靶向XBP1的寡核苷酸的制作方法

本发明涉及诱导xbp1剪接变体表达的寡核苷酸。此类寡核苷酸可增强细胞中蛋白质表达的水平和/或质量，并在哺乳动物蛋白质表达系统(诸如异源蛋白质表达系统)中具有效用。寡核苷酸还具有治疗效用，包括治疗或预防蛋白质病理学疾病(proteopathological disease)。

背景技术：

1、xbp1(x-框结合蛋白1)是通过诱导参与蛋白质折叠和质量控制的基因来介导对er应激的适应性的转录因子。

2、xbp1转录本以不同的剪接形式存在，包括其表达受ire1α(肌醇需要酶1α)调节的剪接变体。在哺乳动物细胞中，ire1α在内质网(er)应激下从xbp1 mrna中切除26个核苷酸的片段以生成编码功能活性xbp1s蛋白的剪接变体。

3、切除26个核苷酸的片段导致产生+2框外事件，从而导致活性xbp1转录因子(xbp-1s)的表达。26个核苷酸的片段存在于xbp1成熟mrna的外显子4中。

4、cain等人,(biotechnol prog 2013；29(3):697-706)报道了经工程化以表达x-框结合蛋白(xbp-1s)和内质网氧化还原酶(ero1-lα)(chos-xe.chos-xe细胞)二者的中国仓鼠卵巢(cho)细胞，其提供了与chos细胞相比增加的抗体产量(5.3-6.2倍)。

5、tong等人,(neurochem.2012年十一月；123(3):406–416)报道了突变体tdp-43在转基因大鼠中的过度表达，这导致泛素显著聚集和高尔基复合体碎片丢失，然后导致神经元丢失。值得注意的是，在泛素的聚集和高尔基复合体碎片的丢失之前还有xbp1的耗尽和未折叠蛋白响应(upr)的失活。这表明在与异常蛋白质折叠相关的疾病(蛋白质病理学疾病)中需要恢复或上调xbp1介导的upr，该疾病诸如神经退行性疾病，包括tdp-43病理学，例如额颞叶变性(ftld)和als。

6、在wo 2003/89622中，公开了用于调节未折叠蛋白响应的新基因、组合物和方法。

7、在wo 2019/004939中，公开了用于调节t细胞功能的反义寡核苷酸。

8、在wo 2008/016356中，公开了与银屑病相关的人类基因的基因图。

9、发明目的

10、发明人出人意料地确定，活性xbp1剪接变体应用于蛋白质生产方法以及治疗方法中，主要涉及蛋白质病理学疾病的治疗。

11、发明人出人意料地确定，可以使用与xbp1前体mrna转录本的一部分互补(诸如完全互补)的反义寡核苷酸来生产活性xbp1剪接变体。该xpb1剪接变体可能是xbp1δ4剪接变体(外显子4缺失的xbp1剪接变体)。xbp1外显子4包含在体内被ire1α切除的26个核苷酸的片段，并且与在体内ire1α切除26个核苷酸的事件一样，外显子4的跳跃引入了+2框外事件。

12、本发明至少部分基于以下发现：重组哺乳动物细胞中xbp1δ4变体的生成或表达使得异源表达的蛋白质(诸如单克隆抗体，特别是以其他方式难以表达的异源表达的蛋白质)的表达提高。可以通过xbp1δ4变体的表达获得在哺乳动物细胞中的质量提高的蛋白质表达。

13、本发明至少部分地基于以下发现：在哺乳动物细胞中诱导xbp1δ4的生成或表达的化合物(诸如反义寡核苷酸)可用于增强异源表达的蛋白质在哺乳动物细胞中的重组表达。特别地，在哺乳动物细胞中诱导xbp1δ4的表达的化合物(诸如反义寡核苷酸)可用于增强正确折叠的异源表达的蛋白质在哺乳动物细胞中的重组表达。

