为具体揭示两个特定特征或组分中的每一者，无论是否具有另一个。例如，“a和/或b”应被视为具体揭示(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一者，就像他们每一者在本文中单独陈述一样。
[0141]
除非上下文另有指示，否则上文陈述的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施例，且同等地适用于所描述的所有方面和实施例。
[0142]
本领域技术人员还将理解，尽管已经参考几个实施例通过示例描述了本发明，但是本发明不限于所公开的实施例，并且在不脱离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下可以构造替换实施例。
[0143]
术语“包含”涵盖“包括”以及“由
……
组成”，例如“包含”x的组合物可以仅由x组成或可以包括其它物质，例如x+y。
[0144]
以上公开的所有数字和范围可以以一定量变化。每当公开具有下限和上限的数值范围时，具体公开落入该范围内的任何数值和任何包括的范围。特别地，本文公开的每个数值范围(形式为“从约a至约b”，或等同地，“从约a至b”，或等同地，“从约a-b”)应理解为阐述涵盖在更宽数值范围内的每个数值和范围。
[0145]
所阐述的每个参考文献的公开内容通过引用整体地具体地并入本文。
附图说明
[0146]
图1.1.在用200vp/细胞的adb、adc或add病毒文库感染a549、ht29、hek293、hct116、skov3和mm1s细胞后第0、1、3、6天通过qpcr(n＝4)测量病毒基因组复制。
[0147]
图1.2.多次传代中ad物种比例的变化表明，当ad物种在a549细胞中一起传代时，病毒多样性会崩溃。
[0148]
图1.3.汇集细胞系可有助于多样化。
[0149]
图2.1.通过qpcr定量三轮感染的病毒基因组。ht29细胞用200vp/细胞的adc或add病毒文库感染，或用200vp/细胞的adc或add病毒文库共同感染3轮。
[0150]
图2.2.不同细胞系中的病毒竞争导致独特的物种分布。
[0151]
图2.3.产生病毒文库的现有技术方法导致多样性丧失。
[0152]
图3.1.与单阶段的多样化(现有技术)相比，在逐步多样化方法(阶段1)中检测到物种间嵌合体的速率更高。逐步多样化方法的阶段1是来自组合的每个细胞系的输出物的所有ad-b、c、d嵌合病毒的总和。嵌合读段％是所有下一代测序(ngs，illumina)读段中出现重组断点的百分比。
[0153]
图3.2.与单阶段多样化(现有技术)相比，逐步多样化方法促进腺病毒嵌合体亲本
对的广泛参与。
[0154]
图3.3.逐步多样化方法产生重组位点跨基因组的的嵌合体。对于逐步多样化方法，adc嵌合体重组位点的位置跨越基因组，而对于单阶段多样化(现有技术)没有检测到。
[0155]
图3.4.证实adb嵌合体重组位点跨腺病毒基因组的测序读段的数量。两种代表性ad-b血清型(在下图中表示为adb.1和adb.2)及其嵌合体的分析突出了使用每种方法产生的多样性水平。证据证明了在多样化方法的阶段1和阶段2期间跨病毒基因组发生的adb.1/adb.2重组事件的速率和类型不同。在阶段1期间检测到的ad基因组缺失的程度大于阶段2。(i)使用合成长读段测序方法(通过条形码标记从相同病毒基因组重建illumina读段)产生数据。(ii)使用短illumina读段产生数据。
[0156]
图4.1.在ht29细胞或hct116细胞中对add文库进行传代后检测的add嵌合体速率的图。使用合成长读段测序检测嵌合体。
[0157]
图4.2.在a549细胞或hct116细胞中对adb/c文库进行传代后检测的adb和adc嵌合体速率的图。使用短读段测序检测嵌合体。
[0158]
图4.3.在a549和hct116细胞中感染ad-b文库后，证实adb嵌合体断点跨腺病毒基因组的测序读段的数量。
[0159]
图5.1.跨基因组的ad血清型之间的序列相似性。
[0160]
图5.2.hsv1分离物之间的序列相似性。水平虚线表示0.5％的序列差异(沿着来自其共同祖先的每个分支0.25％)，方框表示分配给相同病毒株的分离物。
[0161]
图5.3.与hsv-1毒株17相比，基因组中的序列相似性。
[0162]
