IL27受体结合相关的组合物和方法与流程

背景技术：

1、白细胞介素-27受体(il27r)是白细胞介素-27(il27)的一种i型细胞因子受体。它是一种异二聚体，由il27rα亚基和糖蛋白130(gp130)构成。il27由抗原呈递细胞表达，并诱导免疫系统中不同群体的t细胞分化。当il27结合至il27r时，信号转导途径，例如jak-stat和p38 mapk途径被开启以诱导促炎或抗炎反应，这些反应涉及不同类型的细胞，如巨噬细胞、树突细胞、t细胞和b细胞。被激活的反应可能取决于il27的外部环境。

2、il-27是一种异二聚体细胞因子，由两个非共价连接的亚基p28和ebi3组成。p28亚基属于4-螺旋束细胞因子家族，而ebi3是可溶性细胞因子受体的可能的最短形式，具有两个典型的细胞因子结合结构域(pflanz s,等,immunity.2002年6月；16(6):779-90)。

3、il-27的主要结合受体是il-27r1(也称为tccr-或wsx-1受体)。il-27和il-27r1形成具有相当大亲和力(nm)的复合物。gp130是结合il-27/il-27r复合物以产生活性信号转导复合物的第二受体。gp130对il-27/il-27r1复合物的结合比il-27和il-27r1之间的相互作用弱得多(pflanz s,等,j immunol.2004年2月15日；172(4):2225-31)。

4、il-27胞外结构域具有5个结构域。前两个结构域形成il-27结合结构域。通常，d1和d2之间的环提供了大部分的结合能。

5、其他3个结构域称为纤连蛋白iii型结构域(fn3)。各fn3结构域的序列各不相同。

6、gp130受体具有6个结构域。gp130的顶部结构域d1结合il-27的p28。d2和d3对il-27的结合贡献很小。膜近端的3个结构域是fn3结构域。各fn3结构域的序列各不相同。

7、il-27r的结构尚不清楚，但结构域结构是已知的。gp130的结构被称为与il-6的复合。基于该结构，显而易见的是，fn3结构域在能量上对il-27r复合物的形成没有贡献。相反，gp130的结构与结构域4和5以彼此80％的角度形成‘c’。各个“高”受体中的某些残基是保守的与gp130中的d4和d5相似。这表明gp130家族的所有高受体，包括il-27r，都形成了这种‘c’结构。(yibin xu,等,j biol chem.2010年7月9日；285(28):21214-8)。

8、il-27r具有5个胞外结构域。d1和d2是细胞因子结合结构域。d3、d4和d5是fn3结构域。由于各个受体的‘c’形，il-27r的d5结构域和gp130的d6结构域将在膜处紧密接近。这是受体复合物能够在两种受体的胞内结构域触发jak结合所需要的。

技术实现思路

1、本发明提供了可用于细胞受体的配对以产生可用于治疗哺乳动物对象疾病的所需效果的组合物。

2、本文描述的结合分子有几个优点。il-27r的天然配体，il-27,导致gp130和il-27ra接近(即通过它们对il-27的同时结合)。然而，当il-27在哺乳动物(特别是人)对象中被用作治疗剂时，它也可能通过多种机制引发许多不利和不良影响，包括gp130和il-27ra在其他细胞类型上的存在以及与其他细胞类型上的gp130和il-27ra的结合可能会对表达gp130和il-27ra的细胞产生不良影响和/或不期望的信号转导。本发明涉及调节gp130和il-27ra结合的多重效应的方法和组合物，从而产生所需的治疗信号转导，特别是在所需的细胞或组织亚型中，同时最小化不期望的活性和/或胞内信号转导。

3、在一些实施方式中，本文所述的il-27r结合分子是il-27受体的部分激动剂。在一些实施方式中，本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是完全激动剂。在一些实施方式中，本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是超级激动剂。

4、在一些实施方式中，结合分子通过与所需细胞类型上的gp130和il-27ra的结合提供最大所需的il-27胞内信号转导，同时对其他不期望的细胞类型提供显著更少的il-27信号转导。例如，这可以通过选择与il-27对gp130和il-27ra的亲和力相比，对gp130和il-27ra造成不同的e最大，或具有不同亲和力的结合分子来实现。因为不同的细胞类型以不同的灵敏度响应配体与其同源受体的结合，通过调节二聚体配体(或其单个结合部分)对il-27受体相对于野生型il-27结合的亲和力可促进所需活性的刺激同时减少对非靶细胞的不期望的活性。