14、本发明至少部分基于以下发现：在哺乳动物细胞中诱导xbp1δ4表达的反义寡核苷酸可用于治疗蛋白质病理学疾病。

技术实现思路

1、根据一个方面，本发明提供了一种用于在表达xbp1的细胞中生成或表达xbp1剪接变体的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸，并且包含长度为8个至40个核苷酸的与哺乳动物xbp1前体mrna转录本互补的连续核苷酸序列。

2、xbp1剪接变体可以是xbp1δ4变体。

3、连续核苷酸序列可以与仓鼠xbp1前体mrna转录本(seq id no 1)的至少10个连续核苷酸互补，诸如来自seq id no 1的核苷酸2960至核苷酸3113的至少10个连续核苷酸或来自seq id no 1的核苷酸2986至核苷酸3018的至少10个连续核苷酸。

4、连续核苷酸序列可以与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no 299、seqid no 301、seq id no 302、seq id no 304、seq id no 305、seq id no 306、seq id no307、seq id no 308、seq id no 309、seq id no 310、seq id no 314、seq id no 316、seqid no 317、seq id no 318、seq id no 319、seq id no 323、seq id no 325、seq id no327、seq id no 328、seq id no 330、seq id no 331、seq id no 332、seq id no 333、seqid no 334、seq id no 336、seq id no 337、seq id no 385、seq id no 386、seq id no387、seq id no 388、seq id no 390、seq id no 391、seq id no 392、seq id no 393、seqid no 394、seq id no 395、seq id no 396397、seq id no 398、seq id no 399、seq idno 401、seq id no 402、seq id no 419、seq id no 431、seq id no、seq id no 432、seqid no 433、seq id no 434、seq id no 438、seq id no 439、seq id no 440、seq id no441、seq id no 442、seq id no 449、seq id no 484、seq id no 485、seq id no 486、seqid no 487、seq id no 488、seq id no 489、seq id no 490、seq id no 491、seq id no492、seq id no 493、seq id no 494、seq id no 495、seq id no 496、seq id no 497、seqid no 498、seq id no 499、seq id no 500、seq id no 501、seq id no 502、seq id no503、seq id no 505、seq id no 506、seq id no 507、seq id no 508、seq id no 509、seqid no 510、seq id no 511、seq id no 512、seq id no513、seq id no 515、seq id no517、seq id no 520、seq id no 572、seq id no 573、seq id no 576、seq id no 577、seqid no 588和seq id no 589。

5、连续核苷酸序列可以选自由以下项组成的组：seq id no 8、seq id no 10、seqid no 11、seq id no 13、seq id no 14、seq id no 15、seq id no 16、seq id no 17、seqid no 18、seq id no 19、seq id no 23、seq id no 24、seq id no 25、seq id no 26、seqid no 27、seq id no 28、seq id no 32、seq id no 34、seq id no 36、seq id no 37、seqid no 39、seq id no 40、seq id no 41、seq id no 42、seq id no 43、seq id no 45、seqid no 46、seq id no 94、seq id no 95、seq id no 96、seq id no 97、seq id no 99、seqid no 100、seq id no 101、seq id no 102、seq id no 103、seq id no 104、seq id no105、seq id no 106、seq id no 107、seq id no 108、seq id no 110、seq id no 111、seqid no 128、seq id no 140、seq id no 141、seq id no 142、seq id no 143、seq id no147、seq id no 148、seq id no 149、seq id no 150、seq id no 151、seq id no 158、seqid no 193、seq id no 194、seq id no 195、seq id no 196、seq id no 197、seq id no198、seq id no 199、seq id no 200、seq id no 201、seq id no 202、seq id no 203、seqid no 204、seq id no 205、seq id no 206、seq id no 207、seq id no 208、seq id no209、seq id no 210、seq id no 211、seq id no 212、seq id no 214、seq id no 215、seqid no 216、seq id no 217、seq id no 218、seq id no 219、seq id no 220、seq id no221、seq id no 222、seq id no 224、seq id no 226、seq id no 229、seq id no 281、seqid no 282、seq id no 285、seq id no 286、seq id no 297和seq id no 298。

