用于检测新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的工具和方法与流程

本发明涉及sars-cov-2诊断领域的工具和方法。相应地，本发明提供了一种pcr方法，其包括用用于sars-cov-2rdrp基因的至少引物核苷酸序列、用于sars-cov-2e基因的至少引物核苷酸序列和用于人rna酶p基因的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。所述pcr方法可进一步包括用用于独特掺入(spike)rna的至少引物核苷酸序列进行扩增步骤，优选同时扩增步骤。本发明还提供了一种试剂盒，其包含用于实施本发明的pcr方法的引物和探针。本发明进一步涉及用于sars-cov-2rdrp基因的引物核苷酸序列、用于sars-cov-2e基因的引物核苷酸序列和用于人rna酶p基因的引物核苷酸序列的用途，用于(i)样品中sars-cov-2的体外检测，(ii)受试者的sars-cov-2感染的体外检测，(iii)血液样品的sars-cov-2污染的体外检测，或(iv)体外监测sars-cov-2的治疗。本发明进一步涉及用于检测甲型流感病毒(iav)和乙型流感病毒(ibv)和/或区分sars-cov-2与最常见的季节性流感(例如iav和/或ibv)的工具和方法。本发明的pcr方法、试剂盒和用途克服了已知与多重pcr方法、试剂盒或用途相关的某些特异性靶标、引物二聚体的不均匀扩增/折叠、假阴性、低灵敏度和特异性和/或优先扩增，以及减少了假阳性和假阴性读出。

背景技术：

1、who宣布2019-ncov的爆发是影响全世界、因此影响数百万人的大流行病。

2、在促进公共健康干预的最优先事项之中是可靠的实验室诊断。为了给研究人员和临床医生提供2019-ncov诊断方案，who公布了应用于欧洲、美国、日本、中国或泰国的不同方案(https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/whoinhouseassays.pdf？sfvrsn＝de3a76aa_2)。

3、它们全部基于核酸扩增以便检测2019-ncov，如果样品中存在的话。who公布的方案使用2019-ncov的不同基因靶标。例如，中国cdc致力于orf1ab和n作为基因靶标；法国institut pasteur致力于rdrp内的两个基因靶标；us cdc致力于检测病毒n基因内的三个靶标；日本国家传染病研究所致力于全景和多个靶标以及编码刺突蛋白的基因；中国香港sar的hku致力于orf1b-nsp14和n基因；泰国国立卫生研究所致力于n基因，德国charité致力于rdrp和n基因。所有这些方案都应用定量/实时rt-pcr测定(qrt-pcr)。

4、然而，这些测定中的一些可能具有局限性，如vogels等人(2020)；冷泉港实验室，bmj yale所评估的(https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108)。迄今，通过他们的比较研究，vogels等人旨在帮助其它实验室选择用于检测2019-ncov的合适测定，该2019-ncov同时命名为sars-cov-2(gorbalenya等人(2020)，nat.microbiol.(5)4,536-544，doi:10.1038/s41564-020-0695-z)，因为他们观察到在qrt-pcr中应用的几个引物-探针组可以与sars-cov-2-阴性鼻咽拭子交叉反应，其它可能有些非特异性，等等。

5、全面的sars-cov-2测试策略是各国通过促进早期检测和实施适当的流行病学措施来减轻冠状病毒疾病2019(covid-19)传播的重要工具。用于鉴定sars-cov-2的金标准需要使用rt-qpcr来检测生物样本中一个或多个病毒基因的存在。该方法具有无与伦比的灵敏度，在反应中检测低至病毒rna的单个拷贝，并且可以容易地在诊断实验室中使用。在第一个sars-cov-2基因组序列公布后不久，几个参考实验室和公共卫生当局提供了第一个公开可获得的rt-qpcr方案。这些方案有助于允许各国快速实施全面的检测策略，并且经常作为商业开发具有额外创新的更精简检验的支柱。目前，已经开发了数百种rt-qpcr检验来检测sars-cov-2，并且比较这些检验的功效的研究揭示了在样本输入、基因靶标、检测工作流程、特异性和灵敏度方面的重要差异。

6、由柏林的charité病毒学研究所开发的rt-qpcr检验是第一批公布的方案之一(corman等人(2020)，euro surveillance 25(3))并且由who共享，在该大流行病的早期在整个欧洲广泛使用。在开发之时，可公开获得很少的sars-cov-2序列，并且病毒分离物和阳性患者样品很少，因此作者设计了一种初始筛选测定，其有意与sars-cov病毒rna(来自2003年的爆发)交叉反应。靶向rdrp基因的第二确认测定含有将sars-cov-2与sars-cov区分开的两种探针。然而，rdrp引物和sars-cov-2特异性探针在被认为显示遗传变异性的区域中含有几个简并碱基。作者还指出rdrp反向引物的设计由于其低的预计解链温度而可能降低反应效率(corman vm,drosten c.authors’response:sars-cov-2detection byreal-time rt-pcr.euro surveill.2020年5月28日)。虽然该方案在诊断检测的早期提供了明确的益处，但关于该检验的性能出现了各种问题，主要是rdrp测定的灵敏度降低(nalla ak等人，2020,comparative performance of sars-cov-2detection assaysusing seven different primer-probe sets and one assay kit.journal of clinicalmicrobiology；vogels cbf等人，2020,analytical sensitivity and efficiencycomparisons of sars-cov-2rt–qpcr primer–probe sets.naturemicrobiology.2020oct；5(10):1299–305；jung y等人，2020comparative analysis ofprimer–probe sets for rt-qpcr of covid-19causative virus(sars-cov-2).acsinfect dis.2020年8月11日；pillonel t等人，2020.letter to the editor:sars-cov-2detection by real-time rt-pcr.euro surveill.2020年5月28日；etievant s等人，2020performance assessment of sars-cov-2pcr assays developed by who referrallaboratories.j clin med[internet].2020年6月16日)。