图5.4.痘苗病毒株和其它正痘病毒物种之间的序列相似性。水平虚线表示0.5％的序列差异(沿着来自其共同祖先的每个分支0.25％)，方框表示分配给相同病毒株的克隆。(wr＝西部储备(western reserve)，cop＝哥本哈根(copenhagen))。
[0163]
图5.5.与西部储备痘苗相比，基因组中的序列相似性。
[0164]
实例
[0165]
通过以下实例进一步说明本发明，除非另有说明，其中份数和百分数均按重量计，并且度数为摄氏度。应当理解的是，尽管这些实例说明了本发明的优选实施例，但是其仅仅为了举例说明。通过以上讨论和这些实例，本领域的技术人员可以确定本发明的必要特征，并且可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明进行各种改变和修改，以使本发明适合各种用途和条件。因此，除了本文示出和描述的那些之外，根据以上描述本发明的各种修改对于本领域中技术人员将是显而易见的。这种修改也旨在落入所附权利要求的范围内。
[0166]
实例1：病毒在不同细胞系中的优先生长
[0167]
病毒制备
[0168]
本研究中包括来自ad物种b(adb)、adc、add、ade、adf和adg的野生型人腺病毒(ad)血清型(robinson cm等人，人类腺病毒的分子进化(molecular evolution of human adenoviruses).《科学报告(sci.rep.)》2013；3:1812)。对每种ad血清型进行噬斑纯化，并通过全基因组测序或在1kb e2b区域上进行sanger测序验证单个分离物，发现与相应的genbank id条目正确对齐。在hek293细胞上通过tcid50扩增和滴定病毒。根据它们的ad物种(例如ad1、ad2、ad5、ad6＝adc病毒文库)汇集每种血清型的相同感染性颗粒，并使用cscl
梯度通过双带纯化以产生物种特异性ad文库(例如adb、adc、add文库)。
[0169]
了解病毒复制动力学
[0170]
在一组人癌细胞系(a549、ht29、hek293、hct116、skov3和mm1s细胞，获自atcc)中用adb、adc和add病毒文库进行时程感染。在含有10％fbs的dmem中在37℃、5％co2下培养a549、ht29、skov3和hek293细胞。在含有10％fbs的rpmi-1640中在37℃、5％co2下培养hct116和mm1s细胞。将细胞接种24小时，然后用adb、adc或add病毒文库感染，并在37℃、5％co2下孵育。在感染后0、1、3、6至7天收获样品(病毒感染的细胞和组合的上清液)，用于病毒基因组复制研究。使用ad物种特异性引物通过qpcr定量病毒基因组(life technologies公司)：
[0171]
adb正向gagttggctttaagtttaatgagc(seq id no:1)、
[0172]
adb反向tgaggcctgataaacagtat(seq id no:2)、
[0173]
adc正向gcttaatgaccagacaccgt(seq id no:3)、
[0174]
adc反向ggtatatgcaaaggtggca(seq id no:4)、
[0175]
add正向gggatgatgaccgagctg(seq id no:5)、
[0176]
add反向cagacatgcctgctacat(seq id no:6)；
[0177]
并且数据表示为随时间变化的每个ad物种的总病毒基因组(图1)。
[0178]
图1.1中的数据证明来自不同物种(例如adb、c、d)的腺病毒倾向于在不同细胞系中表现优选的感染和/或复制效率。例如，adc病毒在mm1s和hek293细胞中的复制比add病毒快得多。adc病毒在3天时达到最大基因组，而add病毒仍然低》10倍，表明与adc病毒相比，在该时间范围内在这些细胞系中add重组事件的机会显著减少。
[0179]
在所测试的细胞系中，hek293细胞优先支持adc》adb》add的复制；mm1s支持adc》add》adb；a549支持adc/b》add；hct116支持adb》adc》add；skov3支持adb》adc/d；ht29在第6天支持add》adb/c的复制。总体上a549具有最高的病毒复制水平，ht29/skov3细胞支持的水平最低。
[0180]
