FLT3配体融合蛋白及使用方法与流程

本发明涉及flt3配体融合蛋白及其使用方法。

背景技术：

1、许多研究支持免疫系统成分的差异存在在癌症进展中的重要性(jochems和schlom,exp biol med,236(5):567-579(2011))。临床数据表明，高密度的肿瘤浸润性淋巴细胞与改善的临床结果有关(mlecnik等人，cancer metastasis rev.；30:5-12,(2011))。肿瘤免疫浸润包括巨噬细胞、树突状细胞(dc)、肥大细胞、自然杀伤(nk)细胞、初始淋巴细胞和记忆淋巴细胞、b细胞和效应t细胞(t淋巴细胞)，它们主要负责对肿瘤细胞表达的抗原的识别和随后t细胞对肿瘤细胞的破坏。

2、尽管癌细胞呈递抗原并且存在可能与肿瘤细胞发生反应的免疫细胞，但在许多情况下，免疫系统不会被活化或被肯定地抑制。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。总体结果是t细胞应答受损和细胞凋亡诱导或cd8+细胞毒性t细胞的抗肿瘤免疫能力降低。抗原呈递功能和树突状细胞(dc)的抑制另外有助于逃避抗肿瘤免疫力(gerlini等人，am.j.pathol.165(6),1853-1863(2004)。

3、此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质可导致不表达靶抗原的癌细胞亚群逃逸。因此，找到一种促进免疫系统抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有相当大的治疗益处。

4、免疫检查点与肿瘤介导的抗肿瘤免疫力下调有关。已经证明，t细胞功能障碍与抑制性受体ctla-4和程序性死亡1多肽(pd-1)(cd28家族受体的成员)的诱导表达同时发生。然而，尽管近年来进行了广泛的研究，但免疫疗法在临床环境中的成功仍然有限。监管机构批准的治疗剂很少，并且其中大多数患者并未体验到益处。近年来，免疫检查点与抗肿瘤免疫力的下调有关，并被用作治疗靶标。这些观察结果强调需要开发利用免疫系统对抗癌症的新治疗方法。

5、人flt3l(fms样酪氨酸激酶3配体)是一种刺激骨髓细胞增殖的i型跨膜蛋白，于1994年被克隆(lyman等人，1994)。可溶性hflt3l的用途已在各种临床前和临床环境中进行了探索，包括为骨髓移植做准备的干细胞动员、癌症免疫疗法(如树突状细胞的扩增)以及疫苗佐剂。然而，还没有基于flt3l的药物组合物在临床上取得超过2期的进展。

6、一个挑战是优化对flt3l配体的暴露并确定最佳给药方案，同时最大限度地减少不良副作用或潜在的不利免疫效应。例如，可以通过改变给药方案、改变给药量或改变治疗分子的药代动力学和/或药效学特性来调节暴露。本文提供具有有益pk/pd特性的flt3l-fc融合蛋白，其有益于增强对癌症患者的免疫疗法。

技术实现思路

1、本发明提供无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白(包括包含与无效应子免疫球蛋白fc蛋白融合的活性flt3配体(flt3l)的flt3配体融合蛋白)及其使用方法。使用无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白和flt3l-fc融合蛋白的方法包括治疗癌症，尤其是治疗接受检查点免疫疗法的患者的癌症。本发明进一步提供无效应子iggfc蛋白。

2、在一方面，提供无效应子fc蛋白，其包含与残基seq id no:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)或者seq id no:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)并且seq id no:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中seq id no:13的残基13-17包含pvagp(seq idno:20)，这在本文中可称为涵盖pva#变体，并且其中seq id no:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为n297g突变，其中297是指抗体的eu编号。

3、在一些实施例中，无效应子fc蛋白包含seq id no:2、4、5、6、13或15的蛋白质序列。

4、在又一些实施例中，无效应子igg1 fc蛋白相对于包含seq id no:12的野生型igg1 fc区是减弱的。

5、在一些方面，提供了包含无效应子fc蛋白的抗体，其包含与残基seq id no:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)或者seq id no:13的残基76是甘氨酸。