7、相应地，尽管有who或其他人例如corman等人(2020),euro surveillance25(3),doi:10.2807/1560-7917.es.2020.25.3.2000045)公布的方案，仍然需要改进的可靠且准确的诊断测定以促进临床和公共健康干预。

8、因此，本技术所面临的技术问题是满足这种需要。通过提供权利要求中反映的、说明书中描述的以及随后的实施例和附图中示出的实施方案，解决了该技术问题。

9、简言之，基于原始charité方案，在本发明的过程中开发了几种改进的rt-qpcr，其解决了原始方案的限制。此外，通过引入内部对照、通过多重化使检验工作流程简化和开发技术创新诸如双探针以增加相应pcr方法的灵敏度和特异性两者，对测定进行了显着改进。开发了检测甲型流感和乙型流感的其它测定，从而提供了有用的诊断工具以将sars-cov-2与最常见的季节性流感区分开来。本发明的一些工具和方法在室温下稳定长达一个月，从而提供了几种rt-qpcr工具/方法中的消除了对冷链运输和储存需要的一种。

技术实现思路

1、因此，一方面，本发明涉及一种pcr方法，其包括用用于sars-cov-2rdrp的至少引物核苷酸序列、用于sars-cov-2e基因的至少引物核苷酸序列和用于人rna酶p的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤。

2、另一方面，本发明涉及一种pcr方法，其包括

3、(i)第一pcr方法，所述第一pcr方法包括用用于sars-cov-2rdrp的至少引物核苷酸序列和用于人rna酶p的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和/或(其中“和”是优选的)，

4、(ii)第二pcr方法，所述第二pcr方法包括用用于sars-cov-2e基因的至少引物核苷酸序列和用于人rna酶p的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，

5、其中将怀疑包含sars-cov-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的pcr。

6、又一方面，本发明涉及一种pcr方法，其包括

7、(i)第一pcr方法，所述第一pcr方法包括用用于sars-cov2 e基因的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入rna的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；

8、(ii)第二pcr方法，所述第二pcr方法包括用用于sars-cov-2rdrp基因的至少引物核苷酸序列和用于人rna酶p的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤；和

9、(iii)第三pcr方法，所述第三pcr方法包括用用于sars-cov-2rdrp基因的至少引物核苷酸序列、用于sars-cov-2e基因的至少引物核苷酸序列、用于人rna酶p的至少引物核苷酸序列和用于独特掺入rna的至少引物核苷酸序列进行同时扩增步骤，并且进一步包括用于sars-cov-2rdrp基因的独特rna、用于sars-cov-2e基因的独特rna、用于人rna酶p的独特rna，

10、其中将怀疑包含sars-cov-2核酸的相同来源材料用于(i)和(ii)的pcr方法，和

11、其中(iii)的pcr方法进一步包括作为阳性对照的用于sars-cov-2rdrp基因的核糖核酸、用于sars-cov-2e基因的核糖核酸、用于人rna酶p的核糖核酸和用于独特掺入rna的核糖核酸。

12、此外，本发明提供一种pcr方法，其包括至少用seq id nos:1和2中示出的引物核苷酸序列进行扩增步骤。

13、本发明还涉及一种试剂盒，其至少包含seq id nos:1和2中示出的引物核苷酸序列，任选地包含seq id no:3中示出的核苷酸序列的探针，和任选地用于实施pcr扩增步骤的工具。