评估由来自三个物种的野生型(wt)腺病毒库组成的输入病毒文库跨多次传代的物种分布。将等滴度的每种wt腺病毒加入到输入文库中(天然存在的ad-d病毒多于ad-b/c)，因此得到图1.2中的物种分布。该文库以高moi在a549细胞中感染并传代至多4次，每次以高moi在新鲜细胞单层上传代。在每个阶段，通过qpcr分析adb、adc和add物种的滴度，对每一代的每个物种的相对比例和三个物种的总滴度作图。尽管在每一代的输入wt病毒文库中出现刺突，腺病毒物种的分布通过第二代显著向adb移动。
[0181]
为了解决图1.3中观察到的单一ad物种优势和病毒多样性崩溃，将多个不同的细胞系接种到相同的培养容器中，并用adb、adc和add wt文库感染。单次传代后，通过qpcr分析释放到上清液中的病毒的物种分布，并对每种实验条件作图。与a549细胞不同，汇集细胞的输出物在组成物种的数目上具有相对相等的分布，表明使用不同细胞系的输出物产生病毒多样性的重要性。
[0182]
实例2：ht29细胞系中的病毒竞争
[0183]
将ht29细胞以70％汇合率接种在t25烧瓶中的10％培养基中，并在37℃、5％co2下孵育。第二天，细胞用200vp/细胞的adc或add病毒文库感染，或用200vp/细胞的adc和add病毒文库共同感染。感染后在cpe征象时收获感染的细胞和上清液，暴露于1个冻融循环，然后
用作接种体用于ht29细胞上的下一轮感染。该过程重复三次。
[0184]
使用ad物种特异性引物通过qpcr定量来自第三轮感染的上清液中的病毒基因组：
[0185]
adc正向gcttaatgaccagacaccgt(seq id no:3)、
[0186]
adc反向ggtatatgcaaaggtggca(seq id no:4)、
[0187]
add正向gggatgatgaccgagctg(seq id no:5)、
[0188]
add反向cagacatgcctgctacat(seq id no:6)。
[0189]
数据如图2所示，表明当细胞与不同的ad物种共同感染时，一种病毒物种将在多轮感染中超过另一种；并且独立感染的细胞中的病毒基因组的量将显著高于用adc和add文库共同感染的细胞，即在不存在其它物种的情况下从每轮中回收更多的adc病毒。因为只有进入细胞或同时复制的那些病毒将具有机会与来自尽可能多的血清型和物种的代表重组，以便产生多样化文库，图1和图2中的数据证明每种腺病毒物种应在其优选的细胞系(即允许给定ad物种的最大病毒基因组扩增的细胞系)上单独生长。然后可以汇集以这种方式扩增的病毒物种以提供含有所有野生型、重组体及其变体的文库。
[0190]
为了研究adb、adc和add物种的转录和病毒释放动力学，用三种细胞系(a549、hct和ht29)建立时程。接种细胞，并以高moi用由相等血清型加权的adb、adc和add wt物种(称为wt池输入)形成的病毒池感染(类似于图1.2)。对于感染的细胞系，以适当的vg/细胞建立感染。在感染后的多个时间点(14小时、24小时、38小时、48小时、96小时和144小时)收获每个细胞系的孔以及用作0小时对照的原始感染材料的样品。在每个时间点，通过qpcr在收获的上清液中测定每种物种的滴度，其示出在图2.2中。
[0191]
图2.2的顶行示出了用相同血清型加权的包含adb、adc和add病毒文库的汇集感染后的上清液滴度。顶行、a、b和c分别表示在a549、hct116和ht29细胞中感染后的病毒滴度。数据支持使用多种细胞系来促进不同ad物种中的重组事件，这是由于不同细胞系中物种之间的感染和复制效率不同。底行示出了通过每个adb、adc或add总基因组相对于所有三个物种的总基因组的比例计算的物种分布。由于细胞系之间相对比例存在明显差异，数据支持使用不同的细胞系。
[0192]
作为与通过重组产生病毒文库的现有技术方法的对比，我们的wt病毒输入池(adb、c和d文库的组合)根据现有技术中详述的方法传代(kuhn等人，2008，同上)。简言之，用200vg/细胞的病毒池感染ht29细胞。通过qpcr滴定输出病毒，并在相同条件下建立第二轮感染。在输入、第1代和第2代的ad物种分布图显示，adc的丰度几乎完全崩溃，将该组从可用的重组目标池中移除。因此，需要使用在其中adc能够竞争的多个细胞系来提供用于重组的最多的靶标，并因此提供最大的多样性。
[0193]