5、本发明提供作为il-27受体激动剂的二价结合分子，所述二价结合分子包括：

6、特异性结合至gp130的胞外结构域的第一单域抗体(sdab)(“抗-gp130 sdab”)；和

7、特异性结合至il-27ra的胞外结构域的第二单域抗体(“抗il-27ra sdab”)，

8、其中该抗-gp130 sdab和抗-il-27ra sdab是稳定缔合的，首先，其中用有效量的二价结合分子接触表达gp130和il-27ra的细胞，当被其天然同源il-27激活时，导致gp130和il-27ra的二聚体化并导致il-27受体的胞内信号转导特征。在一些实施方式中，一种或两种sdab是scfv。在一些实施方式中，一种或两种sdab是vhh。

9、在一些实施方式中，二价结合分子的一个sdab是scfv，另一个sdab是vhh。

10、在一些实施方式中，第一和第二sdab通过化学连接共价结合。

11、在一些实施方式中，第一和第二sdab作为单个连续多肽提供。

12、在一些实施方式中，第一和第二sdab作为单个连续多肽提供，任选地在第一和第二sdab的氨基酸序列之间包含间插多肽接头。

13、在一些实施方式中，任选地包含接头的二价结合分子，任选地表达为具有其他氨基酸序列的融合蛋白。在一些实施方式中，其他氨基酸序列是纯化柄，例如螯合肽或其他蛋白质，例如fc分子的亚基。

14、一方面，本发明提供il27受体(il27r)结合蛋白，其特异性结合至il27rα亚基(il27rα)和糖蛋白130亚基(gp130)，其中，当结合至il27rα和gp130时，该结合蛋白导致il27rα和gp130的多聚化，且该多聚化导致与gp130和il27rα胞内结构域关联的jak激酶的激活以及胞内信号转导，其中该结合蛋白包括特异性结合至il27rα的单域抗体(sdab)(抗-il27rαsdab)和特异性结合至gp130的sdab(抗-gp130 sdab)。在一些实施方式中，il27rα和gp130的多聚化可导致下游信号转导。

15、在一些实施方式中，抗-il27rαsdab是vhh抗体(抗il27rαvhh抗体)和/或抗-gp130sdab是vhh抗体(抗gp130 vhh抗体)。在一些实施方式中，抗-il27rαsdab和抗-gp130 sdab直接或通过肽接头连接。在一些实施方式中，肽接头包含1至50个氨基酸。在具体的实施方式中，肽接头包含gggs的序列(seq id no:108)。

16、在一些实施方式中，il27r结合蛋白包括：

17、第一vhh抗体，其包含相对于表1a的行的cdr1的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr1；相对于表1a的同一行的cdr2的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr2；和相对于表1a的同一行的cdr3具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr3；和

18、第二vhh抗体，其包含相对于表1a的同一行的cdr4的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr1；相对于表1a的同一行的cdr5的序列具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr2；和相对于表1a的同一行的cdr6具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性，或具有0、1、2或3个氨基酸变化，任选保守的氨基酸变化的cdr3。

19、在一些实施方式中，il27r结合蛋白包含与表1a所示的双vhh二聚体序列中任一个具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

20、在某些实施方式中，抗il27rαvhh抗体包含相对于seq id no:193-198中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr1；相对于seq id no:199-204中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr2；和相对于seq id no:205-210中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr3。在其他实施方式中，抗gp130 vhh抗体包含相对于seq id no:211-217中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr1；相对于seq id no:218-224中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr2；和相对于seq id no:225-231中任一项序列具有0、1、2或3个氨基酸变化的cdr3。

21、在具体的实施方式中，il27r结合蛋白包含抗-il27rαvhh抗体中的cdr1、cdr2和cdr3，以及抗-gp130 vhh抗体中的cdr1、cdr2和cdr3，如表1的行中所列出。

22、在一些实施方式中，结合蛋白包含连接至接头的n-末端的抗gp130 vhh抗体和连接至接头的c-末端的抗il27rαvhh抗体。在一些实施方式中，抗gp130 vhh抗体包含相对于seq id no:232-237中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。在一些实施方式中，抗il27rαvhh抗体包含相对于seq idno:238-244中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。

23、在具体的实施方式中，抗-gp130 vhh抗体和抗-il27rαvhh抗体各包含相对于表2a的行中所列序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

24、在某些实施方式中，结合蛋白包含与seq id no:1-42中任一项序列基本相同的序列。在某些实施方式中，结合蛋白包含相对于seq id no:1-42中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

25、在一些实施方式中，结合蛋白包含连接至接头的n-末端的抗il27rαvhh抗体和连接至所述接头的c-末端的抗gp130 vhh抗体。在一些实施方式中，抗il27rαvhh抗体包含相对于seq id no:245-251中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。在某些实施方式中，抗-gp130 vhh抗体包含与seq id no:252-257中任一项序列具有至少90％序列同一性的序列。

