用于培养基的蛋黄提取物补充剂及相关方法与流程

本发明涉及培养基。特别地，本发明涉及用于培养基的蛋黄提取物补充剂及相关方法。

背景技术：

1、胎牛血清(fbs)是用于哺乳动物细胞的细胞培养的常用的生长补充剂，因为fbs包含多种蛋白质和脂肪，其有助于培养的细胞保持活力。对于许多细胞系或细胞类型，fbs的缺失将导致细胞死亡和显著降低细胞生存力和缺乏细胞增殖。通常，fbs的使用量为细胞培养基总体积的约5-10％。

2、fbs本质上是牛胎儿的血液，其允许凝结并且然后离心以生成血清，该血清是离心后形成的透明浅棕色上清液。从每个胎儿中提取大约3-4l的全血，并且这在当胎儿在母体内时进行的。血液经由心脏穿刺收集，并收集到允许自然凝结的容器中。这一过程主要在怀孕的产奶奶牛中进行。因此，fbs的成本很高，因为所需的过程和维持这些怀孕的奶牛所需的费用以及农业成本的上升。在2000年代，一瓶fbs(500ml)的价格范围为$100-300(usd)。然而，在过去十年中，这一成本已上升到每瓶$300-1,000usd。该产品成本的上升意味着最终细胞培养的实践将是成本高昂的，并可能导致科研生产力的下降。

3、除了使用fbs作为生长补充剂之外，还有其他替代选择，但这些替代选择主要依赖于被认为是活细胞培养所需的蛋白质的纯化。这意味着使用这些生长因子的成本没有真正的降低，在某些情况下，纯化的蛋白质只是添加到稀释的fbs中。这些替代选择不太受欢迎，因为它们被认为是合成的，并且对细胞系具有特异性，并且因此与多种细胞系的培养无关。

4、蛋黄提取物已用于细胞培养中作为fbs的替代品。通常，只使用蛋黄。刺穿卵黄膜，并将释放的蛋黄收集到管中，用pbs(盐水溶液)稀释。一旦蛋黄被稀释(通常用pbs作为稀释剂稀释5-10x)，然后以200-1000×g离心5-20分钟。离心后，所得上清液之后用于补充细胞培养研究。这些蛋黄提取物只包含蛋黄的液体内容物，并且因此只包含整个蛋黄中所有营养物的一小部分。当这些蛋黄提取物用于细胞培养研究时，它们产生轻微的生长效果，并且劣于fbs。

5、例如，美国专利号5,356,798描述了一种无血清培养基，其包括不含脂蛋白和脂质的蛋黄部分。公开了不含脂蛋白和脂质的蛋黄部分用于增加宿主细胞中重组蛋白的表达的用途，所述宿主细胞能够在无血清的细胞生长培养基中表达所述蛋白质。

6、fujii和gospodarowicz(in vitro；19(11)：811-817；1983)描述了用鸡蛋黄补充组织培养基可以支持低密度的牛血管和角膜内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖，这些细胞维持在基底薄层涂层的培养皿上，并且蛋清没有任何促进生长的活性。

7、murakami等人(cytotechnology；1:159-169；1988)描述了蛋黄脂蛋白在无血清培养基中促进许多种哺乳动物细胞系的生长，包括浆细胞瘤和上皮细胞系。脂蛋白的特征是极低密度的脂蛋白，蛋白质含量仅为1.3％。该脂蛋白的最佳浓度为300gg/ml(4gg蛋白质/ml)。它很容易与细胞分泌到无血清培养基中的蛋白质分子分离，因为它在添加硫酸铵后漂浮在培养基表面，沉淀蛋白质并离心。脂质和蛋白质的相关结构似乎仍然是脂蛋白展现促进生长活性所必需的。

8、需要开发替代的有效培养基补充剂和相关方法。

技术实现思路

1、根据一个方面，提供了包括游离的蛋黄颗粒的蛋黄提取物。

2、根据一个方面，提供了包括蛋黄的液体内容物和一种或多种任选地裂解的蛋黄颗粒的蛋黄提取物。

3、根据一个方面，提供了包括蛋黄球的液体内容物的蛋黄提取物。

4、根据一个方面，提供了包括蛋黄颗粒的液体内容物的蛋黄提取物。

5、根据一个方面，提供了包括蛋黄的液体内容物和一种或多种蛋清蛋白质的蛋黄提取物。

6、在一个方面中，所述一种或多种蛋清蛋白质包括卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、卵清蛋白相关的蛋白x(ovax)、防御肽、卵抑制剂、avbd11或其组合。

7、根据一个方面，提供了蛋黄提取物，当在细胞培养基中以相同浓度使用时，其支持细胞增殖和/或存活，至少相当于fbs。

8、在一个方面中，所述提取物包括游离的蛋黄颗粒。

9、在一个方面中，所述提取物包括裂解的蛋黄球。

10、在一个方面中，所述提取物包括一种或多种蛋清蛋白质，诸如卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、卵清蛋白相关的蛋白x(ovax)、防御肽、卵抑制剂、avbd11或其组合。

