包含圆环病毒科衣壳蛋白的融合蛋白及其构成的嵌合病毒样颗粒的制作方法

本发明涉及可用于制备疫苗，特别是用于减少由至少一种病原体感染引起的一种或多种临床体征，例如由病毒感染引起的临床体征的重组构建的多肽。更具体地，本发明涉及包含与异源蛋白质或其片段连接的圆环病毒科(circoviridae)衣壳蛋白的多肽，以及由此类多肽构成的嵌合病毒样颗粒。在一个实例中，提供了融合蛋白，其包含与轮状病毒vp8蛋白的免疫原性片段连接的pcv2 orf2蛋白，并且可用于减少猪中由轮状病毒感染引起的一种或多种临床体征、死亡率或粪便脱落。

背景技术：

1、在一系列植物和动物物种中发现且通常被称为圆环病毒，命名为圆环病毒科的病毒科表征为圆形、无包膜的病毒粒子，具有由单一蛋白质的60个拷贝构成的二十面体衣壳。圆环病毒的ssdna基因组代表已知的最小病毒dna复制子。

2、在该科中包括的动物病毒有鸡贫血病毒(cav)；鸽圆环病毒；喙羽病病毒(bfdv)；蝙蝠相关圆环病毒；和猪圆环病毒(pcv)。最具经济意义的圆环病毒之一是猪圆环病毒2型(pcv2)，猪圆环病毒相关疾病的病因。

3、pcv2 orf2基因可以在昆虫细胞培养物中进行表达。还已显示了pcv2 orf2蛋白组装成病毒样颗粒(vlp)。这些vlp是基本上空的pcv2衣壳并且是高度免疫原性的。

4、文献中已描述了利用pcv2 orf2蛋白作为抗原载体的几种尝试。编码短(≤30个氨基酸)肽的序列已附加到pcv2 orf2读码框的3'端，以及插入编码表面暴露环的区域内。

5、使用杆状病毒感染的昆虫细胞表达的重组pcv2病毒和vlp两者均已制备为在颗粒表面上展示肽(beach等人j virol.85(9):4591-4595(2011)；huang等人virus res.161:115-123(2011)；li等人vet microbiol.163:23-32(2013)；huang等人appl microbiolbiotechnol.98:9339-9350(2014)；hu等人vaccine 34:1896-1903(2016)；wang等人frontcell infect micriobiol.8:232(2018)；ding等人adv healthcare mater.1900456(2019)；wang等人vet.microbiol.235:86-92(2019))。这进一步包括wo2009088950a2连同更近的wo2016160761a2。迄今为止，文献中没有描述由圆环病毒衣壳蛋白和具有相当长度的第二蛋白质或蛋白质结构域组成的单一多肽的表达，其导致第二蛋白质或蛋白质结构域在圆环病毒衣壳或vlp的外表面上展示。最近，伴随插入bc环内或作为c末端延伸的7氨基酸q标签序列表达的pcv2 orf2已缀合至伴随6氨基酸k标签c末端延伸表达的增强型绿色荧光蛋白(egfp)。这种缀合需要分别表达和纯化修饰的pcv2 orf2、egfp、以及催化q标签和k标签之间的反应的微生物转谷氨酰胺酶。虽然确认了缀合，但并未确认vlp的存在(masuda等人j insect biotechnol sericol.87:53-60(2018))。

6、然而，为了诱导足够的免疫应答以便实现充分的疫苗接种，可能需要将长于30个氨基酸残基的抗原，特别是蛋白质结构域或蛋白质，与载体蛋白质缀合。在这方面，希望此类融合蛋白可以作为单个分子由细胞表达，所述单个分子能够同源多聚化以形成病毒样颗粒(vlp)，然后诱导较长的抗原在颗粒的表面上的正确折叠和展示，使得抗原具有足够的免疫原性以诱导所需的免疫应答。

7、因此，需要这样的多肽，其包含与较长的抗原缀合的载体蛋白质，并且其中融合蛋白具有上述有益性质。

8、此外，希望产生此类融合蛋白，其能够诱导针对具有复杂病毒粒子的病毒例如轮状病毒的适当免疫应答。

9、轮状病毒是双链rna病毒，其构成在呼肠孤病毒科(reoviridae)内的属。已知轮状病毒感染引起胃肠疾病，并且被视为婴儿中的胃肠炎的最常见原因。轮状病毒通过粪口途径传播并感染内衬小肠的细胞。受感染的细胞产生诱导胃肠炎的肠毒素，导致严重的腹泻以及有时通过脱水的死亡。

10、轮状病毒具有由双链rna(dsrna)的11个区段构成的基因组，并且目前基于抗原性质和内部病毒衣壳蛋白6(vp6)的基于序列的分类而分类成8组(a-h)，如通过国际病毒分类委员会(international commitee on taxonomy of viruses)(ictv)定义且通过matthijnssens等人(arch virol157:1177–1182(2012))概括的，其中该出版物和本文提及的进一步出版物都整体引入作为参考。

11、轮状病毒的基因组编码6种结构蛋白(vp1-vp4、vp6和vp7)和6种非结构蛋白(nsp1-nsp6)，其中基因组区段1-10各自编码一种轮状病毒蛋白，并且基因组区段11编码两种蛋白质(nsp5和nsp6)。