实例3：单阶段病毒多样化和逐步病毒多样化技术的比较。
[0194]
单阶段病毒多样化
[0195]
将adb的3个血清型和adc、add、ade和adf各1个血清型(即使用类似于kuhn等人，2008，同上作为对比)汇集起来，在t175烧瓶中ht29细胞的亚融合培养物上传代。在37℃、5％co2下，用2％培养基中的200vp/细胞的汇集后的ad对细胞进行感染。在感染后48至96小时从这些感染的培养物收获病毒裂解物，然后在-80℃冷冻。病毒感染的细胞经历3次冻融循环，释放的病毒用作感染性接种物，用于随后在亚汇合培养物上传代。在感染后48至72小时从这些培养物中收获病毒裂解物，并在cscl密度梯度上纯化前进行3次冻融循环。纯化的
病毒被认为是来自该方法的输出“多样化文库”。
[0196]
逐步病毒多样化
[0197]
阶段1－促进更多的种内重组事件。
[0198]
将adb(》6x adb血清型)、adc(4x adc)或add(》29x 10add血清型)的病毒组文库在37℃、5％co2下在10％培养基中的癌细胞系(a549、ht29、hct116)的亚汇合培养物上独立传代。在感染前24小时将细胞以60％至70％汇合率接种在t25培养瓶中。用合适vp/细胞的adb、adc或add文库感染细胞。在细胞病变效应(cpe)后，收获特定ad物种的释放病毒。在一个冻融循环后，将来自第一轮病毒感染的澄清上清液加入到在10％培养基中的t75烧瓶中的癌细胞的亚汇合层中；再次独立传代每种ad物种。选择的上清液的体积是在2至5天的下一轮感染中产生cpe征象的体积。
[0199]
将t75烧瓶上的感染循环重复至多5次以在ad物种内引入重组事件。使用物种特异性引物通过qpcr定量每轮感染的输出病毒基因组。在ad物种特异性的基础上汇集各细胞系的输出物，并在适当时通过cscl密度梯度纯化。纯化的病毒一起被认为是来自阶段1的输出“多样化文库”。
[0200]
阶段2－为新的种内和种间重组事件提供机会。
[0201]
汇集来自阶段1的相同病毒基因组(即adb、adc、add野生型及其变体)。病毒种文库在10％培养基中的癌细胞系(a549、ht29、hct116)的亚融合培养物上一起传代。在感染前24小时，在t75培养瓶中以60％至70％汇合率分裂细胞。用合适vp/细胞的汇集后阶段1病毒文库感染细胞。在cpe时，收获释放的病毒。在一个冻融循环后，将来自第一轮病毒感染的澄清上清液加入到在10％培养基中的t75烧瓶中的癌细胞的亚汇合层中。选择的上清液的体积是在2至5天的下一轮感染中产生cpe征象的体积。将t75烧瓶上的感染循环重复至多5次以促进ad物种内和ad物种间的重组事件。汇集各细胞系的输出物，适当时通过cscl密度梯度纯化。纯化的病毒池被认为是来自阶段2的输出“多样化库”。
[0202]
在“单步病毒多样化”中使用的病毒库中，有3种血清型来自adb，和来自adc、add、ade和adf各1种血清型。在“逐步文库多样化”中，存在来自adb、adc和add的多种血清型。
[0203]
通过该文库中病毒基因组的高通量下一代测序(ngs)确定病毒文库关于病毒重组的多样性。将序列与包含每种已知wt病毒的序列的参考组进行比对。使用blast搜索确认映射到多个参考的读段是嵌合的。
[0204]
在扩大病毒变异体的数量和类型、使更多的变异体参与并防止特定病毒组的显性方面，发现逐步多样化方法优于现有技术方法(图3.1和3.2)。
[0205]
在多样化方法阶段1之后检测到种内ad嵌合体的速率高于(总嵌合序列读段％高于，因此重组速率高于)使用现有技术方法或匹配的ad-b、ad-c或ad-d wt文库库输入(不应用多样化方法)检测到的(图3.1)。在组合所有输出物(即在这种情况下，在a549、hct116、ht29中产生的adb、c、d嵌合体的总和)之前，多样化方法阶段1需要在不同细胞系中独立传代ad物种。这通过在将输出物与阶段2过程和wt池输入进行组合之前，使用在它们的优选细胞类型中具有更大序列同源性和相似感染动力学(即每种物种内的ad)的病毒共同感染以使感染同步而增加了每种ad物种内重组体的数目。该方法还使得更多的ad血清型有助于重组事件，并因此增加整体文库多样性。这与现有技术的方法相反，在现有技术的方法中，汇集不同的ad物种并用于感染一个细胞系，导致ad-b病毒优势和病毒多样性崩溃(图3.1和图
