用于多光子荧光显微成像的分子构建体的制作方法

本技术总体上涉及用于多光子荧光显微成像的分子构建体。该分子构建体具有第一非荧光构型(2pap-c)和第二荧光构型(2pap-cl)，并且包括与光致变色分子连接的双光子吸收探针(2pap)，该光致变色分子能够从第一有色异构形式(c)可逆地变为第二无色异构形式(cl)。当双光子吸收探针(2pap)吸收两个光子时，该第一有色形式(c)能够异构化为第二无色异构形式(cl)。本技术还涉及利用分子构建体在多光子显微镜中分析靶标结构的方法。此外，本技术涉及用分子构建体标签化的抗体，以及分子构建体用于对靶标结构进行成像的用途。

背景技术：

1、多光子显微成像能够对各种结构和生物样品进行先进的高分辨率可视化。这样的成像使得能够在体内和体外于组织深处的细胞水平上可视化并分析组织形态和生理机能。

2、最常见的多光子荧光成像技术是双光子显微术(two-photon microscopy)，其利用两个近红外光子作为激发源。双光子激发是荧光过程，其中荧光团，即荧光探针通过同时吸收两个光子而被激发。

3、双光子吸收探针允许深度组织穿透、有效的光检测和降低的光漂白，这使得该技术用于多种应用，诸如生物成像、疾病的诊断和监测。

4、双光子激发是非线性光学过程，并需要由波长比发射光更长的两个光子同时激发。双光子激发显微术通常利用由例如激光器发出的近红外(nir)激发光来激发荧光染料。对于每次激发，nir光的两个光子被吸收。由于该过程依赖于两个光子的同时吸收，因此所产生的荧光发射随着激发强度的平方而变化。

5、当双光子探针应用于多光子显微术时，光的强度随着距焦点的距离的二次方递减，这意味着双光子吸收探针发射光，使得荧光强度以1/z4变化，其中，z是距焦点的距离。在利用三光子吸收探针和四光子吸收探针的多光子过程中，荧光强度会分别以1/z6和1/z8变化。

6、因此，使用三光子吸收探针和四光子吸收探针可显著增加成像样品的空间分辨率。然而，在多光子成像应用中使用三光子吸收探针和四光子吸收探针通常需要极高的光强度。这是因为探针同时分别吸收三个和四个光子的概率较低，并且还因为难以获得激发波长。这限制了三光子探针和四光子探针在多光子显微镜应用中的使用。

7、无论用于双光子显微术的分子探针如何，该过程总是受限于光物理的基本定律，即发射强度依赖于激发光的强度的二次方，得到1/z4分辨率。这些分子的二次方依赖来自于双光子吸收机制；即两个光子被分子吸收，使得光子能量的总和对应于双光子允许的电子跃迁的能量。因为需要两个光子同时撞击分子，所以每个单个分子的光子吸收概率(和速率)依赖于光子通量的二次方。

8、鉴于上述挑战，需要提供用于多光子显微应用的改进的探针，其将与双光子吸收探针以及三光子吸收探针或四光子吸收探针相关的优点结合起来。

9、更具体地说，需要提供改进的双光子吸收探针，其能够提供增强的成像结构或样品的空间分辨率。

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本技术的目的是提供关于用于多光子显微成像的多光子探针的改进。具体地，需要提供能够提供改进的空间分辨率的双光子吸收探针。

2、根据本技术的第一方面，提供了用于多光子荧光显微成像的分子构建体，其中，所述分子构建体具有第一非荧光构型(2pap-c)和第二荧光构型(2pap-cl)，其中，所述分子构建体包括：

3、双光子吸收探针(2pap)，连接于

4、光致变色分子，其中，所述光致变色分子能够从第一有色异构形式(c)可逆地变为第二无色异构形式(cl)，其中，当所述双光子吸收探针(2pap)吸收两个光子时，所述第一有色形式(c)异构化为所述第二无色异构形式(cl)，其中，所述第一有色异构形式(c)的吸收光谱与所述双光子吸收探针(2pap)的发射光谱重叠，并且其中，所述第二无色异构形式(cl)的吸收光谱与所述双光子吸收探针(2pap)的发射光谱不重叠。

5、本技术的分子构建体取决于双光子吸收的激发，但是当用于双光子显微术时，可提供与四光子吸收探针相同的空间分辨率。换句话说，本技术的分子构建体结合了双光子吸收探针的优点(需要相对低的激发强度，在显微镜实验中可以使用约800nm的标准激光光源，并且激发光位于在组织中穿透深度最大的光学窗口的中间)和四光子显微术的优点(显著改进的空间分辨率，例如100nm或以下)。