6、在一些实施例中，抗体与flt3l受体结合。

7、在一些实施例中，抗体与检查点抑制剂蛋白结合。在其他实施例中，检查点抑制剂蛋白是pd-l1、pd-1和/或ctla-4。在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。

8、在一些方面，提供了包含本公开的无效应子fc蛋白和第二蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，无效应子fc蛋白和第二蛋白彼此共价连接。在其他实施例中，无效应子fc蛋白和第二蛋白通过二硫键连接。

9、在一些方面，提供了编码本公开的无效应子fc蛋白的经分离的核酸、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含如本文和上文所述的无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，经分离的核酸编码seq id no:2、4、5、6、13或15的蛋白质序列。在其他实施例中，经分离的核酸进一步编码在无效应子fc蛋白的n末端的信号序列。在一个优选实例中，经分离的核酸编码seq id no:13的蛋白质序列。

10、在一些方面，提供了如本文和上文所述的包含编码本公开的无效应子fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白。

11、在一些方面，提供了产生本公开的无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白的方法，该方法包括培养包含编码本公开的无效应子fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白，使得产生所述蛋白质中的每一个。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞回收本公开的无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是cho细胞。

12、在一些方面，提供了包含编码本公开的无效应子fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白。

13、在一些方面，提供了产生本公开的无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白的方法，该方法包括培养包含编码本公开的无效应子fc蛋白的核酸的宿主细胞、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白，使得产生本公开的无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞回收本公开的无效应子fc蛋白、包含无效应子fc蛋白的融合蛋白、包含无效应子fc蛋白的抗体和/或包含无效应子fc蛋白的异二聚体蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是cho细胞。

14、在一方面，提供了包含无效应子fc蛋白的融合蛋白，其包含无效应子fc蛋白(seqid no:13或其变体)和第二蛋白，其中所述第二蛋白是靶蛋白的配体。在一些实施例中，配体在配体与靶蛋白结合时调节靶蛋白。在一些实施例中，第二蛋白是flt3l。在其他实施例中，靶蛋白是flt3l受体。在优选的实施例中，第二蛋白位于无效应子fc蛋白的n末端。

15、在一些实施例中，融合蛋白包含与seq id no:13至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的fc蛋白，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)或者seq id no:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq idno:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)并且seq id no:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中seq id no:13的残基13-17包含pvagp(seq id no:20)，这在本文中可称为涵盖pva#变体，并且其中seq id no:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为n297g突变，其中297是指抗体的eu编号。

16、在一方面，融合蛋白包含flt3配体(flt3l)和无效应子igg1 fc区，其中所述flt3l-fc融合蛋白具有相对于包含seq id no:12的野生型igg1 fc区减弱的效应子功能。

17、在flt3l-fc融合蛋白的一些实施例中，flt3l包含蛋白质，所述蛋白质包含与seqid no:21的残基27-167至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，flt3l包含seq id no:21的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代。在其他实施例中，1、2或3个氨基酸取代不存在于结合fcrn蛋白的flt3l区域中。在一些实施例中，所述突变flt3l多肽包含如seq id no:22所示的氨基酸序列。

18、在flt3l-fc融合蛋白的一些实施例中，flt3l包含蛋白质，所述蛋白质包含seq idno:21的氨基酸27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184或27-185。在flt3l-fc融合蛋白的优选实施例中，flt3l包含由seq id no:21的氨基酸27-167或seq idno:21的氨基酸27-168组成的氨基酸序列。在其他实施例中，flt3l-fc融合蛋白的flt3l不包含seq id no:21的168-235、169-235、170-235、171-235、172-235、173-235。在又一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白的flt3l不包含氨基酸序列pwsprpleataptapqpp(seq id no:48)、wsprpleataptapqpp(seq id no:49)、sprpleataptapqpp(seq id no:50)、prpleataptapqpp(seq id no:51)、rpleataptapqpp(seq id no:52)或pleataptapqpp(seqid no:53)。

19、在flt3l-fc融合蛋白的一些实施例中，flt3l包含与包含seq id no:21的氨基酸27-167、27-168、27-169、27-170、27-171、27-172、27-173、27-174、27-175、27-176、27-177、27-178、27-179、27-180、27-181、27-182、27-183、27-184或27-185的蛋白质至少约95％、96％、97％、98％或99％相同的蛋白质。

