促进FOXP3S的吗啉代物

背景技术：

1、乳腺癌是美国妇女中诊断出的第二种最常见的癌症。目前，美国妇女在其一生中的某个时期患乳腺癌的平均风险约为13％(每8名妇女中有1名)，因此，在2020年将有约276,480个新的浸润性乳腺癌病例被诊断出来。研究表明，不同种族和性别的军人的乳腺癌发病率明显较高，这可能是由于女军人与普通人在生殖史(初产年龄和使用避孕药)和暴露于有害化学品方面的差异。尽管由于治疗进步、通过筛查的早期发现和意识的提高，乳腺癌死亡率已经下降了几十年，但是在美国，每年仍有超过40,000名患者死于这种疾病。

2、调节性t细胞(treg)在维持免疫系统稳态方面发挥着核心作用，并对免疫介导的炎症诸如自身免疫性疾病、哮喘和变态反应进行负调节。然而，treg也抑制了针对慢性感染和肿瘤的有效免疫。一项对包括8666名乳腺癌患者的15项已发表研究的系统综述和荟萃分析(meta分析)表明，乳腺癌中增加的肿瘤浸润treg细胞与较差的临床结果相关，包括总生存率降低、肿瘤恶变和转移。相反，用抗cd25抗体(达利珠单抗)与实验性癌症疫苗联合使用，对具有转移性乳腺癌的患者的treg进行耗竭，导致treg明显和长时间的减少，并稳健地启动和增强cd8+和cd4+t细胞。因此，这一小部分患者的总生存率得到了改善。在小鼠乳腺癌模型中，treg的耗竭或下调导致了抗肿瘤免疫的增强和肿瘤的消退。

3、foxp3是treg发育和功能的主调节器。在人类和小鼠中的foxp3功能缺失突变都会导致致命的免疫失调、多内分泌病、肠病和x-连锁综合征(ipex)，原因是缺乏treg。人类foxp3基因通过mrna替代剪接编码两种主要的异构体--长的全长异构体(isoform)(foxp3l)和缺少外显子2区域的较短的异构体(foxp3s)，而小鼠foxp3基因只编码foxp3l异构体。尽管foxp3外显子2区域(第2编码蛋白外显子；seq id no:12)已被证明在调节th17分化方面很重要，但是两种foxp3异构体在强制过表达下都能体外有效指导treg分化和功能。然而，人们经常注意到，foxp3l和foxp3s异构体在cd4+t细胞中的异位过表达可能导致超生理的表达水平，并且不可能代表体内treg的功能。因此，这两种主要的异构体在决定treg的功能和生物学方面有何不同仍是个谜。

4、如本文所公开的，已经发现foxp3l和foxp3s异构体在cd4+t细胞中的相对表达影响对癌症进展的抵抗和癌症免疫疗法的疗效。

技术实现思路

1、人类foxp3基因通过mrna替代剪接编码两种主要的异构体--长的全长异构体(foxp3l)和缺少外显子2区域的较短的异构体(foxp3s)。然而，小鼠foxp3基因只编码foxp3l异构体。因此，虽然foxp3l能够指导treg的发育和功能，但是foxp3s的作用仍然难以确定。申请人已经发现，在treg中只表达foxp3s的遗传修饰小鼠模型赋予对乳腺癌进展的抵抗。此外，申请人发现表达foxp3s的treg是不稳定的，可以转分化为辅助样t细胞，从而提供增强的抗肿瘤免疫。此外，乳腺癌组织中foxp3s表达更高的患者比foxp3s表达更低的患者具有更好的总生存率。

2、因此，根据本公开的一种实施方式，提供了通过促进在treg中foxp3s的表达来增强抗肿瘤免疫，并且更具体地，增强针对乳腺癌的抗肿瘤免疫的方法。在一种实施方式中，该方法包括施用吗啡啉反义寡核苷酸(mo)，以阻断在pre-mrna剪接过程中外显子2区域的包含，以使foxp3表达转变为foxp3s异构体。申请人已经验证了这种新型mo在临床前小鼠乳腺癌模型和患者来源的离体乳腺癌模型和结直肠癌模型中有效地抑制了肿瘤生长。

3、根据一种实施方式，本发明涉及通过调整foxp3s相对于foxp3l的细胞内浓度来诱导调节性t细胞(treg)转分化为辅助样t细胞。更具体地，在一种实施方式中，相对于foxp3l，foxp3s的细胞内浓度在treg中增加，任选地导致foxp3s成为修饰的treg中存在的主要foxp3异构体。在一种实施方式中，提供了增强treg中foxp3s表达，并且更具体地，诱导treg从主要的foxp3l表达转换到主要的foxp3s表达的方法。在一种实施方式中，该方法包括降低foxp3l相对于foxp3s表达，并且任选地增强foxp3s的表达的步骤。