11、在一个方面中，所述提取物包括蛋的均质化的蛋黄和蛋清。

12、在一个方面中，所述蛋黄提取物基本上由蛋黄和蛋清组成，其中所述蛋黄包括裂解的蛋黄球。

13、在一个方面中，所述蛋黄提取物是液体。

14、在一个方面中，所述蛋黄提取物从任何卵生物种的蛋中提取，例如鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫、软体动物、蛛形纲动物或其组合。

15、在一个方面中，所述蛋黄提取物是禽类的。

16、在一个方面中，所述蛋黄提取物从鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鸵鸟、鸸鹋或其组合的蛋中提取。

17、在一个方面中，所述蛋黄提取物是鸡、鸭或鹌鹑的。

18、根据一个方面，提供了用于细胞培养基的补充剂，该补充剂包括本文所述的蛋黄提取物。

19、在一个方面中，所述提取物基本上由本文所述的蛋黄提取物组成。

20、在一个方面中，所述提取物由本文所述的蛋黄提取物组成。

21、在一个方面中，所述蛋黄提取物未被稀释。

22、在一个方面中，所述蛋黄提取物未用盐水，诸如pbs稀释。

23、根据一个方面，提供了包括本文所述的蛋黄提取物或补充剂的细胞培养基。

24、在一个方面中，所述培养基是dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、rpmi培养基、cmrl1066、hanks平衡盐溶液(hbss)磷酸盐缓冲盐水(pbs)、l-15培养基、dmem-f12、培养基和培养基171或其组合。

25、在一个方面中，所述培养基是缓冲盐水溶液，诸如hbss。

26、在一个方面中，所述培养基包括约1％至约10％v/v的提取物或补充剂，诸如约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。

27、在一个方面中，所述细胞培养基不包含fbs和/或ncs。

28、在一个方面中，所述细胞培养基是生长培养基或冷冻培养基，例如不含dmso的冷冻培养基。

29、在一个方面中，所述细胞培养基用于培养原代细胞系，例如用于食物消耗的原代细胞系，例如原代牛骨骼肌细胞。

30、在一个方面中，所述细胞培养基用于培养用于抗体生产的细胞。

31、在一个方面中，细胞培养基用于生物制品生产，例如，生物制品诸如胰岛素、促红细胞生成素(epo)或粒细胞集落刺激因子(c-gsf)。

32、根据一个方面，提供了用于制备蛋黄球提取物的方法，所述方法包括裂解蛋黄球。

33、在一个方面中，裂解蛋黄球包括例如通过高压均质化对蛋黄球进行超声处理或均质化。

34、在一个方面中，该方法足以裂解至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或约99％的蛋黄球。

35、在一个方面中，超声处理在约75w或更多下进行约25至约30个循环，每个循环约15至约20秒。

36、在一个方面中，所述蛋黄球在包括蛋黄和蛋清的组合物中。

37、在一个方面中，所述方法进一步包括在裂解蛋黄球之前混合蛋黄和蛋清，任选地，其中所述混合在约4℃至约25℃下进行约30分钟至约24小时，诸如在室温下约30分钟或在4℃下约12至18小时，并且任选地其中通过倒转进行混合。

38、在一个方面中，所述方法进一步包括在混合蛋黄和蛋清之前或之后从蛋黄中去除卵黄膜。

39、在一个方面中，所述方法进一步包括溶解未裂解的蛋黄球和/或蛋黄颗粒，例如通过碱化和/或盐化裂解的蛋黄球。

40、在一个方面中，碱化和/或盐化裂解的蛋黄球包括向裂解的蛋黄球中添加碱和/或盐，诸如强碱，诸如naoh(任选地以约100mm至约1m)、koh(任选地以约100mm至约1m)、na2so4(任选地以约0.05mm至约0.1m)、(nh4)2so4(任选地以约0.05mm至约0.5m)或其组合或诸如nacl，任选地以约0.1m至约0.5m。

41、在一个方面中，所述方法进一步包括去除固体。

42、在一个方面中，去除固体包括离心裂解的蛋黄球，例如以约15,000g至约30,000g，并保留上清液。

43、在一个方面中，所述方法进一步包括例如使用0.4μm或更小的孔径，诸如约0.22μm或0.11μm孔径的过滤器对蛋黄提取物进行灭菌。

44、在一个方面中，所述方法进一步包括澄清蛋黄提取物，例如通过以每1ml蛋黄提取物添加甘油约50至约200μl。

45、根据一个方面，提供了由本文所述的方法制备的蛋黄提取物。

46、在检查本发明的以下详细描述后，本发明的新颖特征对于本领域技术人员将变得显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的某些方面的同时，本发明的详细描述和所呈现的特定实施例仅用于说明目的提供，因为根据本发明的详细描述和随后的权利要求，在本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说将变得显而易见。