6、连续核苷酸序列可以与小鼠xbp1前体mrna转录本(seq id no 590)的至少10个连续核苷酸互补。

7、连续核苷酸序列可以与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no 699、seqid no 700、seq id no 703、seq id no 710、seq id no713、seq id no 724、seq id no729、seq id no 739、seq id no 743、seq id no 744、seq id no 745、seq id no 749、seqid no 750、seq id no 751、seq id no 752、seq id no 753、seq id no 754、seq id no755、seq id no 756、seq id no 757、seq id no 758、seq id no 759、seq id no 760、seqid no 761、seq id no 762、seq id no 763、seq id no 773、seq id no 776、seq id no778、seq id no 781、seq id no 783、seq id no 784、seq id no 785、seq id no 787、seqid no 789、seq id no 790、seq id no 791、seq id no 792、seq id no 793、seq id no794、seq id no 795、seq id no 796、seq id no 797、seq id no 798、seq id no 799和seq id no 800。

8、连续核苷酸序列可以选自由以下项组成的组：seq id no 597、seq id no 598、seq id no 601、seq id no 608、seq id no 611、seq id no 622、seq id no 627、seq idno 637、seq id no 641、seq id no 642、seq id no 643、seq id no 647、seq id no 648、seq id no 649、seq id no 650、seq id no 651、seq id no 652、seq id no 653、seq idno 654、seq id no 655、seq id no 656、seq id no 657、seq id no 658、seq id no 659、seq id no 660、seq id no 661、seq id no 671、seq id no 674、seq id no 676、seq idno 679、seq id no 681、seq id no 682、seq id no 683、seq id no 685、seq id no 687、seq id no 688、seq id no 689、seq id no 690、seq id no 691、seq id no 692、seq idno 693、seq id no 694、seq id no 695、seq id no 696、seq id no 697和seq id no697。

9、连续核苷酸序列可以与人xbp1前体mrna转录本(seq id no 801)的至少10个连续核苷酸互补。

10、连续核苷酸序列可以与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no 947、seqid no 948、seq id no 949、seq id no 950、seq id no 951和seq id no 988。

11、连续核苷酸序列可以选自由以下项组成的组：seq id no 854、seq id no 855、seq id no 856、seq id no 857、seq id no 858和seq id no 895。

12、反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以与哺乳动物xbp1前体mrna转录本完全互补。

13、连续核苷酸序列与反义寡核苷酸的长度可以相同。

14、可以分离、纯化或制造反义寡核苷酸。

15、反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以包含一个或多个经修饰的核苷酸或一个或多个经修饰的核苷。