glycoprotein c of hsv-1and hsv-2in viral binding may contribute to serotype differences in cell tropism)”,《病毒学(virology)》,214,29
–
39(1995)；herold等人,“单纯疱疹病毒1型和2型对改性肝素化合物的敏感性的差异表明病毒进入的血清型差异(differences in the susceptibility ofherpes simplex virus types 1and 2to modified heparin compounds suggest serotype differences in viral entry)”,《病毒学杂志(journal of virology)》,第70卷,第6期,1996；mcclain等人,“单纯疱疹病毒1型进入的细胞特异性动力学和效率由两个不同的附着阶段决定(cell-specific kinetics and efficiency of herpes simplex virus type 1 entry are determined by two distinct phases of attachment)”,《病毒学(virology)》,第198卷,第2期,1994年2月1日,第690-702页；gates等人,“高含量的正病毒感染性和中和试验的开发(development of a high-content orthopoxvirus infectivity and neutralization assays)”，《公共科学图书馆
·
综合(plos one)》10(10):e0138836,2015)。因此，来自相同物种的hsv和vv血清型/毒株更可能重组，因此逐步多样化方法，即在与其它物种组合之前在它们优选的细胞系上共同感染来自相同物种的病毒，将增加重组事件和总体病毒多样性的机会，使得更多的病毒类型参与重组并增强病毒文库的多样性。
[0216]
应用这种逐步多样化方法来生成hsv和vv的多样化文库。得到的多样化hsv和vv文库用于鉴定用于癌症、疫苗或基因治疗应用的治疗剂。
[0217]
单纯疱疹病毒
[0218]
hsv1物种内的dna序列相似性较高(图5.2)，具有显著的dna同源性片段(图5.3对比hsv1毒株17和h12)，表明具有充分的机会发生重组事件，类似于实施例1至4中腺病毒物种内观察到的那些。图5.2和图5.3证明不同hsv物种之间的序列相似性显著低于物种内的序列相似性，表明发生重组的机会较少。
[0219]
hsv逐步病毒多样化
[0220]
来自hsv-1和hsv-2物种的野生型hsv毒株获自atcc或其它商业供应商，并且如先前所述(例如通过grosche等人.,单纯疱疹病毒1型的繁殖、滴定和单步生长曲线(herpes simplex virus type 1 propagation,titration and single-step growth curves),《生物实验方法(bio protoc.)》2019年12月5日；9(23):e3441.)，通过全基因组测序和与相应genbank id条目正确对齐来验证每个单一分离株。
[0221]
阶段1－促进更多的种内重组事件
[0222]
hsv-1毒株的病毒文库(包括kos、e06、f、h129、mckrae、hf10命名的hsv1毒株；图5.2)或hsv2毒株(包括seattle、hg52、186、ul39、ul29)在含有10％fcs的培养基中在永生化细胞系(bhk(幼仓鼠肾)、vero细胞(非洲绿猴肾)、hela(人宫颈癌)或优选的细胞系)上独立传代。在感染前24小时接种细胞以在接种时达到70％至90％的汇合。将细胞用hsv-1毒株文库或hsv-2毒株文库独立地以高moi在具有20mm hepes的rpmi1640中在室温下接种1小时，然后更换培养基并在37℃、5％ co2下孵育。一旦出现cpe征象就收获病毒。在一个冻融循环后，将来自第一轮病毒感染的澄清上清液加入到培养基中的t75烧瓶中的亚汇合细胞层中；每个hsv物种再次独立传代。选择的上清液体积是在《2至5天的下一轮感染中产生cpe征象的体积。
[0223]
将t75烧瓶上的感染循环重复至多5次以在hsv物种内引入重组事件。最后一轮感
染的输出物被认为是来自阶段1的输出“多样化文库”。
[0224]
