经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白的制作方法

本公开涉及经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，如猪胰腺弹性蛋白酶(ppe)前蛋白，其包括可通过肿瘤位点蛋白酶切割的异源蛋白酶切割位点，以及用于治疗疾病如癌症的相关药物组合物和使用方法。相关技术的说明旨在通过使用基因或分子分析优化特定患者群体的效率或治疗益处的精准医疗已在用于癌症治疗方面获得了巨大的吸引力。鉴定(i)赋予发展癌症的风险；(ii)影响肿瘤生长；以及(iii)调节转移的具体基因组异常已经定义了如何诊断癌症，确定了如何开发和实施靶向疗法，并形成了癌症预防策略。癌症中对精准医疗的需求很大程度上基于未能鉴定肿瘤细胞中将其与健康、非癌细胞区分开的可靶向特性。事实上，尽管放射和/或化疗具有有效杀死许多(如果不是大多数)癌细胞的能力，但其功效受到对非癌细胞的细胞毒性效应的严重限制。这些发现证实，快速细胞分裂，即放疗和化疗靶向的特性对于癌细胞来说不够独特，从而无法实现限制广泛副作用所需的特异性。已经示出，某些丝氨酸蛋白酶对癌细胞具有选择性毒性，但对正常细胞或其它健康细胞相对无毒性。然而，本领域中需要鉴定能够具有此类选择性癌细胞毒性的最佳酶，并且改进此类酶的临床效用。

背景技术：

技术实现思路

1、本公开的实施例包含一种经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，其在n端至c端定向上包括信号肽、经修饰的激活肽和肽酶结构域，其中所述经修饰的激活肽包括异源蛋白酶切割位点，所述异源蛋白酶切割位点能通过选自金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶切割。在一些实施例中，所述丝氨酸蛋白酶选自猪胰腺弹性蛋白酶(ppe)、人中性粒细胞弹性蛋白酶(elane)、人组织蛋白酶g(ctsg)和人蛋白酶3(pr3)。

2、在一些实施例中，所述经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白包括与选自表s1的序列至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同并且包括或保留所述异源蛋白酶切割位点的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。

3、在一些实施例中，所述金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶选自基质金属蛋白酶-12(mmp12)、组织蛋白酶d(ctsd)、组织蛋白酶c(ctsd)和组织蛋白酶l(ctsl)。在具体实施例中，所述异源蛋白酶切割位点选自表s3，例如，seq id no:8的mmp12切割位点、seq id no:11的ctsd切割位点、seq id no:13的ctsc切割位点或seq id no:14的ctsl切割位点。

4、在一些实施例中，所述经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白在体外或体内基本上不与丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)结合，任选地其中所述serpin包含α-1抗胰蛋白酶(a1at)。在一些实施例中，经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白在作为其前蛋白形式的丝氨酸蛋白酶时基本上无活性。在一些实施例中，对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割，例如在体内在癌症或肿瘤位点处对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割产生活性肽酶结构域(或活性丝氨酸蛋白酶结构域)，所述活性肽酶结构域相对于所述前蛋白具有增加的丝氨酸蛋白酶活性。在一些实施例中，所述活性肽酶结构域的所述丝氨酸蛋白酶活性相对于所述前蛋白的丝氨酸蛋白酶活性增加约或至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍或更多倍。

5、在一些实施例中，对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割，例如在体内在癌症或肿瘤位点处对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割产生活性肽酶结构域(或活性丝氨酸蛋白酶结构域)，所述活性肽酶结构域相对于所述前蛋白具有增加的癌细胞杀伤活性。在一些实施例中，所述活性肽酶结构域的所述癌细胞杀伤活性相对于所述前蛋白的癌细胞杀伤活性增加约或至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍或更多倍。

6、在一些实施例中：

7、所述丝氨酸蛋白酶是ppe，并且所述活性肽酶结构域包括与seq id no:1的残基31-266至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成；

8、所述丝氨酸蛋白酶是人elane，并且所述活性肽酶结构域包括与seq id no:2的残基30-247至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成；

9、所述丝氨酸蛋白酶是人ctsg，并且所述活性肽酶结构域包括与seq id no:3的残基21-243至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成；或

10、所述丝氨酸蛋白酶是人pr3，并且所述活性肽酶结构域包括与seq id no:4的残基28-248至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。

11、某些实施例包含一种经修饰的猪胰腺弹性蛋白酶(ppe)前蛋白，其在n端至c端定向上包括信号肽、相对于seq id no:6(野生型ppe激活肽)的经修饰的激活肽和ppe肽酶结构域，其中所述经修饰的激活肽基本上不能通过胰蛋白酶切割并且包括能通过选自金属蛋白酶、天冬氨酰蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶切割的异源蛋白酶切割位点。