6、本技术的分子构建体允许多光子显微术中真正的范式转变，因为可以实现与四光子显微术提供的空间分辨率相当的空间分辨率，而不需要吸收四个光子。反而，可以利用双光子吸收探针，并且可以用标准双光子显微镜设备和作为辐照源的激光进行成像。

7、这使得显微术在生物医学领域(诸如疾病或其他临床情况的诊断和评估)的应用有了质的飞跃。

8、多光子显微镜的大多数使用者无法享受高阶激发(三光子或四光子吸收)所带来的优质分辨率。无论双光子显微术的分子探针设计得多么精心，实验总是受到光物理基本定律的限制；即发射强度依赖于激发光的强度的二次方，得到1/z4分辨率。这些分子的二次方依赖来自于双光子吸收的机制：两个光子被分子吸收，使得光子能量的总和对应于双光子允许的电子跃迁的能量。因为需要两个光子同时撞击分子，所以每个单个分子的光子吸收的概率(和速率)依赖于光子通量的二次方。本技术的分子构建体遵守这一定律，同时它提供了一种创新的和前所未有的方法，其通过响应激发光以使发光物质的浓度还依赖于激发光的强度的二次方来规避这一限制。

9、本技术的分子构建体包括与光致变色分子连接的双光子吸收探针(2pap)，其中光致变色分子也可以被称为“分子光开关”。双光子吸收探针(2pap)可以与光致变色分子共价连接。

10、光致变色分子可以采用第一有色异构形式(c)和第二无色形式(cl)。

11、在单光子过程中，该有色形式经由可见光(vis)能够异构化为无色形式。此外，作为所提出的设计功能的核心，双光子吸收触发了同样的过程。

12、第一有色异构形式(c)的吸收光谱与双光子吸收探针(2pap)的发射光谱重叠，这使得在fret反应中，第一构型的双光子吸收探针(2pap)2pap-c的发射被有色异构形式(c)定量猝灭。

13、fret(荧光共振能量转移)是两种荧光团之间距离依赖性的相互作用。在fret中，光源激发供体荧光团，供体荧光团将能量转移到受体荧光团，而不发光。为了实现有效的fret过程，供体荧光团和受体荧光团必须彼此靠近。此外，供体荧光团的发射光谱必须与受体荧光团的吸收光谱重叠。

14、fret反应不仅引起2pap发射的猝灭，而且还敏化了光致变色分子的有色异构形式(c)的激发。由于有色异构形式(c)的命运并不依赖于其如何终止于激发态，所以随后进行fret敏化的异构化以产生光致变色分子的第二无色异构形式(cl)。然而，第二无色异构形式(cl)的吸收光谱与2pap的发射光谱不重叠，并且不发生fret。因此，在这种异构形式(2pap-cl)的分子构建体中，2pap发射强烈的荧光。

15、在实施方式中，双光子吸收探针(2pap)与光致变色分子连接，使得分子构建体的fret效率为至少90％。

16、因此，双光子吸收探针(2pap)与光致变色分子连接，并且在空间上排列得足近，以诱导有效的fret过程。由此可以实现从第一非荧光构型(2pap-c)到第二荧光构型(2pap-cl)的有效fret诱导的异构化。

17、“fret效率”是经fret失活的分子数量与被激发的分子数量之间的比。

18、第一非荧光构型(2pap-c)是分子构建体的热力学稳定形式。

19、在实施方式中，光致变色分子的第二无色异构形式(cl)通过热异构化被异构化为第一有色异构形式(c)。这可被称为“逆向光致变色”。在大多数光致变色分子(光开关)中，情况正好相反；即无色异构形式是热稳定形式。

20、在“热”过程中，没有光子被吸收，并且该过程的发生不涉及光激发。反而，可用的热能足以驱动异构化反应

21、因此，分子构建体的第一非荧光构型(2pap-c)凭借光异构化(即fret诱导的光异构化)转变为第二荧光构型(2pap-cl)。第二荧光构型(2pap-cl)凭借热异构化转变为第一非荧光构型(2pap-c)。这是本技术分子构建体的重要特征。

22、在实施方式中，从第二荧光构型(2pap-cl)到第一非荧光构型(2pap-c)的异构化速率快于从第一非荧光构型(2pap-c)到第二荧光构型(2pap-cl)的异构化速率。

23、换句话说，热异构化速率k热快于双光子fret诱导的光子异构化速率k光子。这个条件允许荧光形式(2pap-cl)的浓度依赖于激发光的强度的二次方。如果不满足这个条件，则2pap-cl的饱和导致观察到常规的双光子行为。