16、反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。

17、本发明包括本发明的反义寡核苷酸的缀合物和药用盐以及包含本发明的反义寡核苷酸的组合物和药物组合物。

18、在另一方面，本发明提供了一种分离的xbp1δ4蛋白。

19、本发明的分离的xbp1δ4蛋白可包含seq id no:7、seq id no:596或seq id no807的序列。

20、在另一方面，本发明提供了编码本发明的xbp1δ4蛋白的分离的mrna。

21、本发明的分离的mrna可以包含seq id no:7、seq id no:595或seq id no:806的序列。

22、在另一方面，本发明提供了一种用于生产多肽的方法，其包括以下步骤：

23、a)培养表达xbp1以及包含编码多肽的一个或多个核酸的哺乳动物细胞；以及

24、b)从细胞或培养基中回收多肽；

25、其特征在于培养是在本发明的反义寡核苷酸、组合物、药物组合物、蛋白质或mrna的存在下。

26、在本发明中，该方法可以包括以下步骤：

27、a1)在包含根据本发明的反义寡核苷酸的培养基中，繁殖表达xbp1以及包含编码多肽的一个或多个核酸的哺乳动物细胞以获得第一细胞群；

28、a2)将第一细胞群的等分试样与任选包含反义寡核苷酸的培养基混合以获得第二细胞群；

29、a3)培养第二细胞群以获得第三细胞群；以及

30、b)从第三次细胞培养的细胞和/或培养基中回收多肽。

31、在本发明的方法中，可以添加反义寡核苷酸至终浓度为25μm或更高。

32、在本发明的方法中，可以以0.5*10e6个细胞/ml至4*10e6个细胞/ml的起始细胞密度培养产生第一细胞群的细胞。

33、在本发明的方法中，第二细胞群可具有0.5*10e6个细胞/ml至10*10e6个细胞/ml的细胞密度。

34、在本发明的方法中，哺乳动物细胞可以是cho细胞。

35、在本发明的方法中，多肽可以是抗体。

36、本发明的一个方面是一种用于重组生产多聚体多肽的方法，其包括以下步骤：

37、a)在根据本发明的核酸的存在下培养包含编码多聚体多肽的一个或多个核酸以及表达xbp1的哺乳动物细胞，该根据本发明的核酸诱导xbp1变体的形成，在一个优选的实施例中xbp1变体是xbp1δ4；和

38、b)从细胞或培养基中回收多聚体多肽。

39、本发明的另一方面是一种用于重组生产多聚体多肽的方法，其包括以下步骤：

40、a)在根据本发明的核酸的存在下培养包含编码多聚体多肽的一个或多个核酸以及表达xbp1的哺乳动物细胞，该根据本发明的核酸诱导xbp1mrna中外显子4的跳跃，由此引入+2框外事件；和

41、b)从细胞或培养基中回收多聚体多肽。

42、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，该方法包括以下步骤：

43、a1)在包含根据本发明的核酸的培养基中，繁殖表达xbp1以及包含编码多肽的一个或多个核酸的哺乳动物细胞以获得第一细胞群，该繁殖诱导xbp1变体的形成，在一个优选实施例中，xbp1变体是xbp1δ4；

44、a2)将第一细胞群的等分试样与任选包含根据本发明的相同或不同核酸的培养基混合以获得第二细胞群，该根据本发明的核酸诱导xbp1变体xbp1δ4的形成；

45、a3)培养所述第二细胞群以获得第三细胞群；以及

46、b)从第三次细胞培养的细胞和/或培养基中回收多聚体多肽。

47、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，该方法包括以下步骤：

48、a1)在包含根据本发明的核酸的培养基中，繁殖表达xbp1以及包含编码多肽的一个或多个核酸的哺乳动物细胞以获得第一细胞群，该根据本发明的核酸诱导xbp1 mrna中外显子4的跳跃，由此引入+2框外事件；

49、a2)将第一细胞群的等分试样与任选包含根据本发明的相同或不同核酸的培养基混合以获得第二细胞群，该根据本发明的核酸诱导xbp1 mrna中外显子4的跳跃，由此引入+2框外事件；

50、a3)培养所述第二细胞群以获得第三细胞群；以及

51、b)从第三次细胞培养的细胞和/或培养基中回收多聚体多肽。

52、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸是反义寡核苷酸。

53、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与仓鼠xbp1前体mrna转录本(seq id no 1)的至少10个连续核苷酸互补，诸如来自seq id no 1的核苷酸2960至核苷酸3113的至少10个连续核苷酸或来自seq id no 1的核苷酸2986至核苷酸3018的至少10个连续核苷酸。

54、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与人xbp1前体mrna转录本(seq id no 801)的至少10个连续核苷酸互补。

55、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与选自由seq id no 23或seq id no 24组成的组的序列互补。

56、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no947、seq id no 948、seq idno 949、seq id no 950、seq id no 951和seq id no 988。

57、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸选自由以下项组成的组：seq id no 854、seq id no 855、seq id no 856、seqid no 857、seq id no 858和seq id no 895。