12、在一些实施例中，所述蛋白酶选自基质金属蛋白酶-12(mmp12)、组织蛋白酶d(ctsd)、组织蛋白酶c(ctsc)和组织蛋白酶l(ctsl)。在一些实施例中，所述异源蛋白酶切割位点包括选自表s3的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。

13、在一些实施例中：

14、所述异源蛋白酶切割位点选自seq id no:8-10并且能通过mmp12切割；

15、所述异源蛋白酶切割位点选自seq id no:11-12并且能通过ctsd切割；

16、所述异源蛋白酶切割位点是seq id no:13并且能通过ctsc切割；或

17、所述异源蛋白酶切割位点选自seq id no:14-16并且能通过ctsl切割。

18、在一些实施例中，所述信号肽包括seq id no:5中所示的氨基酸序列或其变体，并且其中所述ppe肽酶结构域包括seq id no:7中所示的氨基酸序列或与seq id no:7至少80％、85％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，所述经修饰的ppe前蛋白包括与选自表s4的序列至少80％、85％、90％、95％、98％或100％相同并且保留所述异源蛋白酶切割位点的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。

19、在一些实施例中，所述经修饰的ppe前蛋白在体外或体内基本上不与丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)结合，任选地其中所述serpin包含α-1抗胰蛋白酶(a1at)。在一些实施例中，所述经修饰的ppe前蛋白作为其ppe前蛋白形式的丝氨酸蛋白酶基本上无活性。

20、在一些实施例中，对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割，例如在体内在癌症或肿瘤位点处对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割产生活性ppe肽酶结构域(或活性ppe蛋白)，所述活性ppe肽酶结构域相对于所述ppe前蛋白具有增加的丝氨酸蛋白酶活性。在一些实施例中，所述活性ppe蛋白的所述丝氨酸蛋白酶活性相对于所述ppe前蛋白的丝氨酸蛋白酶活性增加约或至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍或更多倍。

21、在一些实施例中，对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割，例如在体内在癌症或肿瘤位点处对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割产生活性ppe肽酶结构域(或活性ppe蛋白)，所述活性ppe肽酶结构域相对于所述ppe前蛋白具有增加的癌细胞杀伤活性。在一些实施例中，所述活性ppe蛋白的所述癌细胞杀伤活性相对于所述ppe前蛋白的癌细胞杀伤活性增加约或至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍或更多倍。

22、还包含重组核酸分子，其编码本文所描述的经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，例如经修饰的ppe前蛋白；包括所述重组核酸分子的载体；或包括所述重组核酸分子或所述载体的宿主细胞。某些实施例包含产生如本文所描述的经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，例如经修饰的ppe前蛋白的方法，所述方法包括：在适合于所述前蛋白的表达的培养条件下培养根据权利要求所述的宿主细胞；以及从培养物中分离所述前蛋白。

23、一些实施例包含药物组合物，其包括如本文所描述的经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，例如经修饰的ppe前蛋白，或编码所述前蛋白的可表达的多核苷酸，以及药学上可接受的载体。

24、某些实施例包含治疗有需要的受试者的癌症、改善有需要的受试者的癌症的症状和/或减少有需要的受试者的癌症的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所描述的药物组合物。在一些实施例中，所述癌症是原发性癌症或转移性癌症，并且选自以下中的一者或多者：黑色素瘤(任选地转移性黑色素瘤)、乳腺癌(任选地三阴性乳腺癌，tnbc)、肾癌(任选地肾细胞癌)、胰腺癌、骨癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、间皮瘤、白血病(任选地淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性髓性白血病或复发性急性髓性白血病)、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、肝癌(肝细胞癌)、肉瘤、b细胞恶性肿瘤、卵巢癌、结直肠癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原发性cns淋巴瘤、原始神经外胚层肿瘤(成神经管细胞瘤)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、宫颈癌、睾丸癌、甲状腺癌和胃癌。

25、在一些实施例中，所述经修饰的丝氨酸蛋白酶前蛋白，例如所述经修饰的ppe前蛋白通过在细胞或组织，如癌细胞或肿瘤细胞或组织中对所述异源蛋白酶切割位点的蛋白酶切割来激活，以产生活性肽酶结构域，例如活性ppe肽酶结构域，其中所述活性肽酶结构域相对于所述前蛋白具有增加的丝氨酸蛋白酶活性和/或癌细胞杀伤活性。在一些实施例中，相对于对照或参考品，所述活性肽酶结构域使所述受试者中的癌细胞杀伤增加约或至少约2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍或1000倍或更多倍。在一些实施例中，所述活性肽酶结构域引起所述受试者的肿瘤消退，任选地如通过活肿瘤或肿瘤块的量的统计学上显著的减少，任选地肿瘤块的至少约10％、20％、30％、40％、50％或更多的减少所指示的。

26、某些实施例包括通过肠胃外施用向所述受试者施用所述药物组合物。在一些实施例中，所述肠胃外施用是静脉内施用。