14、最后，本发明涉及seq id nos:1和2中示出的引物核苷酸序列用于以下的用途

15、(i)样品中sars-cov-2的体外检测，

16、(ii)受试者的sars-cov-2感染的体外检测，

17、(iii)血液样品的sars-cov-2污染的体外检测，或

18、(iv)体外监测sars-cov-2的治疗。

19、核苷酸序列的简要描述

20、seq id no:1：5’-gtgaaatggtcatgtgtggcgg

21、用于sars-cov-2rdrp的正向引物核苷酸序列

22、seq id no 2：5’-cgtgacagcttgacaaatgttaaaaac

23、用于sars-cov-2rdrp的反向引物核苷酸序列

24、seq id no:3：5’-caggtggaacctcatcaggagatgc

25、用于sars-cov-2rdrp的探针，优选地在其5’端包含fam或hex或yy，和优选地在其3’端包含bhq1或bhq2

26、seq id no:4：5’-acaggtacgttaatagttaatagcgt

27、用于sars-cov-2e基因的正向引物核苷酸序列

28、seq id no:5：5’-atattgcagcagtacgcacaca

29、用于sars-cov-2e基因的反向引物核苷酸序列

30、seq id no:6：5’-acactagccatccttactgcgcttcg

31、用于sars-cov-2e基因的探针，优选地在其5’端包含fam或hex或yy，和优选地在其3’端包含bhq1或bhq2

32、seq id no:7：5’-agatttggacctgcgagcg

33、用于人rna酶p的正向引物核苷酸序列

34、seq id no:8:5’-gagcggctgtctccacaagt

35、用于人rna酶p的反向引物核苷酸序列

36、seq id no:9：5’-ttctgacctgaaggctctgcgcg

37、用于人rna酶p的探针，优选地在其5’端包含hex或yy或cy5，和优选地在其3’端包含bhq1或bhq2或bhq3

38、seq id no:10：

39、5’

40、rargrurgrarararurgrgrurcrarurgrurgrurgrgrcrgrgrarcrcrargrgrurgrgr

41、ararcrcrurcrarurcrargrgrargrarurgrcrcrargrurururururararcrarurur

42、urgrurcrarargrcrurgrurcrarcrgrg

43、用于sars-cov-2rdrp的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)seq idno:11：

44、5‘rargrarcrargrgrurarcrgrururararurargrururararurargrcrgrurururar crarcrurargrcrcrarurcrcrururarcrurgrcrgrcrururcrgrarururgrurgrurg rcrgrurarcrurgrcrurgrcrararuraru

45、用于sars-cov-2e基因的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)

46、seq id no:12：

47、5’

48、rgrcrargrarurururgrgrarcrcrurgrcrgrargrcrgrgrgrururcrurgrarcrcrur

49、grarargrgrcrurcrurgrcrgrcrgrgrarcrururgrurgrgrargrarcrargrcrcrgrc

50、rurc

51、用于人rna酶p的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)

52、seq id no:13：5’-caaatgttaaaaacactattagcata

53、用于sars-cov-2rdrp的反向引物核苷酸序列

54、seq id no:14：5’-gtgaratggtcatgtgtggcgg

55、用于sars-cov-2rdrp的正向引物核苷酸序列(与seq id no.1比较，在seq idno.1中简并核苷酸“r”转变为核苷酸“a”)

56、seq id no:15：5’-caratgttaaasacactattagcata

57、用于sars-cov-2rdrp的反向引物核苷酸序列(与seq id no.13比较，在seq idno.13中简并核苷酸“r”和“s”转变为核苷酸“a”)

58、seq id no:16：5’-ccaggtggwacrtcatcmggtgatgc

59、用于sars-cov-2e基因的探针，优选地在其5’端包含fam，和优选地在其3’端包含bhq1(与seq id no.3比较，在seq id no.3中简并核苷酸“w”转变为核苷酸“a”，简并核苷酸“r”转变为核苷酸“c”，和简并核苷酸“m”转变为核苷酸“a”)

60、seq id no:17：5’-atgcagtgccacattatgcag

61、用于独特掺入rna的正向引物核苷酸序列

62、seq id no:18：5’-agcacatgtagtgccactgg

63、用于独特掺入rna的反向引物核苷酸序列

64、seq id no:19：5’-ccacggttacatccagtggcactaca

65、用于独特掺入rna的探针，优选地在其5’端包含hex或yy或cy5，和优选地在其3’端包含bhq1或bhq2或bhq3

66、seq id no:20：

67、5‘rurarurgrcrargrurgrcrcrarcrarururarurgrcrargrurgrcrcrarcrgrgrururarcrarurcrcrargrurgrgrcrarcrurarcrarurgrurgrcrcrarururarcrarurururarcrarurcrcrargrurgrgrcrarcrurarcrarurgrurgrcru

68、(独特)掺入rna(“r”代表“核糖(核苷酸”)

69、seq id no.21

70、tatgcagtgccacattatgcagtgccacggttacatccagtggcactacatgtgccattacatttacatccagtggcactacatgtgct

71、合成的，例如以生物信息学方式设计的核酸序列，用作用于优选地不存在于人和sars-cov-2中的(独特)掺入rna的模板

72、seq id no:22：5’-gtactcattcgtttcggaagagacag

73、用于sars-cov-2e基因的正向引物核苷酸序列

74、seq id no:23：

75、5‘rarurgrurarcrurcrarururcrgrurururcrgrgrarargrarcrargrururarcrarcrurargrcrcrarurcrcrururarcrurgrcrgrcrururcrgrarururgrurgrurgrcrgrurarcrurgrcrurgrcrararuraru

76、用于sars-cov-2e基因的阳性对照核糖核苷酸(“r”代表“核糖(核苷酸”)

77、

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