携带一个或多个P基因突变的RSV疫苗的制作方法

携带一个或多个p基因突变的rsv疫苗
关于联邦资助的研究或开发的声明
1.支持本技术的研究由美国卫生和人力服务部进行。这项研究得到了国家卫生研究所的niaid的校内研究部的校内研究项目的支持。政府享有本发明的某些权利。在先申请的交叉引用
2.本技术要求2020年5月13日提交的美国临时专利申请第63/023,949号的权益，所述美国临时专利申请在此通过引用以其整体并入。以电子方式提交的材料通过引用并入
3.通过引用以其整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“754331_st25.txt”，2021年5月12日创建的一份179,715字节ascii(文本)文件。发明背景
4.呼吸道合胞病毒(rsv，也称为正肺炎病毒)属于rna病毒的肺病毒科，以前属于副粘病毒科。rsv是具有线性负义rna基因组的包膜病毒。因此，rna基因组在其被翻译之前首先被转录。基因组编码11种蛋白，即两种非结构蛋白(ns1和ns2)、结合rna的核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、内部基质蛋白(m)、小疏水表面糖蛋白(sh)、粘附糖蛋白(g)、融合蛋白(f)、由相同mrna编码的两种蛋白(m2-1和m2-2)以及大聚合酶蛋白(l)。对应于这11种蛋白质的开放阅读框的顺序是3
’‑
ns1-ns2-n-p-m-sh-g-f-m2-1-m2-2-l-5’。
5.rsv是一种已知引起呼吸道感染的流行病原体，其可导致严重的疾病，甚至死亡，特别是在幼儿和老年人中。据估计，rsv在世界范围内引起超过3300万的下呼吸道疾病、300万的住院治疗，以及每年近200,000儿童死亡，其中许多死亡发生在发展中国家。然而，尽管rsv的流行和与这种感染相关的危险，迄今为止还没有成功地开发出rsv疫苗。因此，需要rsv疫苗，如基于本文公开内容的那些。发明概述
6.本发明提供了编码具有减毒表型的呼吸道合胞病毒(rsv)变体的多核苷酸，其包含修饰的rsv基因组或反基因组，所述修饰的rsv基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本rsv蛋白p的突变rsv蛋白p。在一些实施方案中，所述多核苷酸是重组的。在一些实施方案中，所述修饰的rsv基因组或反基因组的至少一个基因是密码子对去优化的。
7.本发明还提供了包含本文所述的多核苷酸的rsv变体以及包含一种或多种rsv变体和至少一种赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，组合两种或更多种rsv变体以形成多价rsv疫苗组合物。
8.本发明还提供了接种对象的方法，其包括将如本文所述的药物组合物施用至动物；以及在动物中诱导免疫应答的方法，其包括将本文所述的一种或多种rsv变体施用至动物。在一些实施方案中，所述动物是人。
9.本发明还提供了生产rsv疫苗的方法，其包括在细胞中表达一种或多种本文所述的多核苷酸。
10.在下面的详述中提供了本发明的另外方面和实施方案。附图简述
11.图1比较了野生型rsv与密码子对去优化(cpd)rsv变体(min a)的结构。
12.图2描绘了使用从32℃至40℃的温度增量增加以向min a rsv变体施加温度应激的方案的示意图。
13.图3a说明了在图2所示的方案期间在32至40℃的每个温度下min a rsv变体的病毒滴度。
14.图3b说明了在32℃下连续培养的min a rsv变体(对照)的病毒滴度。
15.图4a和4b说明了分别在图3a和3b中所示的min a rsv变体使用全基因组深度测序进行测序的点(第18代)。
16.图5描绘了总结在温度应激的min a rsv变体(每个用谱系号表示)的磷蛋白(p)基因的核苷酸序列中鉴定的突变的图表，其中每个突变引起p蛋白的氨基酸序列改变(即，每个突变是非同义突变)。
17.图6描绘了用野生型rsv或某些min arsv变体感染的vero细胞(moi＝0.01pfu/细胞，37℃)中的病毒滴度。
18.图7描绘了用野生型rsv或某些min arsv变体感染的vero细胞(moi＝3pfu/细胞，37℃)中的病毒滴度。
19.图8描绘了在仓鼠中测试某些min arsv变体的复制和免疫原性的示意图。
20.图9描绘了某些min arsv变体的病毒滴度，证明了变体在仓鼠中的复制能力。
21.图10描绘了先前感染了某些min arsv变体的仓鼠中rsv中和抗体的水平。
22.图11描绘了先前在鼻甲(nt)和肺中被某些min arsv变体激发的仓鼠中的病毒滴度。
23.图12a-h是描绘了某些rsv毒株的生长动力学(图12a-12d)和噬菌斑大小(图12e-12h)的图。
24.图13是描绘了与min a rsv毒株相比，某些rsv毒株的rna合成速率倍数增加的一组图。
25.图14a-f是描绘了某些rsv毒株的蛋白质表达(图14a-14d)以及描绘了某些rsv毒株的病毒产量(图14e-14f)的一系列图和一个图片。
26.图15a-b是描绘了某些rsv毒株(图15a)和相应对照(图15b)的温度应激测试结果的两个图。
27.图16a-c是min a和某些min a衍生物的基因图谱示意图(图16a)，以及描绘了那些min a衍生物的复制的图(图16b-16c)。
28.图17a-c是描绘了某些rsv毒株的复制(图17a)、保护功效(图17b)和免疫原性(图17c)的图。
29.图18a-b是描绘了某些rsv毒株(图18a)和相应对照(图18b)的温度应激测试结果的两个图。发明详述
30.本发明提供了编码具有减毒表型的呼吸道合胞病毒(rsv)变体的多核苷酸，其包含修饰的rsv基因组或反基因组，所述修饰的rsv基因组或反基因组编码在一个或多个氨基
酸残基处不同于亲本rsv蛋白p的突变rsv蛋白p。在一些实施方案中，多核苷酸是重组的。在一些实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组的至少一个基因是密码子对去优化的。密码子对去优化
31.在一些实施方案中，减毒rsv变体的基因组或反基因组是密码子对去优化的(cpd)。cpd以及密码子去优化(cd)和增加二核苷酸cpg和upa含量是修饰病毒核苷酸序列的技术，其可导致病毒的减毒。在cd中，以由新密码子编码的氨基酸仍然与由原始密码子编码的氨基酸相同，即cd涉及将同义突变插入orf的方式，修饰编码病毒的核苷酸序列以改变基因的开放阅读框(orf)内的一个或多个密码子。该过程可影响核苷酸序列的某些特征，包括密码子偏倚、密码子对偏倚、cpg二核苷酸含量、c+g含量、去优化密码子和去优化密码子对的密度、rna二级结构、翻译框位点、翻译暂停位点、组织特异性微rna识别序列的存在或缺失或以上的任何组合。
32.cpd是基于某些密码子对出现频率高于或低于预期的观察。例如，密码子对丙氨酸-谷氨酸由核苷酸碱基gcc gaa和gca gag编码。如果这些密码子对随机出现，则预期会一半时间看到gcc gaa以及一半时间看到gcagag。然而，gcc gaa是强烈无代表性的，出现频率仅为gca gag的1/7。不希望受任何特定理论的束缚，认为这种密码子对偏倚的存在源于某些密码子对对mrna稳定性或合成、翻译效率(一些trna对在核糖体上的相互作用效率较低)和/或先天免疫(可能是二核苷酸偏倚的结果，就免疫系统寻求抑制tlr配体cpg和upa而言)的影响。
33.已经利用密码子对偏倚经由cpd制备弱化的，即减毒的病毒毒株。参见，例如，美国专利第9,957,486号，将其通过引用以其整体并入本文。随着合成生物学的出现，包括大规模定制dna合成的可用性和可提供性增加，可以大量进行与病毒的orf的核苷酸序列的同义突变，以利用密码子对偏倚来减毒毒株，例如通过降低所得病毒的复制适合度。换句话说，现在可以在基因组水平上应用cpd。使用cpd作为用于产生减毒rsv毒株的技术的优点是，当在毒株中进行大量突变时，返回毒力的概率可能极低。在cpd之后，含有cpd rsv变体的基因组或反基因组的核苷酸序列编码与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组相同的氨基酸序列。然而，可以将其它突变引入cpd rsv变体的基因组或反基因组中，使得cpd rsv变体的基因组或反基因组不再编码与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组相同的氨基酸序列。在rsv变体与亲本和/或野生型rsv毒株之间的氨基酸水平上的相似性是期望的，因为序列之间增加的相似性导致cpd和亲本和/或野生型rsv毒株将表现出许多或甚至所有相同表位的可能性增加。由于此类表位诱导细胞免疫和体液免疫，cpd rsv变体理想地在氨基酸水平上至少部分地类似于亲本和/或野生型rsv毒株。
34.因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸包含密码子对去优化的修饰的rsv基因组或反基因组。在某些实施方案中，cpd rsv变体毒株和相应的亲本和/或野生型毒株编码相同的氨基酸序列。然而，不需要在氨基酸水平上的同一性。因此，在其它实施方案中，由编码cpd rsv变体的基因组或反基因组的多核苷酸编码的氨基酸序列与编码野生型rsv毒株基因组或反基因组的多核苷酸编码的氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同或者与其至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、
98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同。
35.本文所提及的核苷酸或氨基酸序列“同一性”可以通过将感兴趣的核苷酸或氨基酸序列与参考核苷酸或氨基酸序列进行比较来确定。同一性百分比是与最佳比对的感兴趣序列和参考序列之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸残基的数目除以最长序列的长度(即感兴趣的序列或参考序列的长度，以更长者为准)。序列的比对和同一性百分比的计算可以使用可用的软件程序进行。这种程序的实例包括clustal-w、t-coffee和align(用于核酸和氨基酸序列的比对)，blast程序(例如blast 2.1、bl2seq、blastp、blastn等)和fasta程序(例如fasta3x、fastm和ssearch)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法也公开在例如altschul等人,j.molecular biol.,215(3):403-410(1990)，beigert等人,proc.natl.acad.sci.usa,106(10):3770-3775(2009),durbin等人编,biological sequence analysis:probalistic models of proteins and nucleic acids,cambridge university press,cambridge,uk(2009),soding,bioinformatics,21(7):951-960(2005),altschul等人,nucleic acids res.,25(17):3389-3402(1997),and gusfield,algorithms on strings,trees and sequences,cambridge university press,cambridge uk(1997))中。序列的同一性百分比(％)也可以计算为例如100
×
[(相同位置)/min(tga,tgb)]，其中tga和tgb是使tga和tgb最小化的比对中肽序列a和b残基和内部缺口位置的总数。参见，例如，russell等人,j.mol biol.,244:332-350(1994)。
[0036]
在一些实施方案中，计算机程序计算rsv基因组或反基因组的一个或多个orf内突变的位置和数目，以产生所需的rsv cpd基因组或反基因组核苷酸序列。参见，例如，coleman等人,science,320(5884):1784-1787(2008)。此类程序可以产生代表性不足的密码子对(即，去优化密码子对)，同时使密码子使用和核苷酸频率不变。
[0037]
因此，在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组中一个或多个orf中的密码子使用和/或核苷酸频率与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组中相应的一个或多个orf中的密码子使用和/或核苷酸频率相同。在其它实施方案中，rsv变体的基因组中一个或多个orf中的密码子使用和/或核苷酸频率不同于亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组中相应的一个或多个orf中的密码子使用和/或核苷酸频率。在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组中所有orf中的密码子使用和/或核苷酸频率与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组中所有orf中的密码子使用和/或核苷酸频率大致相同。在优选的实施方案中，编码rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的rsv变体的基因组中orf中的密码子使用和/或核苷酸频率与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组中相应的orf中的密码子使用和/或核苷酸频率大致相同。
[0038]
此外，使用cpd，通过调整引入编码病毒蛋白的一个或多个orf的核苷酸序列中的突变数目，可以将病毒的减毒水平调节到所需的水平。因此，在一些实施方案中，与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组序列相比，包含cpd rsv变体的基因组或反基因组的多核苷酸含有50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650或2700个同义突变或者在由前述值中的任两个界定的范
围内的同义突变。在某些实施方案中，包含cpd rsv变体的基因组或反基因组的多核苷酸是重组的、分离的和/或非天然存在的，即在自然界中未发现。
[0039]
在一些实施方案中，本文所述的突变在单独使用或与另一突变组合使用时可以提供不同水平的病毒减毒，提供调节减毒和免疫原性之间平衡的能力以及提供比亲代病毒更稳定的基因型。
[0040]
可以通过例如定量存在于免疫宿主的呼吸道中的病毒的量，以及将该量与亲本和/或野生型rsv或已被评价为候选疫苗毒株的其它减毒rsv病毒产生的量进行比较来确定疫苗病毒的减毒水平。例如，与亲本病毒和/或野生型病毒的复制水平相比，本发明的减毒病毒在诸如黑猩猩的高度易感宿主的上呼吸道中具有更大程度的复制限制，例如低10至1000倍。为了进一步减少与病毒在上呼吸道中的复制相关的鼻漏的发展，理想的候选疫苗病毒应该在上呼吸道和下呼吸道中都表现出有限的复制水平。为了有效，本文公开的rsv变体应该在人中具有足够的感染性和免疫原性，以在接种疫苗的个体中提供保护。用于测定感染宿主的鼻咽中rsv水平的方法在文献中是众所周知的。通过抽吸或洗出鼻咽分泌物和在组织培养物或其它通过实验室程序定量的病毒来获得样本。参见，例如，belshe等人,j.med.virology,1:157-162(1977),friedewald等人,j.amer.med.assoc.,204:690-694(1968)；gharpure等人,j.virol.,3:414-421(1969)；以及wright等人,arch.ges.virusforsch.,41:238-247(1973)。可以方便地在宿主动物如黑猩猩的鼻咽中测量病毒。
[0041]
在一些实施方案中，rsv变体可包含rsv和/或相关病毒的其它已知减毒突变以产生其它减毒表型。许多这样的突变是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，m2-2orf、ns1 orf或ns2 orf可以从cpd rsv基因组或反基因组中部分或完全缺失。
[0042]
在一些实施方案中，编码具有减毒表型的重组呼吸道合胞病毒(rsv)变体的本发明多核苷酸包含修饰的rsv基因组或反基因组，其编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本rsv蛋白p的突变rsv蛋白p，其中编码一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的亲本和/或野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约95％的同一性。在一些实施方案中，编码一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的修饰rsv基因组或反基因组的核苷酸序列是cpd。
