CD47特异性抗体及其用途的制作方法

本发明涉及cd47特异性抗体及其用途，更详细地，涉及与cd47特异性结合的抗体、包含上述抗体的嵌合抗原受体以及包含它们的用于预防或治疗由表达cd47的细胞介导的疾病的药物组合物。

背景技术：

1、cd47也称为整联蛋白结合蛋白(iap)，为在细胞表面广泛表达的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)。

2、cd47作为细胞表面的非常重要的标记物，分子量为47kd～55kd之间，结构包括一个氨基酸末端的细胞外可变区、一个由3个～5个高疏水性跨膜片段构成的跨膜区以及一个亲水性羧基末端细胞质尾区(cytoplasmic tail)。它与整联蛋白、sirpα(信号调节蛋白α)、sirpγ以及血小板反应蛋白(thrombospondin)等多种配体相互作用。

3、sirpα主要在包括巨噬细胞、颗粒细胞、骨髓系统树突细胞(dcs)、肥大细胞及造血干细胞(hscs)等细胞的前体在内的骨髓细胞中表达。sirpα抑制巨噬细胞对宿主细胞的吞噬作用，通过宿主靶向细胞上表达的cd47的巨噬细胞上的sirpα连接(ligation)生成由shp-1介导的抑制信号，从而将吞噬作用调节为阴性。

4、在先天免疫系统中，cd47通过与骨髓细胞中表达的sirpα的结合来发挥功能，在生理条件下，cd47广泛表达的作用在于防止健康细胞被先天免疫系统清除。

5、然而，肿瘤细胞却可以有效逃避通过cd47的过表达形成的免疫筛查。近几年来，cd47及cd47-sirpα信号系统作为肿瘤治疗中的潜在药物靶标而备受瞩目。根据现有的研究，cd47的表达在大部分人类癌症(例如非霍奇金淋巴瘤(nhl)、急性髓细胞白血病(aml)、乳腺癌、结肠癌、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌及前列腺癌)中上调，上升的cd47的表达水平被证明与侵袭性疾病和低的存活率相关。斯坦福大学的威斯曼(weissman)系统地研究了多种实体肿瘤中cd47的表达水平，结果发现cd47在所有人类实体肿瘤细胞中过表达，平均表达水平为与之对应的正常细胞的3.3倍左右。并且，发现实体肿瘤患者的cd47信使核糖核酸(mrna)的水平示出与预后指数的负相关(mark p chao etal.,front oncol.,9:1380,2020)。

6、抗cd47抗体对肿瘤的治疗涉及多种机制。首先，抗cd47抗体通过阻断肿瘤细胞上的cd47与巨噬细胞上的sirpα的结合来使肿瘤细胞吞噬。并且，抗cd47抗体可以诱导与自然杀伤(nk)细胞相关的肿瘤细胞的细胞毒性，可以通过直接诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。最后，抗cd47抗体可以激活cd8+t细胞，引起获得性t细胞免疫反应来进一步杀伤肿瘤细胞。

7、为了治疗或诊断这样的表达cd47的肿瘤细胞或与cd47的过表达相关的疾病等，开发了对cd47具有特异性的抗体，在国际公开专利第wo2018-075857号、国际公开专利第wo2017-121771号及国际公开专利第wo2013-119714号中公开了有关多种抗cd47抗体的内容。

技术实现思路

1、技术问题

2、于是，为了开发更为特异性地与cd47结合的抗体，本发明中通过筛选与cd47结合的抗体来确立了7种新型抗体(7c7、5h4、5a4、4e12、3h3、3a5、1e7)，确认到本发明中筛选的7种抗体特异性地与cd47抗原结合。并且，确认到可以利用本发明的与cd47特异性结合的抗体制备以cd47为靶向的嵌合抗原受体，从而完成本发明。

3、因此，本发明的目的在于，提供与cd47特异性结合的抗体。

4、本发明的再一目的在于，提供编码上述抗体的多核苷酸、表达上述抗体的载体、由上述载体转化的重组细胞。

5、本发明的还有一目的在于，提供包含上述抗体的嵌合抗原受体、编码靶向cd47的嵌合抗原受体的多核苷酸、包含其的载体以及包含上述多核苷酸或载体的表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞。

