RNA和DNA修饰的多路复用分析的制作方法

本公开总体上涉及对核酸(包括rna和dna)的结构或非常规(noncanonical)特征的表观转录组(epitranscriptomic)、表观遗传(epigenetic)和其它修饰的鉴定和分析。联邦资金支持条款本发明是在美国政府的支持下完成的，由美国国家人类基因组研究所(nationalhuman genome research institute)授予的授权号为1r43hg012170-01支持。美国政府拥有本发明的某些权利。序列表本申请包含以ascii格式电子提交的序列表，其全部内容通过引用并入本文。该ascii副本创建于2021年11月24日，命名为alid_001_02wo_seqlist_st25.txt，大小为40千字节。

背景技术：

1、表观遗传变化，包括核苷酸的化学改变，广泛存在于生物过程中，例如基因表达、基因沉默和对dna损伤的反应中，并起主要作用。同样，rna的化学修饰，称为表观转录组修饰，经常发生在细胞内转录期间或之后。

2、多种疾病、行为和其它健康指标与dna的表观遗传变化相关，包括几乎所有类型的癌症、认知功能障碍和呼吸、心血管、生殖、自身免疫和神经行为疾病。然而，人们对表观遗传变化在整个基因组中的分布知之甚少，特别是与健康和疾病相关的变化。虽然已知一些表观转录组修饰的功能，但许多功能是未知的，主要是由于缺乏在整个细胞rna中定位和定量这些修饰的分析方法。目前，几乎对表观转录组rna修饰的相关水平及其在细胞中的变化一无所知，因为缺乏同时分析大量这些修饰的可靠、可行的方法。

3、化学衍生化方法、分子识别(通常使用抗体，用于富集和检测)和通过逆转录测序的组合已为有限数量的dna和rna修饰提供了分析方法。然而，这些方法缺乏高灵敏度，导致一些核酸降解或碎片化，并且通常不能用于以单碱基分辨率鉴定修饰的位置。此外，这些方法不适于多路复用。现有的对常见表观转录组rna修饰进行测序的方法在检测到修饰的数量(相差超过一个数量级)和修饰位置的方面经常给出相互矛盾的结果。

4、因此，本领域需要用于鉴定、分析、定量和定位dna和rna修饰的改进的组合物和方法。这些进步将为发现健康和疾病的关键生物学调控机制以及开发新的医学治疗模式铺平道路。

技术实现思路

1、本文提供了用于鉴定和分析核酸(包括rna和dna)结构的表观转录组、表观遗传和其它化学修饰的组合物和方法。本公开提供了高度并行、灵敏、准确和高通量的方法，用于在单个分子水平上同时分析潜在的无限数量的dna和/或rna修饰。

2、在一些实施方案中，本公开提供了包含结合结构域和衔接子的核酸结合分子，其中所述结合结构域特异性结合dna或rna的非常规特征，其中所述衔接子包含对由所述结合结构域特异性结合的非常规特征独特的核酸条形码序列。

3、在一些实施方案中，本公开提供了制备核酸结合分子的方法，所述方法包括将衔接子连接至结合结构域，以形成衔接子结合结构域缀合物。

4、在一些实施方案中，本公开提供了用于分析多个靶核酸的方法，所述方法包括：将靶核酸与本文所述的核酸结合分子接触；(i)在基本上防止脱靶产生条形码编码的核酸的环境中，将核酸条形码转移至靶核酸上，以产生条形码编码的靶核酸，或(ii)产生靶核酸的条形码编码的拷贝；修饰条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝，使得非常规特征的位置可基于条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝的一级核酸序列进行鉴定；以及对条形码编码的靶核酸进行测序。