[0043]
在一些实施方案中，包含编码rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m、sh、g、f、m2-1、m2-2和l的一种或多种的cpd rsv基因组或反基因组的核苷酸序列的多核苷酸与编码rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m、sh、g、f、m2-1、m2-2和l的相同的一种或多种的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性百分比。在一些实施方案中，包含编码rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的一种或多种的cpd rsv基因组或反基因组的核苷酸序列的多核苷酸与编码rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的相同的一种或多种的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100的同一性百分比。在一些实施方案中，亲本和/或野生型rsv基因组由seq id no:1表示。
[0044]
在一些实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组的一个或多个orf是cpd。已经被
密码子对去优化的一个或多个orf(即，编码一种或多种rsv蛋白的修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列)可以选自编码以下rsv蛋白的orf：即结构蛋白ns1或ns2、结合rna的核衣壳蛋白(n)、磷蛋白(p)、内部基质蛋白(m)、小疏水表面糖蛋白(sh)、粘附糖蛋白(g)、融合蛋白(f)、由相同mrna的部分编码的两种蛋白(m2-1和m2-2)之一和大聚合酶蛋白(l)。这包括rsv蛋白的任何组合。已经被密码子对去优化的一个或多个orf可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个orf。在某些实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf仅编码ns1，仅编码ns2，仅编码n，仅编码p，仅编码m或仅编码sh。在某些其它实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf编码ns1和ns2，或ns1和n，或ns1和p，或ns1和m，或ns1和sh，或ns1、ns2、和n，或ns1、ns2和p，或ns1、ns2和m，或ns1、ns2和sh，或ns1、ns2、n和p，或ns1、ns2、n和m，或ns1、ns2、n和sh，或ns1、n和p，或ns1、n和p，或ns1、n和m、ns1、n和sh，或ns1、p和m，或ns1、p和sh，或ns1、m和sh，或ns1、ns2、n和p，或ns1、ns2、n和m，或ns1、ns2、n和sh，或ns1、ns2、p和m，或ns1、ns2、p和sh，或ns1、ns2、n、p和m，或ns1、ns2、n、p和sh，或ns2和n，或ns2和p，或ns2和m，或ns2和sh，或ns2、n和p，或ns2、n和m，或ns2、n和sh，或ns2、p和m，或ns2、p和sh，或ns2、n、p和m，或ns2、n、p和sh，或ns2、n、p、m和sh，或n和p，或n和m，或n和sh，或n、p和m，或n、p和sh，或n、p、m和sh，或p和m，或p和sh，或p、m和sh，或m和sh。在一个优选的实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf编码ns1、ns2、n、p、m和sh。在这样的实施方案中，没有特异性地指出为密码子对去优化的其余orf不是密码子对去优化的。
[0045]
在某些实施方案中，已经被密码子对去优化的修饰rsv基因组或反基因组的一个或多个orf各自独立地具有小于约0.0的密码子对偏倚值。在另一个实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf各自独立地具有小于约0.0的密码子对偏倚值。在某些实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf各自独立地具有小于约-0.10的密码子对偏倚值。在某些实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf各自独立地具有约-0.10至-0.40的密码子对偏倚值。在进一步的实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf选自ns1、ns2、n、p、m和sh，其中ns1、ns2、n、p、m和sh的密码子对偏倚值分别为约-0.14(ns1)，约-0.22(ns2)，约-0.31(n)，约-0.24(p)、-0.31(m)和-0.18(sh)。在进一步的实施方案中，对于总共6个密码子对去优化的orf，已经被密码子对去优化的一个或多个orf是ns1、ns2、n、p、m和sh，其中ns1、ns2、n、p、m和sh的密码子对偏倚值分别为约-0.14(ns1)，约-0.22(ns2)，约-0.31(n)，约-0.24(p)、-0.31(m)和-0.18(sh)。根据coleman等人,science,320(5884):1784-1787(2008)中示出的算法计算密码子对偏倚值。
[0046]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中的编码ns1蛋白的orf，即核苷酸序列是密码子对去优化的。在某些实施方案中，编码rsv蛋白ns1的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv ns1蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约87％的同一性。在其它实施方案中，编码rsv ns1蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸99至518表示。
[0047]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中编码ns2蛋白的orf，即核苷酸序列是密码子对去优化的。在某些实施方案中，编码rsv蛋白ns2的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约
75％至约95％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv ns2蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约88％的同一性。在其它实施方案中，编码rsv ns2蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸628至1002表示。
[0048]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中编码n蛋白的orf，即核苷酸序列是cpd。在某些实施方案中，编码rsv蛋白n的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约70％至约90％的同一性。在某些实施方案中，编码rsv n蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约80％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv n蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸1141至2316表示。
[0049]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中编码p蛋白的orf，即核苷酸序列是密码子对去优化的。在某些实施方案中，编码rsv蛋白p的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。在某些实施方案中，编码rsv ns1蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约84％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv p蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸2347至3072表示。
[0050]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中编码m蛋白的orf，即核苷酸序列是密码子对去优化的。在某些实施方案中，编码rsv蛋白m的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。在某些实施方案中，编码rsv m蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约83％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv m蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸3262至4032表示。
[0051]
在某些实施方案中，在rsv变体的基因组或反基因组中编码sh蛋白的orf，即核苷酸序列是密码子对去优化的。在某些实施方案中，编码rsv蛋白sh的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的亲本和/或野生型rsv基因组的orf，即核苷酸序列具有约85％至约95％的同一性。在某些实施方案中，编码rsv sh蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的亲本和/或野生型rsv基因组的核苷酸序列具有约92％的同一性。在进一步的实施方案中，编码rsv sh蛋白的修饰的rsv基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸4304至4498表示。
[0052]
在一个实施方案中，已经被密码子对去优化的一个或多个orf编码ns1、ns2、n、p、m和sh，并且由seq id no:2表示的核苷酸序列含有密码子对去优化的orf的核苷酸序列。
[0053]
在某些实施方案中，由修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列与由亲本和/或野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列相同。除了突变rsv蛋白p不同于亲本和/或野生型rsv蛋白p的一个或多个氨基酸残基。在某些实施方案中，由修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列与亲本和/或野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码
的相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同，或者与亲本和/或野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.1％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同。在一些实施方案中，当由修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的氨基酸序列编码两种或更多种rsv蛋白时，使用两种或更多种rsv蛋白的组合氨基酸序列计算同一性百分比。在其它实施方案中，对两种或更多种rsv蛋白中的每一种单独计算，并且针对每种蛋白的同一性百分比必须至少是所述的同一性百分比。
[0054]
如前所述，当在rsv变体，如cpd rsv变体中进行大量突变时，回复毒力(即去减毒(de-attenuation))的概率被认为较低。然而，为了研究去减毒，有利的是使感兴趣的病毒经受强的选择压力。对其它cpd病毒的先前去减毒研究的局限性在于缺乏这样强的选择压力。参见，例如，bull等人,mol.biol.and evol.,29(10):2997-3004(2012)；burns等人,j.virol.,80(19):9687-9696(2006)；cheng等人,virology,501:35-46(2015)；coleman等人,science,320(5884):1784-7(2008)；meng等人,mbio,5.5:301704-14(2014)；mueller等人,j.virol.,80(19):9687-96(2006)；ni等人,virology,450:132-139(2014)；nougairede等人,plos pathogens 9.2(2013)。鉴于至少一些cpd rsv变体是温度敏感的，这种rsv变体为研究cpd病毒的去减毒提供了一个极好的对象。参见，例如，美国专利申请公开2019/0233476a1，将其通过引用整体并入本文。温度敏感的病毒具有截止温度，在该温度下它们不能继续复制。
[0055]
通过在体外连续培养此类cpd rsv病毒，同时将它们暴露于从许可温度(即病毒可以继续复制的温度)到接近和达到病毒的截止温度的温度逐步升高的温度，可以鉴定在那些cpd rsv病毒的先前截止温度附近或之处拯救在它们中的复制的突变。
[0056]
使用该技术，本技术的发明人鉴定了在某些cpd rsv毒株中拯救复制的rsv蛋白p中的突变。当将这些去减毒突变引入回到原始cpd rsv毒株中时，令人惊讶地发现，与不含任何推测的去减毒突变的原始cpd rsv毒株相比，所得rsv变体表现出增加的减毒，增加的遗传稳定性和/或增加的免疫原性。具有减毒表型的rsv变体的多核苷酸
[0057]
本发明包括编码具有减毒表型的呼吸道合胞病毒(rsv)变体的多核苷酸，其包含修饰的rsv基因组或反基因组，所述修饰的rsv基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本和/或野生型rsv p蛋白的突变rsv p蛋白。所述多核苷酸包含至少部分地编码包含rsv蛋白磷蛋白(p)的氨基酸序列的基因组或反基因组。与亲本和/或野生型rsv中的rsv p蛋白的氨基酸序列相比，由多核苷酸的基因组或反基因组编码的p蛋白的氨基酸序列包含一个或多个突变。在一些实施方案中，多核苷酸是重组的。在一些实施方案中，所述多核苷酸是分离的。优选地，所述多核苷酸不是天然存在的，即在自然界中不存在。在一些实施方案中，具有减毒表型的修饰的rsv基因组或反基因组的至少一个基因是cpd的。
[0058]
在某些实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组编码突变rsv p蛋白，其在1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基处不同于亲本和/或野生型rsv p蛋白。在一些实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组编码突变rsv p蛋白，其具有在选自19-34、107、229、234和235的一个或多个位置处与seq id no：6所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这包括在这些位置处的突变的任何和所有组合。优选地，所述一个或多个位置选自25、26、27、28、29、30、31、32、33、34及其任何组合。更优选地，所述一个或多个位置选自25、27、28、32、34及其任何组合。在一些实施方案中，所述一个或多个位置是32和34。在其它实施方案中，所述一个或多个位置是27和28。