20、在flt3l-fc融合蛋白的一些实施例中，flt3l包含与包含seq id no:21的氨基酸24-167、25-167、26-167、24-168、25-168、26-168、24-169、25-169或26-169的蛋白质至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的蛋白质。

21、在flt3l-fc融合蛋白的一些实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)或者seq id no:13的残基76是甘氨酸。在其他实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:13的残基13-17包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)并且seq idno:13的残基76是甘氨酸。在又一些实施例中，无效应子igg1 fc区包含与seq id no:13相同的氨基酸序列。为清楚起见，在一些实施例中，其中seq id no:13的残基13-17包含pvagp(seq id no:20)，这在本文中可称为涵盖pva#变体，并且其中seq id no:13的残基76是甘氨酸，这在本文中可称为n297g突变，其中297是指抗体的eu编号。

22、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:26至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在其他实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含seq id no:26的氨基酸序列。

23、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:26至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:26的残基154-158包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)，并且seq id no:26的残基217是甘氨酸。

24、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:25至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:25的残基155-159包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)，并且seq id no:25的残基218是甘氨酸。

25、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:32至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:32的残基153-157包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)，并且seq id no:32的残基216是甘氨酸。

26、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:33至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:33的残基152-156包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)，并且seq id no:33的残基215是甘氨酸。

27、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与seq id no:34至少95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中seq id no:34的残基151-154包含氨基酸序列pvagp(seq id no:20)，并且seq id no:34的残基214是甘氨酸。

28、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白包含与选自由seq id no:27至seq id no:31和seq id no:35至seq id no:44组成的蛋白质至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

29、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白在体外测定中以一定活性水平活化抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)，所述活性水平低于包含与野生型igg1 fc(seq id no:12)融合的野生型flt3l的flt3l-fc融合蛋白在体外测定中的活性水平的约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施例中，adcp体外测定包括使用原代巨噬细胞作为效应细胞和使用表达flt3l受体的细胞系作为靶细胞。在又一些实施例中，原代巨噬细胞是来自健康人类供体的单核细胞来源的巨噬细胞。在其他实施例中，靶细胞是人急性成淋巴细胞性白血病细胞，任选地是sem细胞系细胞。在一些实施例中，活性以吞噬作用百分比(％adcp)的形式测量，其中吞噬作用通过测量从靶细胞摄取视觉标记物来确定。

30、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白在已施用该融合蛋白的受试者中活化dc扩增。在其他实施例中，在受试者的全血中测量dc扩增。在又一些实施例中，dc扩增通过流式细胞术或facs测量。在一些实施例中，dc扩增至少是施用未与异源蛋白融合的flt3l蛋白导致的dc扩增的5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍、5000倍或10,000倍。在其他实施例中，异源蛋白是野生型人igg fc蛋白。在其他实施例中，野生型人igg fc蛋白是野生型igg1、igg2、igg3或igg4 fc蛋白。在一些实施例中，flt3l蛋白不与野生型igg1 fc蛋白或人血清白蛋白融合。在一些实施例中，受试者是啮齿动物、兔、食蟹猴或人。在其他实施例中，啮齿动物是小鼠或大鼠。

31、在一些实施例中，与具有seq id no:14的flt3l-fc融合蛋白的热稳定性相比，flt3l-fc融合蛋白具有增加的热稳定性。在其他实施例中，热稳定性使用差示扫描荧光测定法测量。在又一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白的解链温度(tm)比具有seq id no:14的flt3l-fc融合蛋白的tm高至少1.5℃、2℃、3℃、4℃或5℃。

32、在一些实施例中，flt3l-fc融合蛋白在flt3l结构域中含有单个氨基酸取代。在其他实施例中，取代降低体内免疫原性但不使功能活性降低超过10％、20％或30％。在其他实施例中，功能活性测定是动物中树突状细胞的扩增。

33、在一些方面，提供了编码如本文和上文所述的flt3l-fc融合蛋白的经分离的核酸。在一些实施例中，经分离的核酸编码seq id no:25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44的蛋白质序列。在其他实施例中，经分离的核酸进一步编码在flt3l-fc融合蛋白的n末端的信号序列。在一个优选实例中，经分离的核酸编码seq idno:45的蛋白质序列。

