具有特征性原间隔子相邻基序或特征性指导RNA识别位点的可切除植物转基因基因座的制作方法

背景技术：

1、通过非位点特异性整合置于植物基因组不同位置的转基因可以表现出不同的表达水平(weising等人,1988,ann.rev.genet.[遗传学年鉴]22:421-477)。这样的转基因插入位点还可以包含外来dna元件的各种不期望的重排，包括缺失和/或重复。此外，许多转基因插入位点还可以包含可选择的或可评分的标记基因，在某些情况下，一旦选择了含有赋予所期望性状的连锁转基因的转基因植物事件，就不再需要这些标记基因。

2、商业转基因植物通常在宿主植物基因组的特定位置包含一个或多个独立的转基因插入，这些位置已针对包括以下的特征进行了选择：表达一个或多个目的转基因和转基因赋予的一个或多个性状、缺失或最小化重排，以及一个或多个性状向后代的正常孟德尔传递。所选择转基因玉米、大豆、棉花和卡诺拉油菜植物事件(其赋予性状诸如除草剂耐受性和/或有害生物耐受性)的实例披露于美国专利号7323556；8575434；6040497；10316330；8618358；8212113；9428765；8455720；7897748；8273959；8093453；8901378；8466346；re44962；9540655；9738904；8680363；8049071；9447428；9944945；8592650；10184134；7179965；7371940；9133473；8735661；7381861；8048632；和9738903。

3、在植物基因组的转基因插入位点去除可选择标记基因和/或重复转基因的方法(这些方法涉及使用位点特异性重组酶系统(例如，cre-lox)以及将新基因插入转基因插入位点)已被披露(srivastava和ow；methods mol biol[分子生物学方法],2015,1287:95-103；dale和ow,1991,proc.natl acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88,10558–10562；srivastava和thomson,plant biotechnol j[植物生物技术杂志],2016；14(2):471-82)。此类方法通常需要在转基因内的特定位置掺入重组酶识别的重组位点序列。

技术实现思路

1、提供了经编辑的转基因植物基因组，其包含第一组特征性原间隔子相邻基序(spam)位点和/或特征性指导rna识别(sigrnar)位点，其中spam和/或sigrnar位点可操作地连接至转基因植物基因组中第一经修饰的转基因基因座的两个dna连接多核苷酸并且其中spam和/或sigrnar位点在包含原始转基因基因座的转基因植物基因组中不存在。还提供了经编辑的转基因植物基因组，其包含特征性原间隔子相邻基序(spam)位点和/或特征性指导rna识别(sigrnar)位点，其中spam和/或sigrnar位点可操作地连接至转基因植物基因组中第一经修饰的转基因基因座的dna连接多核苷酸并且其中spam和/或sigrnar位点在包含原始转基因基因座的转基因植物基因组中不存在。还提供了包含经编辑的转基因植物基因组的转基因植物细胞、植物、植物部分和经加工的植物产品。还提供了获自转基因植物细胞、转基因植物或转基因植物部分的生物样品，其中生物样品包含一个或多个多核苷酸，其包含第一、第二和/或第三经修饰的转基因基因座的一个或两个dna连接多核苷酸中的spam和/或sigrnar。提供了检测经编辑的转基因植物基因组的方法，这些方法包括检测包含所述spam和/或sigrnar中的一个或多个的多核苷酸的存在的步骤。

2、提供了获得植物育种系的方法，包括：(a)使包含经编辑的转基因基因组的上述转基因植物杂交，其中将包含第一经修饰的转基因基因座的第一植物与包含第二经修饰的转基因基因座的第二植物杂交；并且(b)从该杂交中选择包含该第一和第二经修饰的转基因基因座的后代植物，从而获得该植物育种系。还提供了获得用于商业种子生产的大量近交种子群体的方法，这些包括转基因植物自交和从自交优良作物植物收获种子。获得杂交作物种子的方法包括将包含转基因植物的第一作物植物与第二作物植物杂交并从杂交中收获种子。

3、提供了获得包含经修饰的转基因基因座的经编辑的转基因植物基因组的方法，这些方法包括在原始转基因基因座的第一和第二dna连接多核苷酸中或附近引入sigrnar位点的步骤，其中sigrnar位点可操作地连接至该第一和第二dna连接多核苷酸。

