生产β-胰蛋白酶的方法与流程

本发明涉及生产重组胰蛋白酶的方法、重组胰蛋白酶组合物及其用途。

背景技术：

1、胰蛋白酶是一种发现于许多脊椎动物的消化系统中的丝氨酸蛋白酶，其功能是水解蛋白，通过在氨基酸赖氨酸和精氨酸的羧基侧裂解肽链将它们分解成更小的肽(除了其中任一个随后是脯氨酸)。胰蛋白酶来源于胰腺，在胰腺中以无活性(酶原)形式产生，称为胰蛋白酶原。在胰腺中产生后，胰蛋白酶原进入小肠(通过胆管)，在小肠中它被转化为活性胰蛋白酶。然后胰蛋白酶(预先由胰蛋白酶原活化，例如通过肠激酶)从胰蛋白酶原裂解末端六肽以产生被称为β-胰蛋白酶的单链胰蛋白酶蛋白。随后的自溶产生具有两个或更多个肽链的其它活性形式，诸如α-胰蛋白酶，其具有通过二硫键结合的两个肽链。活化的胰蛋白酶然后可以执行其消化功能。

2、胰蛋白酶广泛用于生物技术和研究。例如，它与羧肽酶b组合用于生产胰岛素，用于将胰岛素原前体加工成胰岛素。胰蛋白酶也用于制备非细胞毒性梭菌神经毒素，诸如肉毒杆菌神经毒素(bont)。bont为无活性的单链多肽，其通过蛋白水解裂解事件在翻译后活化以形成通过二硫键连接的两条多肽链。裂解发生在特定的裂解位点，通常称为活化位点，其位于提供链间二硫键的半胱氨酸残基之间。胰蛋白酶通常用于催化这种裂解事件，因此，有利的是，不必将外源裂解位点改造到bont中。

3、大多数市售的胰蛋白酶产品由动物胰腺纯化而来，通常由牛或猪胰腺纯化得到。然而，由此类动物来源纯化涉及胰蛋白酶产物被病原体(诸如病毒或朊病毒)污染的风险，需要对胰蛋白酶进行过量纯化，这将使生产产率降低。此外，动物来源的胰蛋白酶通常不能用于制造药剂，诸如胰岛素和bont，因为此类胰蛋白酶无法满足优质生产规范(gmp)要求。

4、因此，缺少以高产率和足够纯度生产胰蛋白酶的合适方法用于活化药物组合物或化妆品组合物中使用的蛋白。

5、本发明解决了一个或多个上述问题。

技术实现思路

1、更详细地，本发明基于令人惊讶的发现，即可以通过原核表达系统以高纯度和高产率生产β-胰蛋白酶，其中胰蛋白酶原酶原被表达，并且随后被纯化，之后再被活化以提供胰蛋白酶。本发明人已经发现，使用原核表达系统(例如，原核宿主细胞)有利地克服了当使用真核表达系统时发生的生产规模扩大和蛋白产率不足的问题。例如，胰蛋白酶在酵母中的表达通常导致产率低且不经济。

2、通过表达胰蛋白酶原而非活性形式(胰蛋白酶)，本发明人已经发现，该蛋白在表达和纯化过程中不表现出自溶，这减轻了自裂解的问题以及所致的生产产率/纯度的降低。有利地，当表达胰蛋白酶原时，该蛋白形成不溶性包涵体，其包含蛋白水解无活性的聚集的胰蛋白酶原(不代表活性分子的最终三级结构)，从而增强避免自溶的能力。不溶性包涵体是所表达的蛋白的不溶性(但是稳定的)聚集体(通常是核或细胞质聚集体)。表达胰蛋白酶原形成包涵体的优点极为令人惊讶，这是因为通常认为当表达蛋白时应避免形成不溶性包涵体，而对存在于此类包涵体中的蛋白进行溶解和复性所需的下游方法被认为显著有损生产产率。