[0059]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在至少第19位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列第19位的残基是异亮氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第19位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第19位的残基是异亮氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第19位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第19位的残基是异亮氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0060]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在至少第20位与seq id no:6所示的氨基酸序列不同。在某些实施方案中，氨基酸序列的第20位的残基是酪氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第20位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第20位的残基是酪氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第20位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第20位的残基是酪氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0061]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在至少第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸、谷氨酸或天冬酰胺。在另一个实施方案中，氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸。
[0062]
在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸，并且其中所述修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。在另一个实施方案中，氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基
因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第25位的残基是天冬酰胺，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第25位的残基是天冬酰胺，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0063]
在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第25位的残基是谷氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第25位的残基是谷氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0064]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在至少第27位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第27位的残基是谷氨酸或天冬酰胺。在另一个实施方案中，氨基酸序列的第27位的残基是天冬酰胺。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第27位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第27位的残基是天冬酰胺，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第27位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第27位的残基是天冬酰胺，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。在进一步的实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组包含核苷酸序列seq id no:20，基本上由核苷酸序列seq id no:20组成或由核苷酸序列seq id no:20组成。在另一个实施方案中，多核苷酸包含核苷酸序列seq id no:20，基本上由核苷酸序列seq id no:20组成或由核苷酸序列seq id no:20组成。
[0065]
在另一个实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码(a)突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第27位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第27位的残基是天冬酰胺，以及(b)突变l蛋白，其仅在第151位不同于seq id no:13所示的氨基酸序列，其中在第151位的残基是丙氨酸；其中所述修饰的rsv基因组或反基因组包含对应于n5’非翻译区(utr)的核苷酸序列seq id no:17；并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。在进一步的实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组包含核苷酸序列seq id no:21，基本上由核苷酸序列seq id no:21组成或由核苷酸序列seq id no:21组成。在另一个实施方案中，多核苷酸包含核苷酸序列seq id no:21，基本上由核苷酸序列seq id no:21组成或由核苷酸序列seq id no:21组成。
[0066]
在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变
id no:16，(b’)对应于p基因起始和5’utr区的核苷酸序列seq id no:18，和(c’)对应于p 3’utr的核苷酸序列seq id no:19；并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。在进一步的实施方案中，修饰的rsv基因组或反基因组包含核苷酸序列seq id no:24，基本上由核苷酸序列seq id no:24组成或由核苷酸序列seq id no:24组成。在另一个实施方案中，多核苷酸包含核苷酸序列seq id no:24，基本上由核苷酸序列seq id no:24组成或由核苷酸序列seq id no:24组成。
[0070]
在另一个实施方案中，氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第28位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第28位的残基是脯氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第28位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第28位的残基是脯氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0071]
在另一个实施方案中，氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第28位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第28位的残基是异亮氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第28位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第28位的残基是异亮氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0072]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在至少第32位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列仅在第32位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第32位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0073]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白p，所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列在至少第34位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第34位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述
突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第34位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0074]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白p，所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列在至少第107位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第107位的残基是赖氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第107位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第107位的残基是赖氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第107位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第107位的残基是赖氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0075]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白p，所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列在至少第229位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第229位的残基是谷氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第229位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第229位的残基是谷氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第229位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第229位的残基是谷氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0076]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白p，所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列在至少第234位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第234位的残基是组氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第234位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第234位的残基是组氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第234位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第234位的残基是组氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0077]
在某些实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白p，所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列在至少第235位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列的第235位的残基是甘氨酸。在进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第235位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第235位的残基是甘氨酸，并且优选地其中修饰的rsv基因组或反基因组包含至少一个为cpd的基因。在
进一步的实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv蛋白，所述突变rsv蛋白的氨基酸序列仅在第235位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第235位的残基是甘氨酸，并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0078]
在另一个实施方案中，包含修饰的rsv基因组或反基因组的多核苷酸编码突变rsv p蛋白，所述突变rsv p蛋白的氨基酸序列在第27位或第28位不同于seq id no：6所示的氨基酸序列，其中所述氨基酸的第27位的残基是天冬酰胺，或者所述氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸，其中所述修饰的rsv基因组或反基因组包含一个或多个以下特征：(a)编码突变l蛋白，其仅在第2084位不同于seq id no:13所示的氨基酸序列，其中第2084位的残基是脯氨酸；(b)编码突变m蛋白，其仅在第123位不同于seq id no：7所示的氨基酸序列，其中第2084位的残基是甲硫氨酸；(c)包含对应于ns2 5’非翻译区(utr)的核苷酸序列seq id no:16；(d)包含对应于p基因起始和5’utr区的核苷酸序列seq id no:18，以及(e)包含对应于p 3'utr的核苷酸序列seq id no:19；并且其中修饰的rsv基因组或反基因组的ns1、ns2、n、p、m和sh基因各自是cpd的。
[0079]
如本文所用，术语“野生型”是指任何天然存在的rsv毒株，包括从天然来源，如哺乳动物对象分离的那些。示例性野生型rsv毒株亚组包括但不限于人rsv亚组a和b，其可进一步分类为基因型，如a1、a2、a3、a4、a5、a6、a6以及其他命名，如ga1-7、saa1、na1-4和on1-2，以及b1、b2、b3、b4和其它命名，如gb1-4、sab1-4、uru1-2和ba1-10。示例性的特异性毒株包括rsv a2、rsv long、rsv 8-60和rsv 18537。本文所用的氨基酸位置编号基于野生型rsv a2毒株的氨基酸序列(genbank登录号m74568，将其通过引用并入本文)，并且所述的所有核苷酸序列都是正义的。11种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m、sh、g、f、m2-1、m2-2和l的氨基酸序列分别由seq id no:3-13表示。
[0080]
术语“野生型”还旨在涵盖rsv毒株a2的重组形式，称为d46。d46的完整序列显示在美国专利第6,790,449号中(genbank登录号kt992094，将其通过引用并入本文)。在一些情形和出版物中，亲本病毒和序列被称为d53而不是d46，这是一种簿记差异(book-keeping difference)，指用于繁殖反基因组cdna的细菌菌株，并且没有其它已知的意义或影响。为了本公开内容的目的，d46和d53是可互换的。d46的核苷酸序列在25个核苷酸位置不同于rsv a2毒株m74568的序列，其包括在第1099位的1-nt插入。
[0081]
在病毒、蛋白质或多核苷酸的上下文中使用的术语“亲本”和“亲本的”表示从其衍生另一种病毒的病毒、蛋白质或多核苷酸。在一些实施方案中，通过重组手段制备衍生的病毒，或通过在引起突变的条件下培养亲本病毒，从而培养不同的病毒来制备。在一些实施方案中，该术语是指病毒基因组和蛋白编码序列，从其中衍生可或多或少减毒的新序列。在一些实施方案中，亲本(或亲本的)病毒和序列是野生型或天然存在的原型或变体的分离物，针对其期望获得更高度减毒的病毒。在某些其它实施方案中，亲本(或亲本的)病毒是在实验室中基于真实或感知到的所需特性特异性产生或选择的突变体。因此，在某些实施方案中，作为减毒候选物的亲本(或亲本的)病毒是野生型突变体。在其它实施方案中，亲本(或亲本的)病毒是具有缺失、插入、氨基酸取代等的天然存在的病毒。在进一步的实施方案中，亲本(或亲本的)病毒是具有密码子取代的突变体。