4、提供了从经编辑的转基因植物基因组中切除经修饰的转基因基因座的方法，这些方法包括以下步骤：(a)将任何上述经编辑的转基因植物基因组与以下接触：(i)识别第一组spam、第二组spam和/或第三组spam的rdde；和(ii)两个指导rna(grna)，其中每个grna包含位于紧邻第一组spam的5’或3’的dna的rna等同物；并且(b)选择转基因植物细胞、转基因植物部分或转基因植物，其中侧翼是该第一组spam的经修饰的转基因基因座已被切除。

5、提供了从经编辑的转基因植物基因组中切除经修饰的转基因基因座的方法，这些方法包括以下步骤：(a)将上述经编辑的转基因植物基因组与以下接触：(i)识别第一连接多核苷酸中的spam和第一转基因基因座的第二连接多核苷酸中预先存在的pam或sigrnar位点的rdde；和(ii)两个指导rna(grna)，其中每个grna包含位于紧邻该spam和预先存在的pam或sigrnar位点的5’或3’的dna的rna等同物；并且(b)选择转基因植物细胞、转基因植物部分或转基因植物，其中侧翼是该spam和该预先存在的pam或sigrnar位点的经修饰的转基因基因座已被切除。

6、提供了从经编辑的转基因植物基因组中切除经修饰的转基因基因座的方法，这些方法包括以下步骤：(a)将上述经编辑的转基因植物基因组与以下接触：(i)识别第一组sigrnar位点、第二组sigrnar位点和/或第三组sigrnar位点的rdde；和(ii)定向至该第一组sigrnar位点的指导rna(grna)；并且(b)选择转基因植物细胞、转基因植物部分或转基因植物，其中侧翼是该第一组sigrnar位点的经修饰的转基因基因座已被切除。

7、提供了从经编辑的转基因植物基因组中切除经修饰的转基因基因座的方法，这些方法包括以下步骤：(a)将上述经编辑的转基因植物基因组与以下接触：(i)识别第一连接多核苷酸中的sigrnar位点和第一转基因基因座的第二连接多核苷酸中预先存在的pam或spam位点的rdde；以及(ii)定向至该第一sigrnar位点和该预先存在的pam或spam位点的指导rna(grna)；并且(b)选择转基因植物细胞、转基因植物部分或转基因植物，其中侧翼是该sigrnar和预先存在的pam或spam位点的经修饰的转基因基因座已被切除。

8、提供了包含spam和/或sigrnar的dna，该spam和/或sigrnar在经修饰的转基因基因座的一个或两个dna连接多核苷酸中、与其相邻或与其可操作地连接。还提供了含有dna的经加工的转基因植物产品和含有dna的生物样品。

9、提供了适用于检测基因组dna或其片段的核酸标记，该核酸标记包含spam和/或sigrnar的dna，该spam和/或sigrnar在经修饰的转基因基因座的一个或两个dna连接多核苷酸中、与其相邻或与其可操作地连接。

10、提供了获得包含经修饰的转基因基因座的经编辑的转基因植物基因组的方法，这些方法包括在原始转基因基因座的第一和第二dna连接多核苷酸中或附近引入第一和第二spam位点的步骤，其中这些spam位点可操作地连接至该第一和第二dna连接多核苷酸。

11、提供了获得包含经修饰的转基因基因座的经编辑的转基因植物基因组的方法，这些方法包括在原始转基因基因座的第一dna连接多核苷酸中或附近引入sigrnar位点的步骤，其中sigrnar位点可操作地连接至该第一dna连接多核苷酸。

12、提供了获得含有不同转基因性状的近交转基因植物种质的方法，这些方法包括：(a)将至少第一转基因基因座和第二转基因基因座进行基因渗入近交种质以获得包含该第一和第二转基因基因座的供体近交亲本植物系，其中特征性原间隔子相邻基序(spam)位点或特征性指导rna识别(sigrnar)位点可操作地连接至至少该第一转基因基因座的两个dna连接多核苷酸并且任选地连接至该第二转基因基因座；(b)将该供体近交亲本植物系的转基因植物基因组与以下接触：(i)定向至与两个spam位点相邻的基因组dna或定向至这些sigrnar位点的至少第一指导rna，其中这些spam或sigrnar位点可操作地连接至该第一转基因基因座；和(ii)一个或多个识别这些spam或sigrnar位点的rna依赖性dna核酸内切酶(rdde)；并且(c)在近交种质中选择包含经编辑的转基因植物基因组的转基因植物细胞、转基因植物部分或的转基因植物，其中该第一转基因基因座已被切除并且该第二转基因基因座存在于该近交种质中。