3、有利地，本发明使用阳离子交换层析(在使胰蛋白酶原复性之前)和阴离子交换层析(在使胰蛋白酶原复性之后)的组合。阴离子交换层析步骤合适地在低于胰蛋白酶原pi的ph下进行(例如，使得胰蛋白酶原具有净正电荷)。本发明人已经令人惊讶地发现，在这些条件下，杂质/污染物(净负电荷)与胰蛋白酶原(净正电荷)之间的净电荷差异可使得杂质/污染物保留在阴离子交换柱中并使胰蛋白酶原快速流通以进行收集，从而导致宿主细胞来源的污染物(例如细菌内毒素、宿主细胞蛋白和宿主细胞dna)的去除增加，由此得到高纯度的胰蛋白酶产物。实际上，本发明人已经表明，通过本发明的方法可容易地实现>90％的纯度水平。因此，本发明符合优质生产规范(gmp)要求，并且有利地可使得生产胰蛋白酶，该胰蛋白酶可用于对用作药物或化妆品组合物的部分的蛋白进行活化。有利地，应用于阴离子交换层析(aex)步骤的“流通(flow through)”方法可使得目标多肽(胰蛋白酶原)的高产率(相对于aex输入)的回收，同时污染物保持与柱结合。作为实例，图4a采用“第一次确认运行”，其概述了遵循本文所述方法的各个步骤的蛋白产率表。值得注意的是，在所述“第一次确认运行”中，aex/eshmuno q之后的“步骤产率”(相对于输入的产率)高于任何其它“纯化步骤”之后的产率，而“总产率”仅降低3％。该观察结果指示，由于去除了污染物，胰蛋白酶原的有利的“阳性富集”。

4、此外，本发明人已经表明某些步骤，特别是活化步骤(例如，其中胰蛋白酶原通过自动裂解被裂解成β-胰蛋白酶)在不存在聚集抑制剂(诸如l-精氨酸)的情况下对结果有所改善。在所述活化步骤的情况下，认为省略l-精氨酸可使得多肽更容易地相互作用，导致活化/裂解所需的胰蛋白酶原-胰蛋白酶原(或胰蛋白酶-胰蛋白酶原)相互作用改善。也就是说，在早期步骤(例如，复性)中，l-精氨酸的存在是有利的。因此，本发明的方法中，使胰蛋白酶原复性的步骤在l-精氨酸存在下进行(其中l-精氨酸的存在有利于帮助重折叠)，该方法涉及在不存在l-精氨酸的情况下进行的后续步骤。此类方法涉及/需要胰蛋白酶原存在于缓冲液(buffer)中持续一定的时间段(例如，在活化步骤的制备期间)，该缓冲液中不存在l-精氨酸，本发明人已经表明这可以导致胰蛋白酶原制剂的稳定性降低(参见实施例2)。不希望受理论束缚，认为在不存在l-精氨酸，聚集抑制剂的情况下，(未活化的)胰蛋白酶原分子形成聚集体和沉淀。然而，有利地，本发明人已经表明，通过遵守某些温度阈值和/或最大“保持时间(hold-times)”(在不存在l-精氨的情况下保持胰蛋白酶原的时间)，可以抑制或甚至避免此类聚集。

5、因此，本发明人不仅发现了与l-精氨酸不存在时进行活化的方法所相关的问题，而且还证明了克服所述问题的有利方案。因此，仍然可以在l-精氨酸存在下进行复性(其中它是有利的)，而在活化步骤之前去除l-精氨酸(其中它是不利的)同时不损害胰蛋白酶原制剂的稳定性。

技术特征：

1.一种生产β-胰蛋白酶的方法，所述方法包含：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤a)之前进行以下步骤：

3.一种生产β-胰蛋白酶的方法，所述方法包含：

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包含使所述复性胰蛋白酶原经受体积减小步骤。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包含使所述复性胰蛋白酶原经受过滤步骤，所述过滤步骤去除具有大小小于20kda的分子。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述体积减小步骤在所述过滤步骤之前、与其同时或之后进行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))从提供纯化的复性胰蛋白酶原(例如，根据步骤g))开始进行长达120分钟；优选

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过加入钙促进所述纯化的复性胰蛋白酶原的所述蛋白水解活性。

9.根据权利要求8所述的方法，进一步包含：

10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中使变性胰蛋白酶原复性的步骤在包含l-精氨酸的缓冲液中进行。