34、在一些方面，提供了包含编码如本文和上文所述的flt3l-fc融合蛋白的核酸的宿主细胞。

35、在一些方面，提供了产生flt3l-fc融合蛋白的方法，该方法包括培养包含编码无效应子flt3l-fc融合蛋白的核酸的宿主细胞，使得产生flt3l-fc融合蛋白。在一些实施例中，该方法进一步包括从宿主细胞中回收flt3l-fc融合蛋白。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在其他实施例中，真核细胞是cho细胞。

36、在一些方面，提供了药物制剂，其包含如本文所述的flt3l-fc融合蛋白以及药用载体。

37、在一些实施例中，该药物制剂进一步包含附加的治疗剂。在又一些实施例中，附加的药物药剂是佐剂、树突状细胞成熟因子和/或检查点抑制剂。

38、在一些方面，提供了用于扩增施用flt3l-fc融合蛋白的受试者中树突状细胞(dc)的数量的方法。在一些实施例中，dc是cdc1和/或cdc2细胞。在其他实施例中，该方法包括向受试者施用本发明的flt3l-fc融合蛋白。

39、在一些实施例中，该方法包括向受试者施用约0.1mg/kg至50mg/kg、0.1mg/kg至40mg/kg、0.1mg/kg至25mg/kg、0.1mg/kg至20mg/kg、0.1mg/kg至15mg/kg、0.1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至25mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg或1mg/kg至10mg/kg的剂量的flt3l-fc融合蛋白。

40、在一些实施例中，该方法包括约每天一次、每周一次、每周两次、每2周一次、每3周一次、每月一次或每隔一个月一次向受试者施用flt3l融合蛋白。

41、在一些实施例中，该方法包括通过静脉内施用、肠胃外施用、肌内注射或皮下注射向受试者施用flt3l融合蛋白。

42、在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，其中该方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的flt3l-fc融合蛋白。在一些实施例中，该方法包括施用治疗有效量的flt3l-fc融合蛋白和施用治疗有效量的免疫检查点抑制剂。在其他实施例中，免疫检查点抑制剂压制或抑制pd-1或pd-l1的作用。在又一些实施例中，免疫检查点抑制剂是派姆单抗、纳武单抗、匹地利珠单抗、bms 936559、阿特珠单抗或阿维单抗。在其他实施例中，检查点抑制剂在施用flt3l-fc融合蛋白之前、同时或之后施用。

43、在一些实施例中，该方法进一步包括施用树突状细胞(dc)成熟因子。在其他实施例中，dc成熟因子选自polyic、poly-iclc、cd40激动剂、放射疗法和化学疗法。在其他实施例中，dc成熟因子在施用flt3l-fc融合蛋白之前、同时和/或之后施用给个体。在特定实施例中，dc成熟因子是放射疗法。在一些实施例中，该方法包括在受试者已接受dc成熟因子之后向受试者施用flt3l-fc融合蛋白。在其他实施例中，该方法包括在受试者接受dc成熟因子之前向受试者施用flt3l-fc融合蛋白。在又一些实施例中，方法包括在受试者接受dc成熟因子的大约同时向受试者施用flt3l-fc融合蛋白

44、在一些实施例中，癌症选自由以下各项组成的组：非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、黑素瘤、胰腺导管腺癌(pdac)、三阴性乳腺癌(tnbc)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、结直肠癌(crc)、乳腺癌、膀胱癌、肾癌或其组合。

45、在一些实施例中，先前曾用检查点抑制剂治疗受试者。在其他实施例中，受试者对检查点抑制剂疗法没有应答，其中所述检查点抑制剂疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。

46、在一些实施例中，用放射疗法治疗受试者，其中所述放射疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。

47、在一些实施例中，用化学疗法治疗受试者，其中所述化学疗法在至少或约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、1年、1.5年或2年的时段内施用。

48、在一些实施例中，受试者的癌症已表征为包含免疫沙漠型肿瘤。在其他实施例中，癌症已被表征为包含相对于反应性发炎肿瘤(“热肿瘤”)具有减轻的炎症的肿瘤(“冷肿瘤”)。