6、本发明的另一目的在于，提供包含上述抗体或表达靶向cd47的嵌合抗原受体免疫效应细胞的用于预防或治疗由表达cd47的细胞介导的疾病的药物组合物。

7、本发明的又一目的在于，提供包含上述抗体的用于诊断或监控由表达cd47的细胞介导的疾病的组合物。

8、技术方案

9、为了实现上述目的，提供由如下部分构成的与cd47特异性结合的抗体或其片段：(1)包含由序列1的氨基酸表示的cdr1区域、由序列2的氨基酸表示的cdr2区域及由序列3的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列4的氨基酸表示的cdr1区域、由序列5的氨基酸表示的cdr2区域及由序列6的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(2)包含由序列11的氨基酸表示的cdr1区域、由序列12的氨基酸表示的cdr2区域及由序列13的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列14的氨基酸表示的cdr1区域、由序列15的氨基酸表示的cdr2区域及由序列16的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(3)包含由序列21的氨基酸表示的cdr1区域、由序列47的氨基酸表示的cdr2区域及由序列23的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列24的氨基酸表示的cdr1区域、由序列25的氨基酸表示的cdr2区域及由序列26的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(4)包含由序列31的氨基酸表示的cdr1区域、由序列32的氨基酸表示的cdr2区域及由序列33的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列34的氨基酸表示的cdr1区域、由序列35的氨基酸表示的cdr2区域及由序列36的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(5)包含由序列41的氨基酸表示的cdr1区域、由序列42的氨基酸表示的cdr2区域及由序列43的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列44的氨基酸表示的cdr1区域、由序列45的氨基酸表示的cdr2区域及由序列46的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；(6)包含由序列51的氨基酸表示的cdr1区域、由序列52的氨基酸表示的cdr2区域及由序列53的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列54的氨基酸表示的cdr1区域、由序列55的氨基酸表示的cdr2区域及由序列56的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区；或者(7)包含由序列61的氨基酸表示的cdr1区域、由序列62的氨基酸表示的cdr2区域及由序列63的氨基酸表示的cdr3区域的重链可变区以及包含由序列64的氨基酸表示的cdr1区域、由序列65的氨基酸表示的cdr2区域及由序列66的氨基酸表示的cdr3区域的轻链可变区。

10、在本发明的一优选实施例中，上述抗体可以为单克隆抗体，优选地，可以为单链可变区片段(scfv，single-chain variable fragment)。

11、在本发明的再一优选实施例中，上述(1)抗体由以序列7的氨基酸表示的重链可变区及以序列8的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(2)抗体由以序列17的氨基酸表示的重链可变区及以序列18的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(3)抗体由以序列27的氨基酸表示的重链可变区及以序列28的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(4)抗体由以序列37的氨基酸表示的重链可变区及以序列38的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(5)抗体由以序列47的氨基酸表示的重链可变区及以序列48的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(6)抗体由以序列57的氨基酸表示的重链可变区及以序列58的氨基酸表示的轻链可变区构成，上述(7)抗体由以序列67的氨基酸表示的重链可变区及以序列68的氨基酸表示的轻链可变区构成。

12、为了实现再一目的，本发明提供编码上述与cd47特异性结合的抗体的多核苷酸。

13、并且，本发明提供包含编码上述与cd47特异性结合的抗体的多核苷酸的载体。

14、并且，本发明提供用于生产由上述载体转化的与cd47特异性结合的抗体或其片段的重组细胞。

15、为了实现还有一目的，本发明提供一种嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor：car)，包含：cd47-结合结构域；跨膜结构域(transmembrane domain)；共刺激域(costimulatory domain)；以及细胞内信号转导结构域(intracellular signaltransduction domain)，上述cd47-结合结构域可以选自本发明的可以与cd47特异性结合的抗体或其片段。

16、在本发明的一优选实施例中，上述跨膜结构域可以源自选自由cd8α、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86、cd152及pd1组成的组中的蛋白质。

17、在本发明的还有一优选实施例中，上述共刺激域可以源自选自由cd28、4-1bb、ox-40及icos组成的组中的蛋白质，上述信号转导结构域可以源自cd3ζ。

18、在本发明的另一优选实施例中，还可以包含位于上述cd47-结合结构域的c末端与跨膜结构域的n末端之间的铰链区(hinge region)，上述铰链区可以源自cd8α。

19、为了实现另一目的，本发明提供编码上述嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。

20、并且，本发明提供包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸的载体。

21、在本发明的一优选实施例中，上述载体可以为质粒(plasmid)、反转录病毒(retroviral)载体或慢病毒(lentiviral)载体。

22、并且，本发明提供包含编码上述嵌合抗原受体的多核苷酸或者包含编码嵌合抗原受体的多核苷酸且表达上述嵌合抗原受体的免疫效应细胞。

23、在本发明的一优选实施例中，上述免疫效应细胞可以为t细胞。

24、为了实现上述目的，本发明提供用于预防或治疗表达cd47的癌症或肿瘤的药物组合物，包含表达靶向cd47的嵌合抗原受体的免疫效应细胞；或者与cd47特异性结合的抗体或其片段。

25、在本发明中，上述癌症或肿瘤可以选自由血液癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨髓瘤、神经母细胞诱导的中枢神经系统(cns)肿瘤、单核细胞白血病、b细胞诱导的白血病、t细胞诱导的白血病、b细胞诱导的淋巴瘤、t细胞诱导的淋巴瘤及肥大细胞诱导的肿瘤组成的组中。

26、发明的效果

27、本发明中通过筛选更为特异性地与cd47结合的抗体来确立了7种新型抗体(7c7、5h4、5a4、4e12、3h3、3a5、1e7)，确认到上述7种新型抗体特异性地与cd47抗原结合。

28、并且，确认到可以利用上述确立的抗体制备以cd47为靶向的嵌合抗原受体(car)，本发明的对cd47具有特异性的抗体及利用其制备的嵌合抗原受体可以应用在表达cd47的癌症或肿瘤的预防和治疗中。