[0082]
本领域技术人员将认识到，包含某些rsv变体的基因组或反基因组的多核苷酸可
以具有改变编码的氨基酸序列的核苷酸插入或缺失，这在一些情况下可以改变一个或多个氨基酸残基的位置。例如，如果与毒株a2相比，另一种rsv毒株的蛋白在蛋白的上游端具有两个另外的氨基酸，这将导致相对于毒株a2的下游残基的氨基酸编号增加两个的增量。然而，因为这些毒株共有很大程度的序列同一性，所以本领域技术人员将能够通过简单地将a2参考毒株的核苷酸或氨基酸序列与讨论中的毒株的核苷酸或氨基酸序列进行比对来确定相应序列的位置。因此，应当理解，尽管在本公开内容的上下文中具体列举，但本文所述的氨基酸和核苷酸位置可以对应于当发生序列移位时或由于病毒毒株之间的序列变异而产生的其它位置。在两种或更多种相关病毒之间的蛋白质、或蛋白质区段、或orf、或基因、或基因组、或基因组区段的比较中，“相应的”氨基酸或核苷酸残基是在不同rsv物种中在功能上完全或近似等同的氨基酸或核苷酸残基。
[0083]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码的氨基酸序列可以含有与亲本和/或野生型rsv毒株的基因组或反基因组编码的氨基酸序列的另外差异。例如，在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码的氨基酸序列可以包含f蛋白中的一个或多个变化，例如“hek”突变，其包含f蛋白中的两个氨基酸取代，即k66e和q101p(描述在connors等人,virology,208:478-484(1995)；whitehead等人,j.virol.,72:4467-4471(1998))。将hek氨基酸分配引入到本公开内容的毒株a2f序列产生f蛋白氨基酸序列，其与毒株a2的原始临床分离物的早期传代(人胚肾细胞传代7，hek-7)的f蛋白氨基酸序列相同(connors等人,virology,208:478-484(1995)；whitehead等人,j.virol.,72:4467-4471(1998))。它导致融合性低得多，并且被认为代表了原始a2毒株临床分离物的表型的f蛋白(liang等人,j.virol.,89:9499-9510(2015))。hek f蛋白也形成更稳定的三聚体(liang等人,j.virol.,89:9499-9510(2015))。这可以提供可能富含高度免疫原性的融合前构象的更真实的和免疫原性形式的rsv f蛋白(mclellan等人,science,340(6136):1113-1117(2013)；mclellan等人,science,342(6158):592-598(2013))。因此，除了对病毒复制的大小产生影响外，还可以引入突变。
[0084]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码的氨基酸序列可以包含l蛋白中的一个或多个变化，例如稳定的1030或“1030s”突变，其包含1321k(aaa)/51313(tca)(luongo等人,j.virol.,86:10792-10804(2012))。
[0085]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码的氨基酸序列可以包含n蛋白中的一个或多个变化，例如，氨基取代，如t24a。
[0086]
已经显示sh、ns1和ns2基因的单独和组合的缺失产生在细胞培养中保留其复制的能力，但在体内以增加量级的以下顺序减毒的病毒：sh《ns2《ns1(bukreyev等人,j.virol.,71:8973-8982(1997)；whitehead等人,j.virol.,73:3438-3442(1999)；teng等人,j.virol.,74:9317-9321(2000))。因此，在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组包含sh、ns2或ns1基因或者它们的orf的一部分的缺失或其它突变，与本文所述的一个或多个突变组合。例如，在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码的氨基酸序列可以包含sh蛋白中的一个或多个变化，包括sh蛋白的切除或消除。在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组包含sh基因的缺失。在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组在(第4198位-第4616位)的第4197位-第4615位包含419个核苷酸缺失，在本文中表示为“δsh”突变。这种缺失导致m基因末端，m/sh基因间区的缺失和sh orf的缺失。在一些实施
方案中，rsv变体的基因组或反基因组包含ns1或ns2蛋白中的一个或多个变化，这可导致蛋白的切除或消除。在一些实施方案中，突变编码ns2蛋白中的氨基取代，如k51r。
[0087]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码“cp”突变。这种突变是指在三种蛋白中的一组五个氨基酸取代(n(v2671)、f(e218a和t5231)和l(c319y和h1690y))，其在血清阴性黑猩猩中提供大约10倍的复制减少，以及疾病减少(whitehead等人,j.virol.,72:4467-4471(1998))。cp突变与中度减毒表型相关(whitehead等人,j.virol.,72:4467-4471(1999))。
[0088]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组编码l蛋白中的一个或多个氨基酸取代，包括n43i、f521l、q831l、m1169v和/或y1321n。每个取代独立地提供温度敏感表型(即，减毒表型)并且可以任选地与对rsv变体的核苷酸序列的其它修饰组合，所述其他修饰如m2基因的基因起始转录信号中的单核苷酸变化(ggggcaaata[seq id no:14]至ggggcaaaca[seq id no:15]，mrna有义)、或缺失密码子1313和l蛋白中的氨基酸取代i1314l。
[0089]
rsv变体的基因组或反基因组中基因顺序的改变(即，将一个或多个基因移动到重组病毒基因组中更接近启动子或远离启动子的位置的位置修饰)可导致具有改变的生物学特性的rsv病毒。例如，单独缺乏ns1、ns2、sh或g，或同时缺乏ns1和ns2，或同时缺乏sh和g的rsv毒株已经显示在体外、体内或两者中减毒。特别地，g和f基因可以相对于它们的亲本和/或野生型基因顺序单独地和串联地转移到更接近启动子的位置。这两种蛋白通常在rsv基因顺序(ns1-ns2-n-p-m-sh-g-f-m2-1-m2-2-l)中占据第7位(g)和第8位(f)。在一些实施方案中，编码g和f蛋白的核苷酸序列的顺序可以相对于天然存在的顺序颠倒。
[0090]
除了本文描述的突变之外，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸还可以掺入来自任何rsv或rsv样病毒，例如人，牛，绵羊，鼠(小鼠肺炎病毒)或禽(火鸡鼻气管炎病毒)肺炎病毒，或者来自另一种包膜病毒，例如，副流感病毒(nv)的异源、编码或非编码核苷酸序列。示例性异源序列包括来自一个人rsv毒株的rsv核苷酸序列与来自不同人rsv毒株的核苷酸序列的组合。可选地，rsv可以掺入来自两个或更多个亲本野生型和/或突变的人rsv亚组的核苷酸序列，例如人rsv亚组a和亚组b序列的组合。在进一步的实施方案中，一个或多个编码人rsv或非编码多核苷酸被来自异源rsv或非rsv病毒的对应序列取代。
[0091]
除了本文所述的多核苷酸和所得rsv变体之外，本领域技术人员将理解还可以对所公开的病毒进行进一步修饰。例如，rsv变体的基因组或反基因组可以具有除去的或以其它方式突变的一种或多种蛋白的orf，或者可以向其中加入来自不同有机体的异源基因，使得cpd rsv的基因组或反基因组在感染细胞和复制时表达或掺入该蛋白。此外，本领域技术人员将认识到，已知对rsv具有影响的其它先前定义的突变可以与本文所述的任何突变中的一种或多种组合以产生具有所需减毒或稳定性特征的cpd rsv。
[0092]
在其它实施方案中，可以将另外的修饰掺入到rsv变体的基因组或反基因组中，其以除减毒以外的方式影响毒株的特征。例如，编码rsv蛋白的一个或多个orf可以在如本文所述的rsv变体需要的上下文中进行密码子优化。主要的保护性抗原f和g可导致增加的抗原合成。f和/或g蛋白基因可以向上游移动(即更靠近启动子)以增加表达。可以修饰编码f和/或g蛋白的氨基酸序列以代表当前流行的毒株，这在不同g蛋白的情况下可能是特别重要的；或者以代表早期传代的临床分离物。可以将缺失或取代引入编码g蛋白的核苷酸序列
中以获得改善的免疫原性或其它所需的特性。例如，可以切除g蛋白中的cx3c fractalkine基序以提高免疫原性(chirkova等人,j.virol.,87:13466-13479(2013))。
[0093]
在一些实施方案中，cpd rsv的基因组或反基因组包含orf的核苷酸序列，其尚未进行密码子对去优化并且已经被来自临床分离物的核苷酸序列替代。例如，编码rsv g蛋白的orf的核苷酸序列可以被来自临床分离物，如a/马里兰/001/11的核苷酸序列替代。在一些实施方案中，编码rsv f蛋白的核苷酸序列可以被来自临床分离物，如a/maryland/001/11的核苷酸序列替代。
[0094]
在一些实施方案中，编码rsv变体的一种或多种蛋白的初始或天然存在的核苷酸序列被密码子优化的序列替代，所述密码子优化的序列被设计用于在选择的宿主，例如在人中增加表达。在一些实施方案中，编码rsv f蛋白的核苷酸序列被密码子优化的序列替代。在一些实施方案中，编码rsv f蛋白的orf的核苷酸序列被来自临床分离物，如a/马里兰/001/11的密码子优化的序列替代。在一些实施方案中，编码rsv g蛋白的核苷酸序列被来自临床分离物，如a/maryland/001/11的密码子优化的核苷酸序列替代。
[0095]
在一些实施方案中，rsv变体的基因组或反基因组还包含一个或多个非翻译序列的缺失。在实施方案中，sh基因下游末端的一部分被缺失，产生本文称为“6120突变”的突变。6120突变包括sh基因下游非翻译区的112个核苷酸的缺失，以及在sh基因的最后三个密码子和终止密码子中引入5个翻译沉默点突变(bukreyev等人,j.virol.,75:12128-12140(2001))。术语“lid”或“6120”在重组病毒名称中的存在表明重组病毒含有6120突变。
[0096]
6120突变使细菌中的反基因组cdna稳定，从而可以更容易地操作和制备。在野生型rsv毒株中，已经发现该突变赋予体外复制效率增加5倍(bukreyev等人,j.virol.,75:12128-12140(2001))，而不认为它增加体内复制效率。
[0097]
6120突变与血清阴性婴幼儿和儿童中增加的复制有关。因此，6120突变提供了另一种改变减毒水平的手段。此外，在sh基因的下游非翻译区中的6120突变所例示的序列缺失可涉及不含有关键顺式作用信号的任何相当的基因组序列(collins和karron,fields virology,第6版(2013),第1086页-第1123页)。作为缺失候选的基因组区包括但不限于其它基因、基因间区和尾随区中的非翻译区。
[0098]
在某些实施方案中，cpd rsv的基因组或反基因组的一个或多个基因被例如牛或其它rsv对应物替代，或者被来自另一种呼吸病原体，如piv的对应物或外源基因替代。在该上下文中的rsv基因或基因区段的取代、缺失和其它修饰可包括ns1、ns2、n、p、m、sh和l基因中的一个或多个，或m2-1 orf，或g和f基因的非免疫原性部分的一部分或全部。而且，人rsv顺式作用序列，如启动子或转录信号，可以被例如它们的牛rsv对应物替代。在其它实施方案中，rsv变体包含插入到牛rsv基因组或反基因组背景中的人减毒基因或顺式作用序列。
[0099]
因此，由旨在用于施用至人的本发明的多肽编码的rsv变体可以是人rsv，其已经被修饰以含有来自例如牛rsv或piv的基因，如用于减毒的目的。例如，通过插入来自piv的基因或基因区段，提供了针对piv和rsv的二价疫苗。可选地，可以修饰异源rsv物种、亚组或毒株，或者不同的呼吸道病原体如piv，以例如含有编码引发针对人rsv感染的保护的表位或蛋白的基因。例如，可以用人rsv糖蛋白基因取代牛糖蛋白基因，使得现在携带人rsv表面糖蛋白并且由于剩余的牛遗传背景而保留在人宿主中有限复制能力的所得牛rsv在人中引发针对人rsv毒株的保护性免疫应答。
[0100]
在某些实施方案中，来自一种rsv毒株的选择的基因区段，如编码选择的蛋白或蛋白区域(例如，胞质尾区、跨膜结构域或胞外域、表位、结合位点或区域，或含有活性位点的活性位点或区域)的基因区段，可以替代来自相同或不同rsv毒株或其它来源的对应基因区段，以产生与亲本和/或野生型rsv毒株相比具有所需表型变化的新重组体。此类所得毒株可以例如表达具有融合到另一种rsv的胞外域的一种rsv的胞质尾区和/或跨膜结构域的嵌合蛋白。这种类型的其它示例性实施方案表达重复的蛋白质区域，如重复的免疫原性区域。
[0101]
如本文所用，“对应”基因、基因区段、蛋白质或蛋白质区域通常来自异源来源(例如，来自不同rsv基因，或代表不同rsv毒株中的相同(即，同源或等位)基因或基因区段)。通常，在本上下文中选择的对应物共有总体结构特征，例如每个对应物可以编码相当的结构“结构域”，如胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域、结合位点或区域、或表位。对应结构域及其编码基因区段包括具有一系列大小和氨基酸(或核苷酸)序列变化的种类的集合，所述范围由结构域或基因区段变体中的共同生物活性限定。
[0102]
例如，在实施方案中，由对应的基因区段编码的两个选择的蛋白结构域可共有基本上相同的定性活性，如提供跨膜功能、特异性结合活性或免疫学识别位点。更典型地，在对应物之间，例如在选择的蛋白质区段或蛋白质之间共有的特定生物活性将在定量方面是基本上相似的，即，它们在各自的定量活性分布中变化不超过30％，优选不超过20％，更优选不超过5-10％。
[0103]
在一些实施方案中，由cdna表达的基因组或反基因组产生的rsv变体可以是任何rsv或rsv样毒株，如人、牛或鼠，或者任何肺炎病毒或偏肺病毒，如小鼠的肺炎病毒或禽偏肺病毒。为了引发保护性免疫应答，rsv变体可以是对被免疫的对象是内源性的变体，如人rsv被用于免疫人。然而，内源性rsv的基因组或反基因组可以被修饰以表达来自不同来源的组合的rsv基因或基因区段，如来自不同rsv物种、亚组或毒株，或者来自rsv和另一种呼吸病原体如人副流感病毒(piv)的基因或基因区段的组合(参见，例如，hoffman等人,j.virol.,71:4272-4277(1997)；durbin等人,virology,235(2):323-32(1997)；美国专利7,208,161；wo 1998/053078；以及用于产生感染性piv克隆的以下质粒：p3/7(131)(atcc 97990)；p3/7(131)2g(atcc 97889)；和p218(131)(atcc 97991)；每种根据布达佩斯条约与美国类型培养物保藏中心(atcc)(10801university blvd.,manassas,va.20110-2209,u.s.a.)于1997年4月18日保藏，并且被给予上述登录号。具有减毒表型的rsv变体
[0104]
本发明提供了具有减毒表型的rsv变体，其由本文所述的本发明的多核苷酸编码。
[0105]
本发明的rsv变体可以是病毒颗粒或亚病毒颗粒。它可以存在于细胞培养上清液中，从培养物中分离，或者部分或完全纯化。rsv变体也可以是冻干的，并且可以根据需要与多种其它组分组合用于储存或递送至宿主。
[0106]
本发明的rsv变体可用于多种组合物中以在易于受rsv感染的宿主中产生针对rsv的所需免疫应答。本发明的rsv变体能够在感染的人宿主中引发保护性免疫应答，但被充分减毒，从而不会在免疫的宿主中引起严重呼吸疾病的不可接受的症状。在一些实施方案中，活的减毒rsv疫苗包含本发明的rsv变体。
[0107]
为了从本文提供的rsv变体的宿主中选择候选疫苗病毒，根据熟知的方法确定活力、体外有效复制、体内减毒、免疫原性和表型稳定性的标准。关于rsv疫苗和药物组合物的
产生，最理想的rsv病毒应该保持活力，在允许的条件下在体外充分复制以使疫苗制造成为可能，具有稳定的减毒表型，是良好耐受的，在免疫的宿主中表现出复制(尽管水平较低)以及在疫苗中有效引发免疫应答的产生，该免疫应答足以赋予针对由来自野生型病毒的随后感染引起的严重疾病的保护。鉴于尚未批准rsv疫苗，看起来先前报道的减毒rsv疫苗候选物不足以满足所有这些标准。另一方面，本发明的rsv变体通过在体内、在野生型rsv引发的水平处或附近表现出强的免疫原性，同时仍然表现出稳定的减毒复制而满足这些标准。