11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下至少孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))在不包含l-精氨酸的缓冲液中进行。

12.根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))之前，当存在于不包含l-精氨酸的缓冲液中时，所述胰蛋白酶原不经受15-30℃的温度超过2小时。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性的步骤中：

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在使所述纯化的变性胰蛋白酶原复性的步骤中：变性胰蛋白酶原以<0.2mg/ml的浓度存在。

15.根据权利要求14所述的方法，其中变性胰蛋白酶原以>0.06mg/ml至<0.2mg/ml的浓度存在；优选约0.1mg/ml。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包含分离所述β-胰蛋白酶。

17.根据权利要求16所述的方法，其中通过苄脒亲和层析分离所述β-胰蛋白酶。

18.根据权利要求1、2、4至9或13至17所述的方法，其中步骤a)和b)在不存在钙的情况下进行；任选地，其中步骤ii)、iii)、iv)和/或v)在不存在钙的情况下进行。

19.根据权利要求3至17中任一项所述的方法，其中步骤f)和g)在不存在钙的情况下进行；任选地，其中步骤b)、c)、d)和/或e)在不存在钙的情况下进行。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原和β-胰蛋白酶分别是野生型胰蛋白酶原和野生型β-胰蛋白酶。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原和β-胰蛋白酶分别是牛胰蛋白酶原和牛β-胰蛋白酶。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌(escherichia coli)宿主细胞。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过加入异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.25-0.75mm，优选约0.5mm，来诱导所述胰蛋白酶原的表达。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原的表达被诱导至少4小时；优选至少6小时；更优选约8小时。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰蛋白酶原的表达被诱导至少4-12小时；优选至少6-10小时。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述宿主细胞培养至在600nm的光密度(od600)为35-65；优选

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述复性胰蛋白酶原存在于与所述阴离子交换层析介质无相互作用或仅微弱相互作用的级分中。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，加入钙至终浓度为至少10mm，优选至少20mm。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，加入钙至终浓度为20-150mm，优选50-100mm。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，将所述样品孵育5-48小时，优选5-20小时。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在促进所述胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下孵育所述纯化的复性胰蛋白酶原的步骤(例如，步骤h))中，将所述样品在15-30℃的温度孵育。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包含使具有活化环的单链梭菌神经毒素(优选bont/e)与β-胰蛋白酶接触，其中所述β-胰蛋白酶水解所述单链梭菌神经毒素的活化环的肽键，从而生产双链梭菌神经毒素。

33.一种β-胰蛋白酶组合物(例如，可通过本文所述的方法获得)，其中所述组合物中包含的总多肽的至少80％是β-胰蛋白酶，并且其中所述组合物的活性水平为至少3000usp单位/mg总多肽，任选地其中通过测定来确定所述活性水平，所述测定包含：

34.一种生产双链梭菌神经毒素的方法，所述方法包含：

35.一种双链梭菌神经毒素，其可通过权利要求32或34所述的方法获得。

技术总结
一种生产β‑胰蛋白酶的方法，所述方法包含：a)使变性胰蛋白酶原复性，从而生产复性胰蛋白酶原，其中所述复性在包含L‑精氨酸的缓冲液中进行；b)通过阴离子交换层析对复性胰蛋白酶原进行纯化，从而提供纯化的复性胰蛋白酶原；和c)在促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下对纯化的复性胰蛋白酶原进行孵育，其中胰蛋白酶原通过所述蛋白水解活性裂解成β‑胰蛋白酶；其中步骤a)和b)在不促进胰蛋白酶原的蛋白水解活性的条件下进行；其中所述方法不包含加入用于将胰蛋白酶原裂解成β‑胰蛋白酶的另外的蛋白酶；其中至少步骤c)在不包含L‑精氨酸的缓冲液中进行；并且其中在步骤c)之前，当存在于不包含L‑精氨酸的缓冲液中时，不使胰蛋白酶原经受>8℃的温度超过38小时。

技术研发人员：P·M·H·马克思,M·梅维斯,C·D·威尔逊,A·A·布加杰夫斯卡-沃勒,D·E·格鲁伯,G·刘易斯
受保护的技术使用者：益普生生物制药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13