24、如果k热大幅度地快于双光子fret诱导的光子异构化速率k光子，则荧光形式(2pap-cl)的浓度依赖于激发光的强度的二次方。这些荧光物质中的每一种的发射强度还依赖于激发光的强度的二次方。这使得发射强度与激发强度的总体四次方依赖，即i(发射)∝i(激发)4，这通常仅在四光子显微术中观察到。

25、因此，能够实现改进的空间分辨率和改进的成像技术，这允许在应用于多光子显微分析时，显著的改进。

26、在实施方式中，从第二荧光构型(2pap-cl)到第一非荧光构型(2pap-c)的异构化速率(上文称为k热)比从第一非荧光构型(2pap-c)到第二荧光构型(2pap-cl)的异构化速率(上文称为k光子)快至少2倍，优选快至少10倍，更优选快至少50倍。

27、双光子吸收探针(2pap)对两个光子的吸收触发光致变色分子的异构化，从而使第一(非荧光)构型(2pap-c)转变为第二(荧光)构型(2pap-cl)。两个光子的吸收不限于特定范围内的光吸收。然而，通常，在双光子显微术中使用波长在700nm至900nm范围内的光。

28、因此，在实施方式中，双光子吸收探针(2pap)吸收波长至少为700nm的光，优选吸收波长在700nm至900nm范围内的光。这触发了两个光子的吸收。

29、在实施方式中，双光子吸收探针(2pap)具有至少10％，优选至少30％，更优选至少50％的荧光量子产率。

30、如本文所用，术语“荧光量子产率”是通过荧光发射的光子数量与在单光子过程中吸收的光子数量的比。因此，该量子产率给出了激发态经荧光失活而不是经其他非辐射机制失活的概率。

31、在实施方式中，第一有色异构形式(c)的吸收光谱和双光子吸收探针(2pap)的发射光谱具有至少1×1013nm4m-1cm-1的光谱重叠积分。

32、优选地，光谱重叠积分尽可能高，以使荧光信号在fret反应(由双光子吸收诱导)中被猝灭。

33、这减少了2pap-c(即分子构建体的预期的非荧光构型)中的“噪声”和不期望的荧光发射。

34、在实施方式中，光致变色分子具有在室温下，小于20秒，优选小于10秒，更优选小于1秒的热半衰期(t1/2)。这是为了确保荧光形式(2pap-cl)的浓度始终保持较低，以使2pap-cl的浓度依赖于激发强度的二次方。

35、在实施方式中，有色形式(c)的光致变色分子吸收350nm至800nm，优选450nm至700nm波长区域内的光。

36、光致变色分子在这些波长区域的吸收能力允许从双光子吸收探针2pap发生有效的fret到光致变色分子的第一有色异构形式(c)，并且允许使用常规激光器作为激发源。

37、根据另一方面，提供了用于在多光子显微镜中分析靶标结构的方法，包括以下步骤：

38、a)将如上所述的分子构建体与靶标结构一起孵育，以提供荧光标记的靶标结构，

39、b)用能够被所述分子构建体双光子吸收的波长范围内的光照射所述荧光标记的靶标结构，从而产生荧光信号，和

40、c)检测和/或测量所述荧光信号。

41、待分析的靶标结构可以例如是固定的或活的细胞、组织样品、生物样品(诸如体液)和各种3d结构等。

42、分子构建体可以通过技术人员已知的方法与靶标结构一起孵育。

43、通常，用波长为至少700nm的光照射靶标结构。这使得发生双光子吸收，然后触发一系列事件，其中分子构建体成为发荧光的。此外，预计，荧光将产生与四光子显微术中观察到的空间分辨率相当的空间分辨率。

44、发射的荧光可以通过技术人员已知的方式检测和/或定量测量。因此，能够极详细地并以增强的空间分辨率来分析靶标结构的性质。

45、根据另一方面，提供了经如上所述的分子构建体标签化的抗体。

46、这样的抗体可以有效地用于检测细胞、组织或体液中的具体靶标区域。靶向具体抗原的抗体提供了有用的方法，其中本技术的分子构建体可以揭示关于具体疾病的病因学和生物学通路的重要信息。

47、优选地，抗体是单克隆抗体。

48、根据又一个方面，本技术涉及如上所述的分子构建体在多光子显微镜，例如双光子显微镜中对靶标结构成像的用途。

49、当研究所附权利要求和以下描述时，本技术的进一步特征和优点将变得明显。本领域技术人员认识到，在不脱离本技术的范围的情况下，可以组合本技术的不同特征来创建除了下面描述的实施方式以外的实施方式。