4、根据一种实施方式，通过具用抑制或阻止foxp3l表达的干扰寡聚体转染treg来降低foxp3l的表达。在一种实施方式中，转染步骤是在体外对分离的treg或肿瘤浸润淋巴细胞进行的。在一种实施方式中，干扰寡聚体靶向foxp3外显子2并且treg在体外或体内被转染。在一种实施方式中，用靶向外显子2(仅存在于foxp3l中)的干扰寡核苷酸和编码foxp3s异构体的核酸转染treg，从而同时减少foxp3l的产生并且增加foxp3s产生。在一种实施方式中，干扰寡聚体包括靶向以下foxp3区域tccctgcccattcaccgtccatacctggtg(seq id no:1)的核碱基的序列，或与tccctgcccattcaccgtccatacctggtg(seq id no：1)具有至少80％、85％、95％或99％序列同一性的核碱基的序列、其互补物或seq id no：1的10、15、18、20、23或25bp或更大的连续序列片段或其互补物。在一种实施方式中，干扰寡聚体是磷酸二酰胺吗啉代物(phosphorodiamidate morpholino)。在一种实施方式中，干扰寡聚体是包括与guauggacggugaaugg(seq id no：10)具有至少95％序列同一性的序列的干扰rna，任选地，其中干扰寡聚体是磷酸二酰胺吗啉代物。

5、根据一种实施方式，诱导treg转分化为辅助样t细胞的方法可以用于治疗癌症。目前乳腺癌的治疗选项包括内分泌治疗、化疗、放射疗法和手术，取决于乳腺癌的亚型和阶段。免疫疗法的最新进展为许多类型的癌症带来了新的治疗算法，提高了使用免疫疗法治疗乳腺癌的热情。通常情况下，treg大量浸润乳腺癌组织，从而抑制了抗肿瘤免疫。然而，申请人已经发现，被修饰为表达相对于foxp3l的foxp3s的增强的细胞内浓度的treg转分化为辅助样t细胞，并促进抗肿瘤免疫应答。

6、基于这一发现，foxp3靶向寡聚体(例如靶向fox3的外显子2的irna或吗啉代寡聚体(mo))可以用于将foxp3l的细胞产生转变为foxp3s表达，并且这种提供抗肿瘤活性的方法的功效已在临床前小鼠模型和患者来源的癌症类器官模型中得到验证。因此，这些促进foxp3s的mo，或改变细胞内foxp3s/foxp3l比率的其他机制，将作为乳腺癌治疗和其他实体瘤治疗的新型免疫疗法。

7、根据一种实施方式，使用人类吗啉代物序列或其他干扰核酸来诱导体内foxp3外显子2跳跃，并且从而在用干扰部分靶向的细胞中把人类foxp3l异构体转变为foxp3s异构体。在一种实施方式中，诱导foxp3外显子2跳跃的吗啉代物包括tccctgcctcaccgtccatacctggtg(seq id no：1)的序列，或与tccctgcctcaccgtccatacctggtg(seq id no：1)具有至少85％、90％、95％或99％序列同一性的核碱基的序列，或包括seq id no:1的至少10、15、18、20、23或25bp或更大的连续核碱基的seq id no:1的片段。在一种实施方式中，诱导foxp3外显子2跳跃的干扰部分包括选自由以下组成的组的序列

8、ccattcaccgtccatacctggtg(seq id no:3)；

9、cctgcccattcaccgtccatacc(seq id no:4)；

10、tgcccattcaccgtccatacctg(seq id no:5)；

11、gcccattcaccgtccatacctgg(seq id no:6)；

12、tccctgcccattcaccgtccatac(seq id no:7)；和

13、tgcccattcaccgtccatacctggt(seq id no:8)。

14、在一种实施方式中，包括一种或多种选自seq id no:1-8的组的irna或吗啉代物的组合物被用来跳跃fox3l的外显子2，并且将foxp3l的细胞生产转变为在靶向细胞中的foxp3s表达。

15、根据一种实施方式，使用人类吗啉代物序列或其他干扰核酸来阻断foxp3l的翻译或诱导含有外显子2区域的foxp3 mrna的降解，从而改变在用干扰部分靶向的细胞中的foxp3s/foxp3l比率。在一种实施方式中，吗啉代物或其他干扰核酸包括ctgcccacactgcctagtcatggtggcaccctccggggcacggctgg ccttgccacttacaggcactcctccaggacaggccacatttcatgcac cag(seq id no:12)的片段，其是seq id no:12的至少10bp或更大的连续核碱基或其互补物，并且与seq id no:12具有至少85％、90％、95％或99％的序列同一性。