5、在一些实施方案中，本公开提供了用于检测和/或定量多个靶核酸中的两种或多种非常规特征的方法，所述方法包括：将靶核酸与至少两种核酸结合分子接触，其中每种核酸结合分子包含结合结构域和衔接子，其中每种核酸结合分子的结合结构域与dna或rna的不同的非常规特征结合，其中衔接子包含对由每种结合结构域特异性结合的非常规特征独特的核酸条形码序列；(i)在基本上防止脱靶产生条形码编码的核酸的环境中，将核酸条形码转移至靶核酸上，以产生条形码编码的靶核酸，或(ii)产生靶核酸的条形码编码的拷贝；修饰条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝，使得非常规特征的位置可基于条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝的一级核酸序列进行鉴定；以及对条形码编码的靶核酸进行测序。

6、在一些实施方案中，本公开提供了用于检测靶核酸中的非常规特征的方法，所述方法包括：将靶核酸与本文所述的核酸结合分子接触；(i)在基本上防止脱靶产生条形码编码的核酸的环境中，将核酸条形码转移至靶核酸上，以产生条形码编码的靶核酸，或(ii)产生靶核酸的条形码编码的拷贝；以及检测靶核酸或其拷贝中条形码的存在。

7、在一些实施方案中，本公开提供了以单碱基分辨率确定靶核酸中非常规特征位置的方法，所述方法包括：将靶核酸与本文所述的核酸结合分子接触；(i)在基本上防止脱靶产生条形码编码的核酸的环境中，将核酸条形码转移至靶核酸上，以产生条形码编码的靶核酸，或(ii)产生靶核酸的条形码编码的拷贝；以及检测靶核酸或其拷贝中条形码的存在；其中所述核酸结合分子包含具有以下一种或多种能力的结合结构域：在靶核酸中诱导突变，或防止聚合酶旁路并因此导致靶核酸复制过程中的截短。

8、在一些实施方案中，本公开提供包含碱基编辑酶的核酸结合分子，其中碱基编辑酶为脱氨酶。

9、本文还提供了包含与靶核酸结合的核酸结合分子的复合物。

10、本文还提供了与本文所述的核酸结合分子连接的底物。

11、本文还提供了与本文所述的核酸结合分子连接的聚合物。

12、参考以下详细描述、权利要求、实施方案、程序、化合物和/或组合物以及相关背景信息和参考文献(通过引用全部内容并入本文)，本发明的这些和其它方面将变得显而易见。

技术特征：

1.一种核酸结合分子，包含：

2.根据权利要求1所述的核酸结合分子，其中所述结合结构域包含抗体、纳米体、适体、阅读蛋白、书写蛋白、擦除蛋白、工程化大分子支架、工程化蛋白支架、或选择性共价捕获试剂、或其片段或衍生物。

3.根据权利要求2所述的核酸结合分子，其中所述阅读蛋白是nudt16或ythdc2，或其片段或衍生物。

4.根据权利要求2所述的核酸结合分子，其中所述书写蛋白是dntm1、dntm3a/b、nat10、mettl3、mettl8、mettl14、mettl16、trm、bmt、dus2、pus或nsun2，或其片段或衍生物。

5.根据权利要求2所述的核酸结合分子，其中所述擦除蛋白是fto、alkbh3或alkbh5，或其片段或衍生物。

6.根据权利要求2所述的核酸结合分子，其中所述结合结构域不具有催化活性。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的核酸结合分子，其中所述衔接子是可切割的。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸结合分子，其中所述衔接子包含通用正向引物(ufp)和通用反向引物(urp)中的至少一种。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸结合分子，其中所述衔接子包含独特分子标识符(umi)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸结合分子，其中所述非常规特征是修饰的核苷。

11.根据权利要求10所述的核酸结合分子，其中所述修饰的核苷是3-甲基胞苷(m3c)、5-甲基胞苷(m5c)、n4-乙酰胞苷(ac4c)、假尿苷(ψ)、1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)、肌苷(i)、7-甲基鸟苷(m7g)、二氢尿苷(d)、3-甲基尿苷(m3u)、5-甲基尿苷(m5u)、1-甲基鸟苷(m1g)、n2-甲基鸟苷(m2g)、5-甲基脱氧胞苷(m5dc)、n4-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷(5-hmc)、5-羟甲基脱氧胞苷(5hmdc)、5-羧基脱氧胞苷(5cadc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-甲酰脱氧胞苷(5fdc)、6-甲基脱氧腺苷、n7-甲基鸟苷(m7g)、2,7,2’-甲基鸟苷或核糖甲基化(nm)。