[0108]
本文所述的rsv变体可以在各种熟知的和普遍接受的体外和体内模型中测试，以证实用于疫苗用途的足够的减毒、对表型逆转的抗性和免疫原性。可以是多重减毒的、生物学衍生的或重组rsv的rsv变体在体外测定中测试病毒复制或“ts表型”的温度敏感性和小噬菌斑表型。可以在rsv感染的动物模型中进一步测试rsv变体。已经描述了多种动物模型(例如，鼠科动物、仓鼠、棉鼠和灵长类动物)，并且这些动物模型是本领域技术人员已知的。
[0109]
在实施方案中，rsv变体可用作其它病原体，特别是呼吸道病原体，如副流感病毒(nv)的保护性抗原的“载体”。例如，可以制备具有t1166i突变的重组rsv，其掺入编码来自piv的保护性抗原的序列以产生感染性减毒的疫苗病毒。
[0110]
具有减毒表型的rsv变体的产生
[0111]
本发明提供了用于产生如本文所述的本发明的多核苷酸或本发明的rsv变体的方法。
[0112]
本发明的多核苷酸或本发明的rsv变体可以通过任何合适的生产技术制备，其中许多是本领域已知的。例如，可以将本发明的多核苷酸插入到合适的载体中，该载体用于转化合适的宿主细胞，例如允许rsv感染的宿主细胞，其在合适的培养物中复制，然后表达以产生本发明的rsv变体。因此，本发明包括包含本发明的多核苷酸或本发明的rsv变体的载体，以及例如通过使用本发明的载体转染有或转化有本发明的多核苷酸或本发明的rsv变体的宿主细胞。
[0113]
本发明的rsv变体可以由一种或多种分离的多核苷酸，例如一种或多种cdna产生。在一个实施方案中，构建编码rsv变体基因组或反基因组的cdna用于细胞内表达。在另一个实施方案中，编码rsv变体基因组或反基因组的全部或一部分的cdna在体外与必需的病毒蛋白共表达以形成rsv变体。“rsv反基因组”是指作为合成子代rsv基因组的模板的分离的正义多核苷酸分子。优选构建以下cdna，其是正义形式的rsv基因组(对应于复制中间体rna)或反基因组，以便最小化与互补序列的正义转录物杂交的可能性，所述互补序列编码产生转录、复制核衣壳所必需的蛋白，即，编码n、p、l和m2-1蛋白的序列。
[0114]
在某些实施方案中，本发明提供了用于产生一种或多种纯化的rsv蛋白的方法，所述方法包括在允许rsv在感染的细胞中繁殖的条件下，用rsv变体感染允许rsv感染的宿主细胞。在培养物中复制一段时间后，将细胞裂解，并从中分离rsv。在其它实施方案中，在分离病毒之后纯化一种或多种所需的rsv蛋白，产生用于疫苗、诊断和其它用途的一种或多种rsv蛋白。
[0115]
为了繁殖用于疫苗用途和其它目的的rsv变体病毒，可以使用允许rsv生长的许多不同的细胞系。rsv在多种人和动物细胞中生长。用于疫苗用途的繁殖减毒rs病毒的优选细胞系包括dbsfrhl-2、mrc-5和vero细胞。最高的病毒产量通常由上皮细胞系如vero细胞实现。通常用感染复数为约0.001至1.0或更大的范围的病毒接种细胞，并且在允许病毒复制
的条件下培养，例如在约30-37℃下培养约3-10天，或者在病毒达到适当滴度所需的时间内培养。温度敏感的病毒通常使用32℃作为“许可温度”生长。从细胞培养物中除去病毒，通常通过熟知的纯化程序，如离心，从细胞组分中分离病毒，并可根据需要使用本领域技术人员熟知的程序进一步纯化病毒。
[0116]
本文所述的用于产生减毒重组rsv突变体的方法可用于产生感染性病毒或亚病毒颗粒，或其衍生物。感染性病毒与野生型rsv病毒颗粒相当，并且“照原样”感染。感染性病毒可直接感染新鲜细胞。感染性亚病毒颗粒通常是病毒颗粒的亚组分，其可以在适当的条件下引起感染。例如，含有基因组或反基因组rna和n、p、l和m2-1蛋白的核衣壳是亚病毒颗粒的一个实例，如果被引入细胞的细胞质中，它可以引起感染。由本发明的实施方案提供的亚病毒颗粒包括缺少一种或多种蛋白质、蛋白质区段或感染性非必需的其它病毒组分的病毒颗粒。
[0117]
其它实施方案提供了细胞或无细胞裂解物，其含有包含本发明的多核苷酸的表达载体以及包含编码rsv的n、p、l和m2-2蛋白的一种或多种分离的多核苷酸分子的表达载体(相同或不同的载体)。在进一步的实施方案中，这些蛋白质中的一种或多种由基因组或反基因组cdna表达。在表达时，基因组或反基因组以及n、p、l和m2-2蛋白组合产生感染性rsv病毒或亚病毒颗粒。药物组合物
[0118]
本发明提供了包含本发明的rsv变体和至少一种赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物理想地包含免疫有效量的本发明的rsv变体。在一些实施方案中，活的减毒rsv疫苗包含本发明的药物组合物。
[0119]
本发明的药物组合物可以以任何合适的方式制备，其中许多是本领域已知的。赋形剂可以是任何合适的赋形剂，如载体。合适的载体包括，例如，缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且还可以配制成促进缓释。稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等渗性的添加剂包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。其它合适的疫苗媒介物和添加剂，包括在配制修饰的活疫苗中特别有用的那些，是已知的或对本领域技术人员是显而易见的。参见，例如，remington's pharmaceutical science,第18版,mack publishing(1990)，将其通过引用并入本文。
[0120]
本发明的药物组合物可以包含一种或多种另外的免疫调节组分，诸如例如佐剂或细胞因子等。可以用于组合物中的佐剂包括但不限于ribi佐剂体系(ribi inc.,hamilton,mont.)，明矾，矿物凝胶如氢氧化铝凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂诸如例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，嵌段共聚物(cytrx,atlanta ga.)，qs-21(cambridge biotech inc.,cambridge mass.)，saf-m(chiron,emeryville calif.),amphigen
tm
佐剂，皂苷，quil a或其它皂苷级分、单磷酰脂质a、离子多糖和阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗的水包油乳剂的非限制性实例包括改性的seam62和seam1/2制剂。改性的seam62是水包油乳剂，其含有5％(v/v)角鲨烯(sigma)、1％(v/v)span
tm
85洗涤剂(ici surfactants)、0.7％(v/v)吐温
tm
80洗涤剂(ici surfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml quil a、100μg/ml胆固醇和0.5％(v/v)卵磷脂。改性的seam 1/2是水包油乳剂，其包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)span
tm
85洗涤剂、0.7％(v/v)吐温80洗涤剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml quil a和50μg/ml胆固醇。可以包括在组合物中的其它免疫调节剂包括，例如，一种或多种白细胞介
素、干扰素或其它已知的细胞因子。另外的佐剂体系允许t辅助表位和b细胞表位的组合，导致产生一种或多种类型的共价t-b表位连接的结构，其可以被另外地脂化，如在wo 2006/084319、wo 2004/014957和wo 2004/014956中描述的那些。
[0121]
本发明的药物组合物含有免疫原性有效量的本文所述的rsv变体作为活性成分。生物学衍生的或重组的rsv毒株可以作为直接用于疫苗制剂或组合物中的疫苗直接施用至宿主。生物学衍生的或重组修饰的病毒可以与生理学上可接受的载体和/或佐剂一起引入宿主中。有用的载体是本领域熟知的，并且包括例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。可以将所得水溶液包装以“原样”使用，以冷冻形式提供，其在使用前解冻，或者冻干，其中冻干制剂在施用前与无菌溶液组合。所述组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，其包括但不限于ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、蔗糖、硫酸镁、磷酸盐缓冲液、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液、脱水山梨糖醇单月桂酸酯和油酸三乙醇胺。可接受的佐剂包括弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，它们是本领域熟知的物质。优选的佐剂还包括stimulon
tm
qs-21(aquila biopharmaceuticals,inc.,worchester,mass.)、mpl
tm
(3-o-脱酰基单磷酰脂质a；rim immunochem research,inc.,hamilton,mont.)和白细胞介素-12(genetics institute,cambridge,mass)。多价rsv疫苗组合物
[0122]
本发明提供了多价rsv疫苗组合物，其包含本发明的第一rsv变体、本发明的第二rsv变体和任选的一种或多种本发明的另外rsv变体，其中第一、第二和任选的另外rsv变体具有不同的核苷酸序列。
[0123]
本发明的多价rsv疫苗组合物可包含一种或多种赋形剂或者如本文所述的用于本发明药物组合物的其它组分。
[0124]
在一些实施方案中，疫苗或药物组合物包含rsv变体，其引发针对单一rsv毒株或抗原亚组(例如a或b)或者针对多种rsv毒株或亚组的免疫应答。在这方面，rsv变体可以与具有不同免疫原性特征的其它rsv疫苗毒株或亚组组合在疫苗制剂中，以更有效地防护一种或多种rsv毒株或亚组。它们可以在疫苗混合物中施用，或者在协同治疗方案中分别施用，以引发针对一种rsv毒株或者针对多种rsv毒株或亚组的更有效的保护。疫苗接种方法
[0125]
本发明提供了给动物接种疫苗的方法。疫苗接种方法包括向动物施用本发明的rsv变体，优选以本发明的药物组合物的形式。进一步提供了诱导免疫应答的方法，其包括施用疫苗或药物组合物。
[0126]
在某些实施方案中，施用活的减毒rsv变体疫苗(或rsv变体药物组合物)，其中所述疫苗或药物组合物包含本文所述的本发明的多核苷酸编码的rsv变体。
[0127]
疫苗和药物组合物可以通过任何合适的方法施用，包括但不限于经由注射、鼻用喷雾、滴鼻剂、局部应用、气雾剂递送或口服接种。在一些实施方案中，所述组合物可经鼻内或皮下或肌内施用。在一些实施方案中，所述组合物可以施用至上呼吸道。所述组合物可以施用至针对rsv的抗体呈血清阴性或具有针对rsv的经胎盘获得的母体抗体的个体。
[0128]
疫苗或药物组合物所施用的动物可以是易受rsv或密切相关病毒感染，并且能够对疫苗毒株的抗原产生保护性免疫应答的任何哺乳动物。因此，合适的动物包括人，非人灵
长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、兔类动物、啮齿动物如小鼠或棉鼠等。因此，本发明提供了产生用于多种人和兽医用途的疫苗的方法。
[0129]
在人的情况下，rsv变体可以根据充分确立的人rsv疫苗方案施用(karron等人,jid,191:1093-104(2005))。简而言之，用通常在0.5ml生理上可接受的稀释剂或载体的体积中的免疫原性有效剂量的rsv疫苗经由液滴鼻内接种成人或儿童。与用非复制疫苗进行肠胃外免疫相比，这具有简单和安全的优点。它还提供了局部呼吸道免疫的直接刺激，这在对rsv的抗性中起主要作用。此外，这种疫苗接种模式有效地绕过了rsv特异性母体来源的血清抗体的免疫抑制作用，其通常在非常年轻的人中发现。而且，虽然rsv抗原的肠胃外施用有时可能与免疫病理并发症相关，但这在使用活病毒的情况下从未观察到。
[0130]
对于人，所施用的rsv变体疫苗的精确量以及施用的时间和重复将由多种因素确定，包括患者的健康状态和体重、施用模式和制剂的性质。剂量范围通常为约3.0log10至约6.0log10噬菌斑形成单位(“pfu”)或更多病毒/患者，更通常为约4.0log10至5.0log10 pfu病毒/患者。在一个实施方案中，在婴幼儿期，如1-6个月龄期间，可以向每名患者施用约5.0log10-6.0log10 pfu，并且可以在2-6个月或更长时间后给予一个或多个另外的加强剂量。在另一个实施方案中，在约2、4和6个月龄时，可以给予婴幼儿约5.0log10-6.0log10 pfu/患者的剂量，这是许多其它儿童期疫苗的推荐施用时间。在另一个实施方案中，可以在约10-15个月龄时施用另外的加强剂量。疫苗制剂和药物组合物应提供足以有效刺激或诱导抗rsv免疫应答的本发明rsv变体的量(“免疫原性有效量”)。
[0131]
在一些实施方案中，给予新生儿和婴幼儿多剂量的rsv疫苗以引发足够水平的免疫。施用可以在生命的第一个月内开始，并且根据需要在整个儿童期间隔，如在两个月、四个月、六个月、一年和两年施用，以维持足够水平的针对天然rsv感染的保护。在其它实施方案中，对特别易于反复或严重rsv感染的成人，诸如例如健康护理工作者、日常护理工作者、少年儿童的家庭成员、老年人、心肺功能受损的个体给予多剂量的rsv疫苗以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导的免疫水平可以通过测量中和分泌抗体和血清抗体的量来监测，并且根据需要调整剂量或重复疫苗接种以维持所需的保护水平。此外，可指示不同的疫苗病毒以施用至不同的接受者组。例如，表达细胞因子或富含t细胞表位的另外蛋白的工程化rsv毒株可能对成人非婴幼儿特别有利。根据本发明生产的疫苗可以与rsv的其它亚组或毒株的病毒组合以实现针对多个rsv亚组或毒株的保护，或者编码例如这些毒株的保护性表位的选择的基因区段可以工程化到一个rsv变体克隆中，如本文所述。在此类实施方案中，不同的病毒可以混合并且同时施用，或者存在于单独的制剂中并且单独施用。例如，由于两个rsv亚组的f糖蛋白在氨基酸序列上仅相差约11％，这种相似性是在用rsv或f抗原免疫并用异源毒株激发的动物中观察到的交叉保护性免疫应答的基础。因此，用一种毒株免疫可以防护相同或不同亚组的不同毒株。
[0132]
在用rsv疫苗组合物免疫后，宿主通过产生对rsv病毒蛋白，例如f和g糖蛋白具有特异性的抗体来应答疫苗。此外，诱导先天性免疫应答和细胞介导的免疫应答，这可以提供抗病毒效应物以及调节免疫应答。作为疫苗接种的结果，宿主变得至少部分或完全免疫rsv感染，或者对发展中度或重度rsv疾病(特别是下呼吸道)有抗性。
[0133]
可以通过多种方法来表征所产生的免疫应答。这些包括采集鼻洗液或血清的样品用于分析rsv特异性抗体，其可以通过测试来检测，所述测试包括但不限于补体固定、噬菌
斑中和、酶联免疫吸附测定、荧光素酶免疫沉淀测定和流式细胞术。此外，可以通过鼻洗液或血清中的细胞因子的测定、来自任一来源的免疫细胞的elispot、鼻洗液或血清样品的定量rt-pcr或微阵列分析和通过在体外重新暴露于病毒抗原来对来自鼻洗液或血清的免疫细胞进行再刺激，以及通过流式细胞术测量的细胞因子、表面标志物或其它免疫相关性的产生或展示的分析或者针对展示rsv抗原的指示靶细胞的细胞毒性活性的分析来检测免疫应答。在这方面，还监测个体的上呼吸道疾病的体征和症状。诱导免疫应答的方法
[0134]
本发明提供了在动物中诱导免疫应答的方法。所述方法包括向动物施用本发明的rsv变体。本发明的rsv变体可以以与本文所述的本发明疫苗接种方法相同的形式和/或相同的方式施用。
[0135]
本文提供了用于刺激个体的免疫系统以在哺乳动物对象中引发针对rsv的免疫应答的方法。所述方法包括施用在生理学上可接受的载体和/或佐剂中的免疫学上足够量或有效量的rsv变体的免疫原性制剂。
[0136]
本发明的rsv变体可用于多种组合物中以在易于受rsv感染的宿主中产生针对rsv的所需免疫应答。本发明的减毒变体rsv毒株能够在感染的人宿主中引发保护性免疫应答，但被充分减毒，从而不会在免疫的宿主中引起严重呼吸疾病的不可接受的症状。减毒病毒或亚病毒颗粒可以存在于细胞培养上清液中，从培养物中分离，或者部分或完全纯化。该病毒也可以被冻干，并且可以根据需要与多种其它组分组合用于储存或递送至宿主。产生rsv疫苗的方法
[0137]
本发明提供了产生rsv疫苗的方法。所述方法包括在细胞中表达本文所述的本发明的多核苷酸。所述方法的方面，例如细胞的性质，与本文所述的用于产生本发明rsv变体的相同。
[0138]