阶段2－为新型种内和种间重组事件提供机会
[0225]
将来自阶段1的hsv-1输出多样化文库与野生型hsv-1毒株、hsv-2毒株文库和/或来自阶段1的hsv-2输出多样化文库汇集，并在bhk-21细胞、vero细胞、hela细胞和优选的细胞系上一起传代。在感染前24小时接种细胞以在接种时达到70％至95％的汇合。将细胞用hsv-1和hsv-2的汇集文库以高moi在具有20mm hepes的rpmi1640中在室温下接种1小时，然后更换培养基并在37℃、5％ co2下孵育。在cpe时收获病毒。在一个冻融循环后，将来自第一轮病毒感染的澄清上清液加入到培养基中的t75烧瓶中的亚汇合细胞层中。所选择的上清液的体积是在2至5天的下一轮感染中产生细胞病变效应(cpe)的体积。将t75烧瓶上的感染循环重复至多5次以在hsv物种内引入重组事件。
[0226]
通过该文库中病毒基因组的高通量下一代测序(ngs)确定病毒文库关于病毒重组的多样性。将序列与包含每种已知wt病毒的序列的参考组进行比对。使用blast搜索确认映射到多个参考的读段是嵌合的。
[0227]
痘苗病毒
[0228]
痘苗病毒物种内的dna序列相似性较高(图5.4)，具有显著的dna同源性片段(图5.5对比西部储备痘苗和dryvax)，表明具有充分的机会发生重组事件，类似于上述实施例中在腺病毒物种内观察到的那些。不同正痘病毒种之间的序列相似性较低，表明发生的重组事件效率较低。
[0229]
痘苗病毒的逐步病毒性多样化
[0230]
正痘病毒(包括痘苗病毒株)获自atcc，并且如所述纯化和繁殖单个病毒斑(例如在以下中，cotter等人.,“细胞培养物和疫苗病毒储备的制备(preparation of cell cultures and vaccinia virus stocks)”,《微生物学当代实验方法(preparation of cell cultures and vaccinia virus stocks)》2015年第3期；39:14a.3.1-14a.3.18 3)。通过全基因组测序和与相应genbank id条目的正确对齐来验证每个分离株。
[0231]
阶段1－促进更多的种内重组事件
[0232]
痘苗病毒株(图5.4)或来自其它正痘病毒种的病毒株(图5.4和图5.5)的病毒文库在含有10％fcs的培养基中在多种永生化细胞系(例如bs-c-1细胞、hela细胞、lovo细胞或优选的细胞系)上独立传代。将细胞用痘苗病毒株或其它正痘病毒文库以高moi在含有2.5％fbs的培养基中在37℃、5％co2下接种2小时。一旦出现cpe征象，通过三次冻融循环收获病毒以裂解细胞。将从第一轮感染收获的病毒在冰上超声处理，并用于在第二轮感染中以moi接种hela细胞，将在约3天内产生cpe征象。选择的上清液的体积是在《3天的下一轮感染中产生cpe的体积。将培养瓶中的感染循环重复至多5次，以在痘苗病毒和其它正痘病毒种中引入重组事件。
[0233]
阶段2－为新型种内和种间重组事件提供机会
[0234]
将来自阶段1的痘苗病毒输出多样化文库与野生型痘苗病毒株、其它正痘病毒株的文库和/或来自阶段1的正痘病毒输出多样化文库以相同基因组汇集，并在多个细胞系上一起传代。
[0235]
一旦出现cpe征象，通过三次冻融循环收获病毒以裂解细胞。将从第一轮感染收获的病毒在冰上超声处理，并用于以moi接种第二轮感染中的细胞，将在约3天内产生cpe。选
择的上清液体积是在《3天的下一轮感染中产生cpe征象的体积。
[0236]
将培养瓶中的该感染循环重复至多5次，以在痘苗病毒和其它正痘病毒种内和之间引入重组事件。
[0237]
通过该文库中病毒基因组的高通量下一代测序(ngs)确定病毒文库关于病毒重组的多样性。将序列与包含每种已知wt病毒的序列的参考组进行比对。使用blast搜索确认映射到多个参考的读段是嵌合的。
[0238]
序列表自由文本
[0239]
《210》1
[0240]
《223》adb正向引物
[0241]
《210》2
[0242]
《223》adb反向引物
[0243]
《210》3
[0244]
《223》adc正向引物
[0245]
《210》4
[0246]
《223》adc反向引物
[0247]
《210》5
[0248]
《223》add正向引物
[0249]
《210》6
[0250]
《223》add反向引物