12.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸结合分子，其中所述非常规特征是核酸损伤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸损伤由氧化过程或与紫外光接触引起。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述核酸损伤由外源试剂形成聚化加合物或碱基烷基化引起。

15.根据权利要求12所述的核酸结合分子，其中所述损伤是8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)、一个或多个脱碱基位点、顺铂交联、苯并(a)芘二醇环氧化物(bpde)-加合物、环丁烯嘧啶二聚体(cpd)、嘧啶-嘧啶酮(6-4)光产物(6-4pp)、6-o-甲基鸟嘌呤(o6-medg)或o6-(羧甲基)-2’-脱氧鸟苷(o6-cmdg)。

16.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸结合分子，其中所述非常规特征是结构元件。

17.根据权利要求16所述的核酸结合分子，其中所述结构元件是发夹、环、z-dna结构、g-四链体、三链体、i-基序、凸起、三链体、三向接合、十字形结构、四环、核糖拉链或假结。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的核酸结合分子，其中所述结合结构域接触至少一个修饰的核苷。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的核酸结合分子，其中所述结合结构域接触修饰的核苷和与其相邻的一个或多个核苷酸。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的核酸结合分子，其中所述衔接子包含接头，所述结合结构域与所述接头连接。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的核酸结合分子，其中所述核酸结合分子另外包含酶或其催化片段或衍生物。

22.根据权利要求21所述的核酸结合分子，其中所述酶是碱基编辑酶。

23.根据权利要求22所述的核酸结合分子，其中所述碱基编辑酶是胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶。

24.根据权利要求23所述的核酸结合分子，其中所述碱基编辑酶是apobec1或apobec3a，或其催化片段或衍生物。

25.根据权利要求23所述的核酸结合分子，其中所述酶是dna或rna甲基化酶或假尿苷合酶，或其催化片段或衍生物。

26.根据权利要求21所述的核酸结合分子，其中所述酶是dna n-糖基化酶或rna n-糖基化酶。

27.根据权利要求21所述的核酸结合分子，其中所述酶是转座酶或整合酶。

28.根据权利要求21所述的核酸结合分子，其中所述酶缺乏催化活性。

29.一种缀合物，其包含结合结构域和酶或其片段，其中所述结合结构域与权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子结合。

30.根据权利要求29所述的缀合物，其中所述结合结构域和酶或其片段共价缀合。

31.根据权利要求29所述的缀合物，其中所述结合结构域和酶或其片段非共价缀合。

32.根据权利要求29-31中任一项所述的缀合物，其中所述酶是tn5转座酶。

33.根据权利要求32所述的缀合物，其中所述标签酶与蛋白a、g或l融合。

34.一种缀合物，其包含(i)权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子，还包含肽标签，和(ii)融合到蛋白标签的酶或其片段，所述蛋白标签能够与肽标签共价反应。

35.一种缀合物，其包含(i)权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子，还包含蛋白标签，和(ii)融合到肽标签的酶或其片段，所述肽标签能够与蛋白标签共价反应。

36.根据权利要求34-35中任一项所述的缀合物，其中所述肽标签是spytag。

37.根据权利要求34-36中任一项所述的缀合物，其中所述酶是脱氨酶，并且与spycatcher蛋白融合。

38.一种缀合物，其包含(i)权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子和(ii)融合到蛋白的酶或其片段，所述蛋白能够以高亲和力结合到结合结构域的特定区域。