58、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，xbp1变体包含seq id no:7、seq id no:596或seq id no 807的序列。

59、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，xbp1变体由seq id no:7、seq id no:595或seq id no:806的序列编码。

60、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，添加根据本发明的核酸至25μm或更高的终浓度。

61、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，以0.5*10e6个细胞/ml至4*10e6个细胞/ml的起始细胞密度培养产生第一细胞群的细胞。

62、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，第二细胞群具有0.5*10e6个细胞/ml至10*10e6细胞/ml的起始细胞密度。

63、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，哺乳动物细胞是cho细胞。

64、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，哺乳动物细胞是hek细胞。

65、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，哺乳动物细胞是sp2/0细胞。

66、在用于重组生产多聚体多肽的方法的所有方面和实施例的某些实施例中，多聚体多肽是抗体。在某些实施方案中，抗体为双特异性抗体。在某些实施例中，双特异性抗体是具有结构域交换的全长抗体或抗体多聚体融合体。在某些实施例中，双特异性抗体为三价双特异性抗体。在某些实施例中，双特异性三价抗体是具有结构域交换和额外的重链c末端结合位点的全长抗体或具有含结构域交换的额外的重链c末端结合位点的全长抗体或t-细胞双特异性抗体。在某些实施例中，抗体为二价或三价抗体。

67、本发明的一个方面是根据本发明的核酸用于例如在抗体诸如单克隆抗体的制造中提高由重组蛋白表达系统生产的多聚体多肽的产量或质量的用途。

68、在根据本发明的核酸的用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸是反义寡核苷酸。

69、在根据本发明的核酸的用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与仓鼠xbp1前体mrna转录本(seq id no 1)的至少10个连续核苷酸互补，诸如来自seqid no 1的核苷酸2960-3113的至少10个连续核苷酸或来自seq id no 1的核苷酸2986至核苷酸3018的至少10个连续核苷酸。

70、在根据本发明的核酸的用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与人xbp1前体mrna转录本(seq id no 801)的至少10个连续核苷酸互补。

71、在根据本发明的核酸的用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸与选自由以下项组成的组的序列互补：seq id no 947、seq id no 948、seq id no949、seq id no 950、seq id no 951和seq id no 988。

72、在根据本发明的核酸的用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸选自由以下项组成的组：seq id no 854、seq id no 855、seq id no 856、seq id no857、seq id no 858和seq id no 895。

73、本发明的另一方面是从xbp1 mrna获得的xbp1变体的用途，其中跳过外显子4并引入+2框外事件以例如在抗体诸如单克隆抗体的制造中提高重组蛋白表达系统生产的多聚体多肽的产量或质量。

74、本发明的另一方面是包含seq id no:7、seq id no:596或seq id no 807的序列的xbp1变体用于例如在抗体诸如单克隆抗体的制造中提高由重组蛋白表达系统生产的多聚体多肽的产量或质量的用途。

75、在前述用途的所有方面和实施例的某些实施例中，根据本发明的核酸以25μm或更高的终浓度使用。

76、在另一方面，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、组合物、药物组合物、蛋白质和/或分离的mrna的治疗应用。

77、在一方面，本发明提供了用于药物或治疗的本发明的反义寡核苷酸、组合物、药物组合物、蛋白质和/或分离的mrna。

78、在另一方面，本发明提供本发明的反义寡核苷酸、组合物、药物组合物、蛋白质和/或分离的mrna在制备用于治疗蛋白质病理学疾病的药物中的用途。

79、在另一方面，本发明提供了一种治疗蛋白质病理学疾病的方法，该方法包括施用本发明的反义寡核苷酸、组合物、药物组合物、蛋白质和/或分离的mrna。

80、在本发明的整个治疗应用中，蛋白质病理学疾病可以是tdp-43病理学，诸如运动神经元疾病或额颞叶变性。