如本文所用，术语“接受者”、“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”可互换使用，并且是指需要疫苗接种的任何哺乳动物对象(例如人)。用于治疗目的的“哺乳动物”和“动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人，家畜和农场动物，以及动物园动物，运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛、绵羊、山羊、猪、骆驼等。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人。本公开内容的非限制性方面的实例
[0139]
本文所述的本发明的方面(包括实施方案)可以单独或者与一个或多个其它方面或实施方案组合是有益的。在不限制前述描述的情况下，以下提供编号为(1)-(84)的本公开内容的某些非限制性方面。如本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见的，每个单独编号的方面可以与前面或之后单独编号的方面中的任一个一起使用或组合。这旨在为所有这些方面的组合提供支持，并且不限于以下明确提供的方面的组合：
[0140]
(1)编码具有减毒表型的重组呼吸道合胞病毒(rsv)变体的多核苷酸，其包含修饰的rsv基因组或反基因组，所述修饰的rsv基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本rsv蛋白p的突变rsv蛋白p。
[0141]
(2)如方面1所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在选自19-34、107、229、234和235的一个或多个位置处不同于seq id no：6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0142]
(3)如方面1-2中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第25位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0143]
(4)如方面3所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸或天冬酰胺。
[0144]
(5)如方面1-4中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第27位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0145]
(6)如方面5所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第27位的残基是谷氨酸或天冬酰胺。
[0146]
(7)如方面1-6中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第28位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0147]
(8)如方面7所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或丝氨酸。
[0148]
(9)如方面1-8中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第32位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0149]
(10)如方面9所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸。
[0150]
(11)如方面1-10中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第34位不同于seq id no:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0151]
(12)如方面11所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸。
[0152]
(13)如方面1-12中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述修饰的rsv基因组或反基因组的一个或多个orf是密码子对去优化的。
[0153]
(14)如方面1-13中任一项所述的多核苷酸，其中编码一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约95％的同一性。
[0154]
(15)如方面14所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白ns1的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0155]
(16)如方面15所述的多核苷酸，其中编码rsv ns1蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约87％的同一性。
[0156]
(17)如方面16所述的多核苷酸，其中编码rsv ns1蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸99至518表示。
[0157]
(18)如方面14-17中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白ns2的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0158]
(19)如方面18所述的多核苷酸，其中编码rsv ns2蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约88％的同一性。
[0159]
(20)如方面19所述的多核苷酸，其中编码rsv ns2蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸628至1002表示。
[0160]
(21)如方面14-20中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白n的所述修饰的rsv
基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约90％的同一性。
[0161]
(22)如方面21所述的多核苷酸，其中编码rsv n蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约80％的同一性。
[0162]
(23)如方面22所述的多核苷酸，其中编码rsv n蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸1141至2316表示。
[0163]
(24)如方面14-23中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白p的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0164]
(25)如方面24所述的多核苷酸，其中编码rsv p蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约84％的同一性。
[0165]
(26)如方面25所述的多核苷酸，其中编码rsv p蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸2347至3072表示。
[0166]
(27)如方面14-26中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白m的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0167]
(28)如方面27所述的多核苷酸，其中编码rsv m蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约83％的同一性。
[0168]
(29)如方面28所述的多核苷酸，其中编码rsv m蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸3262至4032表示。
[0169]
(30)如方面14-29中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白sh的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约85％至约95％的同一性。
[0170]
(31)如方面30所述的多核苷酸，其中编码rsv sh蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的所述亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约92％的同一性。
[0171]
(32)如方面31所述的多核苷酸，其中编码rsv sh蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸4304至4498表示。
[0172]
(33)如方面14-32中任一项所述的多核苷酸，其中由所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列与由亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列至少99％相同。
[0173]
(34)重组rsv变体，其包含方面1-33中任一项所述的分离的多核苷酸。
[0174]
(35)药物组合物，其包含方面34所述的重组rsv变体和至少一种赋形剂。
[0175]
(36)多价rsv疫苗组合物，其包含方面1-35中任一项所述的重组rsv变体，方面1-35中任一项所述的第二重组rsv变体和任选的一种或多种方面1-35中任一项所述的另外的
重组rsv变体，其中所述第一、第二和任选的另外的重组rsv变体具有不同的核苷酸序列。
[0176]
(37)接种动物的方法，其包括向动物施用方面35所述的药物组合物或方面36所述的多价rsv疫苗组合物。
[0177]
(38)在动物中诱导免疫应答的方法，其包括将方面34或35所述的重组rsv变体施用至动物。
[0178]
(39)如方面38所述的方法，其中所述重组rsv变体经由注射、鼻用喷雾、滴鼻剂、局部应用、气雾剂递送或口服接种施用。
[0179]
(40)如方面37-39中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
[0180]
(41)如方面37-39中任一项所述的方法，其中所述动物是人。
[0181]
(42)产生重组rsv变体疫苗的方法，其包括在细胞中表达方面1-33中任一项所述的多核苷酸。
[0182]
(43)编码具有减毒表型的重组呼吸道合胞病毒(rsv)变体的多核苷酸，其包含修饰的rsv基因组或反基因组，所述修饰的rsv基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于野生型rsv蛋白p的突变rsv蛋白p。
[0183]
(44)如方面43所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在选自19-34、107、229、234和235的一个或多个位置处不同于seq id no：6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0184]
(45)如方面43-44中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第25位不同于seq id no:6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0185]
(46)如方面45所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸或天冬酰胺。
[0186]
(47)如方面1-46中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第27位不同于seq id no:6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0187]
(48)如方面47所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列的第27位的残基是谷氨酸或天冬酰胺。
[0188]
(49)如方面1-48中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第28位不同于seq id no:6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0189]
(50)如方面49所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或丝氨酸。
[0190]
(51)如方面1-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p具有在至少第32位不同于seq id no:6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0191]
(52)如方面51所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸。
[0192]
(53)如方面1-52中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白具有在至少第34位不同于seq id no:6所示的野生型rsv蛋白p的氨基酸序列的氨基酸序列。
[0193]
(54)如方面53所述的多核苷酸，其中所述突变rsv蛋白p的氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸。
[0194]
(55)如方面1-54中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述修饰的rsv基因组或反基因组的一个或多个orf是密码子对去优化的。
[0195]
(56)如方面1-55中任一项所述的多核苷酸，其中编码一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约95％的同一性。
[0196]
(57)如方面56所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白ns1的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0197]
(58)如方面57所述的多核苷酸，其中编码rsv ns1蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns1的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约87％的同一性。
[0198]
(59)如方面58所述的多核苷酸，其中编码rsv ns1蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸99至518表示。
[0199]
(60)如方面14-59中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白ns2的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0200]
(61)如方面60所述的多核苷酸，其中编码rsv ns2蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白ns2的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约88％的同一性。
[0201]
(62)如方面61所述的多核苷酸，其中编码rsv ns2蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸628至1002表示。
[0202]
(63)如方面56-62中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白n的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约90％的同一性。
[0203]