26、在具体的实施方式中，抗il27rαvhh抗体和抗gp130 vhh抗体各包含相对于表3a的行中所列序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

27、在某些实施方式中，结合蛋白包含与seq id no:43-84中任一项序列基本相同的序列。在某些实施方式中，结合蛋白包含相对于seq id no:43-84中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的序列。

28、另一方面，本发明提供了编码本文所述的il27r结合蛋白的分离的核酸。在某些实施方式中，分离的核酸包含相对于表1b中序列或seq id no:109-192中任一项序列具有至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的序列。本发明还提供了包含核酸的表达载体。本发明还提供了包含表达载体的分离的宿主细胞。

29、在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的il27r结合蛋白和药学上可接受的运载体。

30、在另一方面，本发明提供了一种在有需要的对象中治疗自身免疫或炎性疾病、病症或病况、肿瘤性疾病或病毒感染的方法，包括向对象给予治疗有效量的本文所述的il27r结合蛋白或本文所述的药物组合物。

31、在一些实施方式中，该方法进一步包括给予一种或多种选自下组的补充试剂：类固醇、janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mtor抑制剂、imdh抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗性抗体。在某些实施方式中，治疗性抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体：blys、cd11a、cd20、cd25、cd3、cd52,igeil12/il23、il17a、il1β、il4rα、il5、il6r、整合素-α4β7、rankl、tnfα、vegf-a和vla-4。

32、在某些实施方式中，该疾病、病症或病况选自：病毒感染、幽门螺杆菌感染、htlv、器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化症、过敏、哮喘、神经退行性疾病，例如阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮(sle)、自体炎症疾病、炎性肠病(ibd)、克罗恩病、糖尿病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、sea综合征、幼年皮肌炎、幼年银屑病关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿性关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、sea综合征、银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎；脂溢性皮炎、日光性皮炎；脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病、毛囊角化病；寻常痤疮；瘢痕瘤；痣；肉赘，包括疣、湿疣或尖锐湿疣，以及人乳头状瘤病毒(hpv)感染。

33、本文所述的il27r结合蛋白可用于在有需要的对象中治疗肿瘤性疾病，例如癌症(例如，实体瘤癌症；例如，非小细胞肺癌(nsclc)、肾细胞癌(rcc)或黑色素瘤)和/或感染性疾病(例如，细菌感染和病毒感染(例如，由丙型肝炎病毒(hcv)、人乳头瘤病毒(hpv)或人免疫缺陷病毒(hiv)导致的病毒感染)。il27r结合蛋白结合至并激活cd8+t细胞、cd4+t细胞和/或t调节(treg)细胞。il27r结合蛋白可以在不同的细胞类型中触发不同水平的下游信号转导。例如，通过改变il27r结合蛋白中抗il27rαvhh抗体和抗gp130 vhh抗体之间的接头的长度，与不期望的细胞类型相比，il27r结合蛋白可以在期望的细胞类型中引起更高水平的下游信号转导。在一些实施方式中，通过改变接头长度，与其他细胞中的下游信号转导水平相比，il27r结合蛋白可以在t细胞(例如cd8+t细胞)中引起更高水平的下游信号转导。在其他实施方式中，具有不同结合亲和力的不同抗il27rαvhh抗体和具有不同结合亲和力的不同抗gp130 vhh抗体可以组合以制备不同的il27r结合蛋白。此外，还可以改变两种抗体在结合蛋白中的取向以制备不同的结合蛋白(即，抗il27rαvhh抗体-接头-抗gp130 vhh抗体，或抗gp130 vhh抗体-接头-抗il27rαvhh抗体)。可以筛选不同的il27r结合蛋白，以找到理想的结合蛋白，与不期望的细胞类型相比，该蛋白在所需的细胞类型中引起更高水平的下游信号转导。在一些实施方式中，t细胞(例如cd8+t细胞)中的下游信号转导水平是其他细胞中下游信号转导水平的至少1.1、1.5、2、3、5或10倍。

34、具体地，il27r结合蛋白结合至并激活cd8+t细胞。在一些实施方式中，il27r结合蛋白结合至并激活cxcr5+cd8+t细胞。众所周知，在例如病毒感染期间，il27可以促进和维持记忆样cxcr5+cd8+t细胞的快速分裂。cxcr5+cd8+t细胞可以在持续感染或癌症期间维持t细胞反应，并在抗-pd1治疗后驱动cd8+t细胞的增殖爆发。因此，本文所述的il27r结合蛋白有助于在慢性感染和肿瘤性疾病(例如癌症)中维持和增强自我更新的t细胞。