12、在轮状病毒a的背景下，不同的毒株可以基于结构蛋白vp7和vp4分类为基因型(通过比较序列分析和/或核酸杂交数据定义的)或血清型(通过血清学测定定义的)。vp7和vp4是最外层蛋白质层(外衣壳)的组分，并且两者均携带中和表位。vp7是形成病毒粒子的外层或表面的糖蛋白(因此指定为“g”)。vp7决定毒株的g型，并且关于g血清型和g基因型的名称是等同的。vp4是蛋白酶敏感性的(因此指定为“p”)并决定病毒的p型。与g型形成对比，关于p血清型和基因型分配的编号是不同的(santos n.et hoshino y.，2005，reviews inmedical virology，15，29-56)。因此，p血清型指定为p随后为分配的编号，并且p基因型通过p随后为括号中的指定编号进行指定(例如，“p[7]”或“p[13]”)。属于同一基因型的毒株具有高于89％的氨基酸序列相同性(estes和kapikian.rotaviruses.in:knipe，d.m.；howley，p.m.fields virology，第5版；wolters kluwer/lippincott williams&wilkinshealth:philadelphia，pa，usa(2007)；gorziglia等人proc natl acad sci u s a.87(18):7155-9(1990))。

13、轮状病毒还特别是猪中的胃肠炎的主要原因，在几乎100％的猪中存在针对a组和c组轮状病毒的抗体(vlasova等人viruses.9(3):48(2017))。目前，仅针对轮状病毒a的改良活疫苗或灭活疫苗是可用的。无法在实验室培养轮状病毒c已阻碍了针对该组的疫苗的开发，其随后增加了重组疫苗的吸引力。

14、重组抗轮状病毒疫苗的生成被轮状病毒衣壳的复杂性阻碍，所述轮状病毒衣壳由排列成三层的四种蛋白质构成。最内层由具有t＝1对称性的60个vp2二聚体构成。vp2层是中间层的正确排序所必需的，所述中间层由具有t＝13对称性的260个vp6三聚体形成。所得到的vp2和vp6之间的对称性不匹配产生五个不同的vp6三聚体位置和三种不同的孔类型。在vp2的不存在下，vp6很容易以盐和ph依赖性方式形成有序的高分子量微管和球状体，其可能代表病毒组装的副产物。在衣壳中，vp6层被260个ca2+依赖性vp7三聚体覆盖，所述vp7三聚体充当将vp4刺突固定到位的夹子。vp7是糖基化或g型抗原，且含有中和表位。大多数中和抗体仅识别三聚体vp7，并且被认为通过阻止vp7三聚体解离而起作用，其依次又阻断刺突的释放。轮状病毒刺突呈现为60个vp4三聚体，其仅在ii型孔处插入vp6层内。vp4含有中和表位，并且是p型抗原，被胰蛋白酶切割成刺突基部vp5*和细胞相互作用头部vp8*，其在切割之后保持与vp5*结合。胰蛋白酶消化使刺突准备用于细胞进入，在此期间刺突经历深刻的结构重排，以暴露用于宿主细胞上的受体结合的活性位点。忽略上述组装过程的复杂性，难以实现具有促进正确组装的环境条件的轮状病毒衣壳蛋白的化学计量表达。

15、鉴于轮状病毒衣壳组装中的困难，存在对亚单位疫苗方法的兴趣。vp7和vp4是含有中和表位的两种蛋白质，然而，vp7的使用已因其糖基化和钙依赖性三聚化而变得复杂。vp4的使用因其三聚化、胰蛋白酶消化和潜在构象状态的范围而变得复杂。vp8蛋白，也命名为vp8结构域或vp8*，其由含有中和表位的vp4的胰蛋白酶消化产生，是单体的，其结构已确定至高分辨率(dormitzer等人embo j.21(5):885-897(2002))，并且被描述为高度稳定的。

16、此外，在vp8蛋白内，凝集素样结构域(aa65-224)被视为与宿主受体相互作用，并且涉及病毒与宿主细胞的附着(rodriguez等人，plos pathog.10(5):e1004157(2014))。

17、开发用于儿童的轮状病毒亚单位疫苗的方法已得到描述，其中在大肠杆菌中产生了n末端连接到破伤风类毒素通用cd4+t细胞表位(aa830-844)p2的截短的vp8蛋白(vp8*的氨基酸残基64(或65)-223)(wen等人vaccine.32(35):4420-7(2014))，并且在婴儿和幼儿中进行测试(groome等人lancet infect dis.17(8):843-853(2017))。然而，由于单价亚单位疫苗(基于轮状病毒基因型p[8]的截短的vp8蛋白)的这种使用引起针对异型轮状病毒株的弱应答，最近还测试了三价疫苗制剂(基因型p[4]、p[6]、p[8])(groome等人lancetinfect dis.s1473-3099(20)30001(2020))。

18、在另一种方法中，n末端截短的vp8蛋白，“vp8-1”(aa26-241)，在n末端或c末端融合到霍乱毒素(ctb)的五聚化无毒b亚单位。在所得到的五聚体融合蛋白(ctb-vp8-1、vp8-1-ctb)中，仅ctb-vp8-1(即n末端融合到ctb的vp8-1)被视为用于进一步开发的可行候选物，与vp8-1-ctb相比，它显示了对gm1或对vp8*特异性的构象敏感的中和单克隆抗体的更高结合活性，并且在小鼠模型中引发更高的中和抗体滴度并赋予更高的保护功效(xue等人hum vaccin immunother.12(11)2959-2968(2016))。

19、然而，鉴于轮状病毒衣壳组装中的困难，存在对替代亚单位疫苗方法的兴趣，特别是因为亚单位疫苗一般被视为非常安全的。另外，强烈期望有效轮状病毒亚单位抗原的重组表达，其允许难以培养的此类轮状病毒的疫苗抗原的简单生产。此外，由于轮状病毒是猪中的胃肠炎的主要原因，因此特别需要具有包括抗原的用于猪的亚单位疫苗，其允许可与目前商购可得的用于猪的mlv轮状病毒疫苗可比较或甚至更有效的效力。

技术实现思路