(64)如方面63所述的多核苷酸，其中编码rsv n蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白n的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约80％的同一性。
[0204]
(65)如方面64所述的多核苷酸，其中编码rsv n蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸1141至2316表示。
[0205]
(66)如方面56-65中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白p的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的所述野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0206]
(67)如方面66所述的多核苷酸，其中编码rsv p蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白p的亲本rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约84％的同一性。
[0207]
(68)如方面67所述的多核苷酸，其中编码rsv p蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸2347至3072表示。
[0208]
(69)如方面56-68中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白m的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。
[0209]
(70)如方面69所述的多核苷酸，其中编码rsv m蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白m的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约83％的同一性。
[0210]
(71)如方面70所述的多核苷酸，其中编码rsv m蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸3262至4032表示。
[0211]
(72)如方面56-71中任一项所述的多核苷酸，其中编码rsv蛋白sh的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约85％至约95％的同一性。
[0212]
(73)如方面72所述的多核苷酸，其中编码rsv sh蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列与编码rsv蛋白sh的野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列具有约92％的同一性。
[0213]
(74)如方面73所述的多核苷酸，其中编码rsv sh蛋白的所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列由seq id no:2的核苷酸4304至4498表示。
[0214]
(75)如方面56-74中任一项所述的多核苷酸，其中由所述修饰的rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列与由野生型rsv基因组或反基因组的核苷酸序列编码的相同的一种或多种rsv蛋白ns1、ns2、n、p、m和sh的氨基酸序列至少99％相同。
[0215]
(76)重组rsv变体，其包含方面1-75中任一项所述的分离的多核苷酸。
[0216]
(77)药物组合物，其包含方面76所述的重组rsv变体和至少一种赋形剂。
[0217]
(78)多价rsv疫苗组合物，其包含方面1-77中任一项所述的重组rsv变体，方面1-77中任一项所述的第二重组rsv变体和任选的一种或多种方面1-77中任一项所述的另外的重组rsv变体，其中所述第一、第二和任选的另外的重组rsv变体具有不同的核苷酸序列。
[0218]
(79)接种动物的方法，其包括向动物施用方面77所述的药物组合物或方面78所述的多价rsv疫苗组合物。
[0219]
(80)在动物中诱导免疫应答的方法，其包括将方面76或77所述的重组rsv变体施用至动物。
[0220]
(81)如方面80所述的方法，其中所述重组rsv变体经由注射、鼻用喷雾、滴鼻剂、局部应用、气雾剂递送或口服接种施用。
[0221]
(82)如方面79-81中任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
[0222]
(83)如方面79-81中任一项所述的方法，其中所述动物是人。
[0223]
(84)产生重组rsv变体疫苗的方法，其包括在细胞中表达方面1-75中任一项所述的多核苷酸。
实施例
[0224]
实施例1：
[0225]
病毒：所有病毒衍生自名称为d46/6120的rsv骨架，其是野生型(wt)rsv毒株a2(genbank登录号kt992094)的一种形式。该骨架在sh基因的下游非翻译区含有112个核苷酸缺失和涉及sh orf的最后三个密码子和终止密码子的5个沉默核苷酸点突变，其在大肠杆菌中繁殖期间稳定rsv cdna，而不影响病毒在体外和小鼠中的复制(bukreyev等人,“granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expressed by recombinant respiratory syncytial virus attenuates viral replication and increases the level of pulmonary antigen-presenting cells,”j.virol.,75(24):12128-12140(2001))。先前已经描述了min a的设计和拯救(le nouen等人,“attenuation of human respiratory syncytial virus by genome-scale codon-pair deoptimization,”proc.natl.acad.sci.u.s.a.,111(36):13169-13174(2014))。简而言之，先前描述的计算算法(coleman等人,“virus attenuation by genome-scale changes in codon pair bias,”science,320(5884):1784-1787(2008))用于产生rsv ns1、ns2、n、p、m和sh orf序列，其包含在人orf中代表性不足的增加数目的密码子对(即密码子对去优化，cpd)。cpd过程导致分别在ns1、ns2、n、p、m和sh orf中引入65、60、241、143、163和23个沉默突变，在min a中总共引入695个沉默突变(le nouen等人,(2014)，同上)。min a的氨基酸序列与野生型rsv毒株a2相同。发现min a是温度敏感的，其中截止温度为40℃(图1)。如在该实施例中使用的，rsv基因组的序列编号基于重组rsv毒株a2(genbank登录号kt992094)，其中已经缺失了nt 4499-4610(包括端值)(即在rsv 6120中缺失)。
[0226]
在暴露于阶梯式温度应激之后min a毒株中突变的鉴定：用min a以0.1噬菌斑形成单位(pfu)/细胞的初始感染复数(moi)接种12个25cm2瓶的vero细胞。每个瓶产生其自己的单独谱系。使12个瓶中的10个经受温度应激，从32℃开始到40℃每隔一次传代将温度升高1℃，总共18次传代。将另外两个瓶在32℃的许可温度下平行传代18次作为对照。当观察到广泛的合胞体形成时，或者当细胞开始分离时(通常为第6天至第11天)，通过刮取培养基中感染的细胞，然后涡旋30秒，以及通过离心澄清上清液，从每个瓶中收获病毒。然后将等分试样在干冰中速冻并在-80℃储存。然后，20％收获的病毒(总共5ml中的1ml)用于接种下一个传代(图2)。在每次传代结束时，将病毒的等分试样在干冰中速冻，用于如所示的滴定以及通过sanger测序和/或深度测序进行测序(图3a-b和4a-b)。
[0227]
使用ion torrent全基因组深度测序鉴定传代中积累的突变：使用qiaamp viral rna提取试剂盒(qiagen)从最后一次传代(p18)结束时收集的澄清上清液中提取病毒rna，并使用superscript ii逆转录酶(rt,thermofisher)按照制造商的说明书进行逆转录。如前所述(le nouen等人,“genetic stability of genome-scale deoptimized rna virus vaccine candidates under selective pressure,”proc.natl.acad.sci.u.s.a.,114(3):e386-e95(2017))，使用rsv特异性引物和高保真dna聚合酶(pfx dna聚合酶，thermofisher)通过pcr扩增cdna，以及使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化pcr扩增子。然后，如前所述(le nouen等人(2017)，同上)进行ion torrent深度测序。对于每个基因组未直接确定的唯一序列是最外面的引物的位置，即核苷酸1-23和15,062-15,111。使用variantcaller 3.2软件(ion torrent)比较dna序列。将分析管线的参数设置在ion torrent默认体细胞变体配置。如前所述(le nouen等人.(2017),同上)，如果该变体出现》50次，平均读取深度为1000
×
，并且p值《10-7(质量评分》70)，则称之为核苷酸变体。还使用ivg基因组浏览器(the broad institute)手动验证原始读取数据。在表1中示出了以大于5％的频率检测到的鉴定的突变(也参见图5)。表1：在温度应激测试结束时在min a的9个谱系中的每一个中以及在2个对照的每一个中以≥5％的频率检测到的突变。
核苷酸编号基于rsv序列m74568。“/”表示氨基酸突变不适用于该特定突变，因为给定突变位于非翻译区。*具有所示突变的读取的百分比；仅显示≥5％的读取中存在的突变。涉及已经作为ns1、ns2、n、p、m或sh的cpd的一部分改变的密码子的突变。涉及作为ns1、ns2、n、p、m或sh的cpd的一部分改变的核苷酸的突变。
§
涉及已经作为ns1、ns2、n、p、m或sh的cpd的一部分改变的核苷酸和恢复wt序列的突变。
[0228]
将突变引入min a cdna骨架：使用quikchange lightning定点诱变试剂盒(agilent technologies)按照制造商的说明将在体外传代期间鉴定的rsv p蛋白中的某些突变重新引入到min a cdna骨架中。使用一组特异性引物通过sanger测序对每种新产生的
min a衍生的cdna进行完全测序。
[0229]
通过反向遗传学拯救重组rsv：使用lipofectamine2000(thermofisher)将编码min a、min a衍生的病毒或野生型rsv全长基因组的5μg cdna，2μg编码n和p的cdna以及1μg编码m2和l的cdna共转染到在补充有3％ fbs和2％ gmem氨基酸的gmem培养基中培养的bsr-t7细胞的p6孔中。在37℃下孵育过夜后，将转染的bsr-t7细胞轻轻刮入培养基中并转移到在补充有5％fbs和1％ l-谷氨酰胺的optimem中培养的50％汇合的75cm2瓶中的vero细胞。在11天至14天收获病毒，此时通过刮取培养基中的感染细胞，然后涡旋30秒，以及通过离心澄清上清液来观察到广泛的合胞体形成。将第1代(p1)病毒储备液的等分试样在干冰中速冻并在-80℃储存。在32℃下通过噬菌斑测定来测定病毒滴度。然后，在vero细胞上扩增p1病毒储备液一次以产生p2病毒工作储备液。为此，用p1病毒储备液以每细胞0.05或0.01pfu的moi感染t225cm2瓶的vero细胞。如上所述收获病毒并进行滴定。通过重叠逆转录pcr扩增子的sanger和/或ion torrent深度测序来证实每种病毒储备液的完整序列。
[0230]
具有p蛋白突变的min a变体的测试：
[0231]
在第25个氨基酸至第34个氨基酸之间鉴定的某些p突变与min a的温度敏感性的丧失相关。研究了图1的应激测试实验期间min a的ts表型丧失的遗传基础。选择6个显著的p错义突变，其以≥45％的读取水平存在于两个谱系中，或者以≥90％的读取水平存在于单个谱系中(表1)。六个p错义突变是：k25t、k25n、k27n、f28v、k32t和p34s。通过定点诱变将这些分别重新引入min a反基因组cdna中并通过反向遗传学拯救，并通过sanger测序证实完整的基因组序列。
[0232]
将min a衍生的病毒的温度敏感性与min a和wt rsv进行比较(表2)。在该研究中，min a在40℃的滴度比在32℃的滴度低2.3log
10
，然而wt rsv在40℃的滴度比在32℃的滴度低0.4log
10
。因此，在相同温度下与wt rsv相比，min a滴度降低的差为1.9log
10
，这略小于正式定义温度敏感表型的≥2.0log
10
的差(参见表2的脚注)。尽管这稍微小于先前观察到的2.6log
10
的差(le nouen等人,pnas usa,111(36):13169-74(2014))，但足以评价突变的可能效果。我们发现，我们已经引入到min a中的大多数p错义突变显著提高了其在40℃形成噬菌斑的能力。特别地，含有突变p[k25t]、p[k27n]或p[k32t]的min a在40℃的滴度比在32℃的滴度仅低0.3-0.4log
10
，类似于wt rsv。相比之下，突变p[p34s]在补偿min a的温度敏感性方面的有效性最差，导致在40℃比在32℃的滴度低1.7log
10
。
[0233]
表2：vero细胞上cpd-rsv的温度敏感性。
a通过利用温度控制的水浴在指定温度下评估病毒在vero上的生长来评价每种病毒的ts表型。tsh被定义为与32℃相比噬菌斑数目减少的最低限制性温度，其为在两个温度下针对wt rsv所观察到的噬菌斑数目减少的100倍或更大。ts表型被定义为具有40℃或更低的tsh。
[0234]
错义p突变增加了体外min a的适合度。研究了单一p突变对min a的多周期复制的影响(图12a-h)。将vero细胞用以下物质以0.01pfu/细胞的moi一式两份地并行感染：min a；携带单一p突变的指示的min a衍生的病毒；谱系#2、#3、#4或#5的p16；或wt rsv。由于来自p18谱系的有限材料和在p16获得的高病毒滴度，p16谱系被包括在这组实验中。在p16中存在我们最初在p18谱系中鉴定的显著p突变通过sanger测序证实。在32℃的许可温度下(图2b，左栏)或在37℃的生理温度下(右栏)孵育细胞。
[0235]
在32℃下，wt rsv复制在感染后(pi)第7天达到107.1pfu/ml的峰值，如通常观察到的(图12a-d，左栏)。如所预期的，与wt rsv(在第7天105.9pfu/ml)相比，min a复制减少了约10倍，并且仅在第11天达到最大滴度(106.5pfu/ml)。所有min a衍生的突变体在32℃下比min a更有效地复制；在第25位、第27位、第28位和第32位aa处的p突变使min a复制增加多达10倍，达到106.8-107.2pfu/ml的峰滴度，与wt病毒相当。
[0236]
除了在32℃下观察到的pi第3-4天而不是在pi第7-8天达到了最大病毒滴度外，在37℃下获得了相当的结果。如通常观察到的，wt rsv的峰滴度为107.3pfu/ml。与wt rsv(105.5pfu/ml的峰滴度)相比，在37℃下的min a复制减少了约60倍，与先前的结果一致(le nouen等人,pnas usa,111(36):13169-74(2014))，并进一步证实了其ts表型。在第25位、第27位、第28位和第32位aa处的每个p突变的存在使min a的复制增加了约5至15倍，达到106.2-106.7pfu/ml的峰滴度。在32℃下对温度敏感性和复制影响最小的突变p[p34s]在37℃下仍将min a复制增加两倍。与min a相比，谱系#2、#4、#5和#3的p16的复制也增加，并达到106.9-107.1pfu/ml。因此，与min a相比，p突变使在32℃和37℃下的复制增加。
[0237]
我们还通过表征在32℃下vero细胞上的噬菌斑大小和各噬菌斑的rsv f表达水平来评价p突变对min a适合度的影响(图12e-h)。包括min a病毒和wt rsv作为对照，以及来自谱系#2、#4、#5和#3的p16上清液(图12e-h)。与min a相比，所有min a衍生的p突变体的噬菌斑大小显著增加，但仍介于min a与wt rsv之间。相比之下，p16病毒储备液的噬菌斑大小等于或略超过wt rsv的噬菌斑大小。关于rsv f表达的大小，除了[p34s]之外的所有p突变都增加了rsv f/个噬菌斑的表达，尽管没有达到p16储备液或wt rsv的水平。与min a相比，对于突变p[k25n]而言，增加是统计学上显著的。这些数据进一步证实了各个p突变提高了min a适合度。
[0238]
多周期生长动力学。如先前在le nouen等人(2017，同上)中所述进行多周期生长动力学(参见图6)。简而言之，用指示的病毒以0.01pfu/细胞的moi一式两份感染6孔板中两份汇合的vero细胞单层，并在32℃或37℃下孵育。每天通过将感染的细胞刮入培养基中，然后涡旋30秒，以及通过离心澄清上清液来收集病毒。将病毒接种物和澄清的上清液速冻并储存在-80℃，并且稍后通过如上所述的免疫斑块测定来测定病毒滴度。
[0239]
单周期生长动力学。如先前在le nouen等人(2017，同上)中所述进行单周期复制实验(参见图7)。简而言之，在37℃下用指示的病毒以3pfu/孔的moi感染6孔板中的vero细胞。感染后4-24小时，每4个小时，一个孔/个病毒用于收获病毒，并通过噬菌斑测定来测定
病毒滴度。
[0240]
遗传稳定性：min a-p[k27n]和min a-p[f28v]病毒的遗传稳定性在温度应激测试中评价，所述温度应激测试包括在39℃下4次传代和在40℃下4次传代，对应于2个月的连续培养(图15a)。每种病毒也在32℃的许可温度下平行传代作为对照(图15b)。在最后一次传代(p8)结束时进行3个不同的应激复制体和2个对照复制体的完整基因组的sanger测序。
[0241]
在min a-p[k27n]的情况下，三个应激复制体以及两个对照复制体在p8时均未发现显著的(≥45％的读取)突变。在一个应激谱系中发现l中的3个亚优势的(≥5％至《44％的读取)错义突变([n1473d]、[n1475d]和[i14771r])。因此，与min a相比，min a-p[k27n]表现出显著增加的遗传稳定性。
[0242]
在min a-p[f28v]的情况下，在三个应激复制体中的两个中以及在一个对照复制体中均未发现显著的突变。在其余的应激谱系中，在m2-1中检测到4个亚优势的错义突变([h14r]、[n40s]、[m50v]和[k52r])。其余的对照谱系在f的3’utr中含有一个显著突变，并且在应激谱系中注意到4个错义突变，除了在该对照的情况下，m2-1中的所有4个错义突变都是显著的。m2-1中的这四个错义突变是“t”至“c”的突变，表明它们通过细胞脱氨酶被引入到基因组rna上。
[0243]
因此，与min a相比，min a-p[k27n]和min a-p[f28v]都表现出显著提高的遗传稳定性。尽管min a-p[f28v]在一个谱系中仍然看起来表现出一些残留水平的不稳定性，但该模式与胞苷脱氨酶活性而不是聚合酶保真度一致；与亲本病毒min a不同，在温度应激测试中没有出现显著不稳定性的明显模式，表明这些p突变的引入导致稳定性的显著改善。
[0244]
某些p突变增加基因组rna合成：评价p突变[k25t]、[k27n]、[f28v]和[k32t]对min a rna合成的影响。这四个突变被选择为在37℃下对增加多循环min a复制具有显著影响。
[0245]
如前所述(le nouen等人,(2017))在6孔板中的复制单层vero细胞中进行单周期感染以平行分析细胞相关病毒rna、细胞相关病毒蛋白和子代病毒的产生。在37℃下用指示的病毒以3pfu/细胞的moi感染细胞。感染后2小时，用pbs洗涤细胞单层两次以除去接种物。感染后4-24h，每4h收获4孔/病毒。(i)对一个孔进行细胞相关rna处理以通过链特异性rt-qpcr进行分析，如下所述。(ii)收获来自第二个孔的细胞用于通过流式细胞术分析，如下所述。(iii)对另一个孔进行细胞裂解物处理以用于蛋白质印迹分析，如下所述。(iv)最后，将最后一个孔用于收获病毒并测定病毒滴度，如上所述。
[0246]
收获来自单周期感染(moi为3pfu/孔，37℃，如上所述)的感染的vero细胞，并使用rneasy微型试剂盒(qiagen)收集细胞相关rna。对rna进行链特异性rt-qpcr以定量病毒负义(基因组)和正义(mrna和反基因组)rna，如前所述(le nouen等人,p.n.a.s.,111(36):13169-74(2014))。使用rneasy微型试剂盒(qiagen)提取病毒rna，并且使用superscript iii第一链合成系统(thermofisher)逆转录5μg dna酶处理的rna，所述系统具有对基因组或反基因组/mrna具有特异性并且连接到寡核苷酸标签的第一链引物(le nouen等人,2017)。然后，用含有寡核苷酸标签的引物、基因特异性反向引物和探针以一式三份扩增每个cdna。提供了链特异性，因为会扩增仅含有标记的rt引物序列的cdna。使用比较阈值循环(δct)方法分析qpcr结果，将其归一化为18s rrna内部对照，其已经使用随机第一链引物和标准18s rrna taqman测定(thermofisher)进行了rt-qpcr。除了表示为相对于wt 4小时时间点的倍数增加的wt rsv感染的细胞中的wt ns1、ns2、n、p、m和sh基因的定量以外，数据
80(2016))。然后，使用单色标记的细胞或珠粒对每种抗体自动进行补偿。活/死染色、前向散射高度和前向散射面积用于鉴定单个活细胞。最后，使用downsample插件(flowjo10.7)将所有样品的细胞数目归一化为19,000，并在单个活细胞上分析病毒蛋白n、p和f的表达。
[0252]
关于蛋白质印迹分析，在nupage lds样品缓冲液(thermofisher)中收获来自单周期感染(3pfu/孔的moi，37℃，如上所述)的感染的vero细胞，然后使用qiashredder离心柱(qiagen)均质化。将细胞裂解物在90℃下在1x nupage lds样品缓冲液(invitrogen)和1x nupage样品还原剂(invitrogen)中变性10分钟，并在具有nupage mes sds运行缓冲液(life technologies)的nupage 4-12％ bis-tris protein gels(thermofisher)上与odyssey蛋白质分子量标志物(li-cor)平行进行电泳。使用iblot 2凝胶转移装置(thermofisher)将蛋白质转移到pvdf膜上。使用odyssey封闭缓冲液封闭膜1小时，然后在含有0.1％吐温20(sigma-aldrich)的pbs中的odyssey封闭缓冲液中与一抗温育过夜。一抗是针对rsv n、p、m2-1和g蛋白(1:1,000,abcam)的小鼠mab以及针对gapdh(1:200,santa cruz)的兔多克隆抗体制剂作为上样对照。使用的二抗是山羊抗兔igg irdye 680和山羊抗小鼠igg irdye 800(1:15000,li-cor)。使用odyssey软件，3.0版(li-cor)扫描膜。rsv蛋白的荧光信号通过image studio lite软件(licor)自动进行背景校正并测量以定量每个蛋白条带的强度。数值表示每个蛋白条带的荧光强度(fi)。
[0253]
流式细胞术分析显示，对于所有突变和对照病毒，n、p或f蛋白呈阳性的细胞的百分比从8hpi稳定增加到24hpi(图14a)。然而，min a感染似乎以较慢的速率进展：在20-24hpi，n-、p-或f-阳性细胞的百分比比用wt rsv感染的培养物低约2倍。相比之下，具有p突变的min a衍生病毒的阳性细胞百分比与wt rsv相似。
[0254]
此外，研究了n、p和f蛋白在共表达所有三种蛋白的细胞中的表达水平(以mfi表示)(图14d)。与min a相比，含有各个p突变的min a衍生物中cpd n和p orf以及非cpd f orf的蛋白质表达水平增加了约2倍。然而，具有p突变的min a衍生病毒的n和p蛋白的表达仍然比wt rsv低约2-3倍，而f蛋白的表达水平恢复到wt rsv的表达水平。因此，各个p突变通过min a突变体将mrna转录恢复到与wt rsv相似的水平(如图13所示)，这也将非cpd f蛋白的表达水平恢复到wt rsv的表达水平。相比之下，与wt rsv相比，来自cpd orf的n和p蛋白的表达仍然降低。这将与cpd降低翻译效率的范例一致。
[0255]
从4-24hpi以4h间隔收获来自单周期感染实验的另外重复培养物(3pfu/细胞的moi，37℃)，并用对g、f、n、p和m2-1蛋白具有特异性的抗体通过蛋白质印迹进行分析。24h时间点的代表性蛋白质印迹显示在图14c中。此外，进行单周期感染实验的两次另外的重复，其中在24hpi收获感染的细胞并进行相同的蛋白质印迹分析。这些数据与来自图14c的那些数据一起定量并且显示在图14d中，表示为在24hpi时相对于min a的倍数增加。这些结果证实了将每个p突变引入min a增加了g、f、n、p和m2-1蛋白的表达。具体地，与min a相比，n、g和f的表达增加了3-5倍，以及p和m2-1的表达增加了1.3-1.5倍。然而，除了m2-1外，含有各个p突变的min a衍生病毒的病毒蛋白表达水平与wt rsv相比仍然较低。当通过蛋白质印迹法测量时(图14d)，来自非cpd orf的g和f的表达没有恢复到wt水平，然而当通过流式细胞术测量时(图14b)，f的表达恢复，这一发现可能是因为后一种方法仅测量感染的细胞，会是更直接和相关的测量；蛋白质印迹法测量所有细胞，并且与wt相比，min a衍生病毒的感染效率稍微降低(图14a)可能导致较低的信号。
[0256]
还评价了来自本文所述的相同单周期感染实验的病毒复制动力学。因此，从4-24hpi以4h间隔收获复制的感染vero细胞培养物(moi为3pfu/细胞，37℃)，制备澄清的细胞培养基上清液，并通过免疫斑块测定分析以定量感染性病毒滴度(图14e)。首先在约12hpi检测子代病毒。在24hpi时，如通常观察到的，wt rsv滴度达到107pfu/ml。与wt rsv相比，min a复制低约10倍，然而携带各个p突变的min a衍生物的复制比min a高约5倍，但比wt rsv低(图14e)。此外，进行单周期感染实验的两次另外的重复，其中在24收获感染的细胞，制备澄清的培养基上清液，通过免疫斑块测定进行分析，并将数据与来自图14e的数据组合以产生图14f。这证实了各个p突变将min a复制增加约5倍，但没有增加至wt rsv的水平。
[0257]
总之，单周期复制实验中的病毒mrna水平(图13)表明p突变将min a基因转录恢复到wt rsv水平。然而，在感染的vero细胞中检测到的总蛋白质表达(图14a-d)表明与wt mrna相比，cpd mrna的翻译仍然看起来减少，从而导致与wt rsv相比降低的蛋白质表达和降低的病毒复制。
[0258]
动物实验。所有动物研究由nih机构动物护理和使用委员会(iacuc)以动物研究方案号lid 34e批准。在6周龄的金黄叙利亚仓鼠(golden syrian hamster)的上呼吸道和下呼吸道中评价cpd病毒的复制。
[0259]
在第0天，在异氟烷麻醉下，用106pfu的wt rrsv、min a、min a-p[k25t]、min a-p[k27n]、min a-p[f28v]或min a-p[k32t]鼻内接种14只仓鼠的组。另外三只仓鼠保持未感染作为对照。在第3天，其对应于在仓鼠中wt rrsv的复制峰值(未显示)，通过吸入二氧化碳使来自每个接种组的7只仓鼠安乐死(参见图8)。收获鼻甲(nt)和肺，以及分别在含有2％ l-谷氨酰胺、1％两性霉素b、0.1％庆大霉素和0.06mg/ml磷酸克林霉素的leibovitz(l-15)培养基中均质化。通过在32℃下孵育的vero细胞上进行噬菌斑测定一式两份地测定病毒滴度。病毒检测的极限在nt和肺中均为50pfu/g(参见图9)。
[0260]
还测试了cpd病毒的免疫原性。在免疫前一天和免疫后第24天从每组七只仓鼠的血液中收集血清以测量rsv抗体应答。如前所述测定了60％噬菌斑减少中和抗体滴度(prnt
60
)(le nouen等人(2014)同上)(参见图10)。
[0261]
在免疫后第27天，经由鼻内施用106pfu的wt rrsv激发剩余的仓鼠(参见图11)。激发后3天，通过吸入二氧化碳使仓鼠安乐死。收获nt和肺组织，以及如上所述通过在32℃下孵育的vero细胞上进行噬菌斑测定一式两份地测定wt rrsv病毒滴度。与wt rrsv相比的统计学差异显示在每个图的上面，而min a与min a衍生的突变体之间的统计学差异显示在括号中(*p≤0.05，**p≤0.01和****p《0.0001)。
[0262]
实施例2
[0263]
某些另外突变体的产生和分析：根据实施例1中所述的方法，将在min a的连续传代期间(表1)与p[k27n](在谱系#4中)和p[f28v](在谱系#5中)共出现的几个另外显著的突变重新引入到min a-p[k27n]和min a-p[f28v]中。
[0264]
除了p[k27n]之外，谱系#4已经积累了4个其它显著的突变(表1)：一个在n基因的5’utr中，特别是在kozak序列(kozak,m,nucleic acids res.,15(20):8125-48(1987))中在翻译起始密码子之前的-3位处的1138g；第二个是l orf中的错义突变[v151a]；以及剩下的两个在orf中，但是沉默的，因此预测对于减毒和免疫原性是不重要的。将突变a1138g和l[v151a]引入到min a-p[k27n]骨架中以产生病毒min a-p[k27n]+2(图16a)。
[0265]
除了p[f28v]之外，谱系#5已经积累了5个其它显著的突变(表1)：两个在m([k123m])和l([s2084p])中是非同义的，以及3个是非编码的，出现在ns2 5’utr(t612c)中，p基因起始信号(c2334t,ggggcaaat)和p 3’utr(a3195g)中。注意，基因起始信号中的这种核苷酸取代对小基因组系统中的转录没有可检测的影响。通过反向遗传学以两种组合将五个突变引入到min a-p[f28v]骨架中：(i)除了p[f28v]突变之外在m([k123m])和l([s2084p])中的两个非同义突变，产生病毒min a-p[f28v]+2，以及(ii)除了p[f28v]突变之外的所有五个显著突变，产生min a-p[f28v]+5(图16a)。通过sanger测序证实了每种病毒的序列。
[0266]
多周期生长动力学：在32℃或37℃下孵育的vero细胞中的多周期复制实验中对这些病毒的评价显示了将这些另外的突变引入到min a-p[k27n]和min a-p[f28v]中并未进一步改善这些病毒的复制(图16b-c))。此外，除了min a-p[f28v]+5(与min a-p[f28v]相比，其表现出略有降低的复制和免疫原性)外，另外的错义突变的存在没有显著改变min a衍生的p突变体在仓鼠中的复制和免疫原性(图17)。
[0267]
遗传稳定性：min a-p[f28v]+2的遗传稳定性在温度应激测试中评价，所述温度应激测试包括在39℃下的四次传代和在40℃下的四次传代，对应于2个月的连续传代(图18a)。该病毒还在32℃的许可温度下平行传代作为对照(图18b)。在应激测试结束时，在5个谱系中仅发现3个亚优势的错义突变。因此，与min a和min a-p[f28v]相比，min a-p[f28v]+2表现出进一步增加的遗传稳定性。
[0268]
在本文中可以通过通常已知的三字母符号或iupac-iub生化命名委员会推荐的单字母符号来提及氨基酸。
[0269]
本文用于修饰数值的术语“约”和“大约”指示该数值附近的近范围。因此，如果“x”是数值，则“约x”或“大约x”表示从0.9x至1.1x，例如从0.95x至1.05x或从0.99x至1.01x的数值。提及“约x”或“大约x”特别地表示至少数值x、0.95x、0.96x、0.97x、0.98x、0.99x、1.01x、1.02x、1.03x、1.04x和1.05x。因此，“约x”和“大约x”旨在教导和提供对例如“0.98x”的权利要求限制的书面描述支持。
[0270]
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献均被单独且具体地指示为通过引入并入本文并在本文整体阐述。
[0271]
在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”和“至少一种”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖了单数和复数两种，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后是一项或多项的列表(例如，“a和b中的至少一种”)的使用应理解为意指选自所列项(a或b)的一项或所列项(a和b)的两种或多种的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
[0272]
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人有意以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。