39.根据权利要求38所述的缀合物，其中所述结合结构域是igg抗体或其片段。

40.根据权利要求39所述的缀合物，其中所述酶是融合到蛋白a、g或l的脱氨酶。

41.一种缀合物，其包含(i)权利要求1-28中任一项的所述核酸结合分子，还包含核酸标签，和(ii)融合到互补核酸标签的酶或其片段，所述互补核酸标签能够与所述核酸结合分子的核酸标签杂交。

42.一种复合物，其包含与靶核酸结合的权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子。

43.根据权利要求42的所述复合物，其中所述核酸结合分子和靶核酸共价连接。

44.一种底物，其与权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子连接。

45.根据权利要求44所述的底物，其中所述底物是微珠、芯片、平板、载玻片、培养皿或三维基质。

46.根据权利要求45所述的底物，其中所述核酸结合分子连接至底物的表面。

47.根据权利要求46所述的底物，其中所述核酸结合分子经由捕获分子间接连接至底物表面，其中捕获分子直接连接至底物。

48.根据权利要求47所述的底物，其中所述捕获分子结合所述核酸结合分子。

49.根据权利要求47所述的底物，其中所述捕获分子结合所述靶核酸。

50.根据权利要求47所述的底物，其中所述核酸结合分子结合靶核酸，所述靶核酸与捕获分子结合。

51.根据权利要求44-50中任一项所述的底物，其中所述核酸结合分子与底物表面上的第二核酸结合分子在空间上分离。

52.一种聚合物，其与权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子连接。

53.一种制备权利要求1-28中任一项所述的核酸结合分子的方法，所述方法包括将结合结构域连接至衔接子，以形成结合结构域-衔接子缀合物。

54.一种分析多种靶核酸的方法，所述方法包括：

55.根据权利要求54所述的方法，其包括在步骤(i)之前将短核酸序列附加到靶核酸的3’端以促进条形码转移。

56.根据权利要求54所述的方法，其中步骤(i)-(iii)重复至少一次。

57.根据权利要求56所述的方法，其中每次重复步骤(i)-(iii)时使用不同的核酸结合分子。

58.根据权利要求56所述的方法，其中每次重复步骤(i)-(iii)时使用相同的核酸结合分子。

59.根据权利要求21所述的方法，其中通过单链连接、夹板连接、引物延伸或双链连接将核酸条形码酶促转移至靶核酸。

60.根据权利要求59所述的方法，其中通过引物延伸将核酸条形码转移至靶核酸，其中引物延伸之前将具有通用序列的核酸连接至靶核酸的3’端。

61.根据权利要求60所述的方法，其中通过引物延伸将核酸条形码转移至靶rna，其中在引物延伸之前，用大肠杆菌聚(a)聚合酶或粟酒裂殖酵母cid1的聚(u)聚合酶，结合一种类型的核糖核苷酸和竞争性互补poly-dt、poly-da、poly-dg或poly-dc寡核苷酸，酶促地在靶核酸的3’端加尾。

62.根据权利要求54-61中任一项所述的方法，其包括在测序前扩增条形码编码的靶核酸或其拷贝。

63.根据权利要求54-61中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括dna、rna或其混合物。

64.根据权利要求54-63中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包含至少一种非常规特征。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述非常规特征是修饰的核苷。

66.根据权利要求61所述的方法，其中所述修饰的核苷是3-甲基胞苷(m3c)、5-甲基胞苷(m5c)、n4-乙酰胞苷(ac4c)、假尿苷(ψ)、1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)、肌苷(i)、7-甲基鸟苷(m7g)、二氢尿苷(d)、3-甲基尿苷(m3u)、5-甲基尿苷(m5u)、1-甲基鸟苷(m1g)、n2-甲基鸟苷(m2g)、5-甲基脱氧胞苷(m5dc)、n4-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷(5-hmc)、5-羟甲基脱氧胞苷(5hmdc)、5-羧基脱氧胞苷(5cadc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-甲酰脱氧胞苷(5fdc)、6-甲基脱氧腺苷、n7-甲基鸟苷(m7g)、2,7,2’-甲基鸟苷或核糖甲基化(nm)。

67.根据权利要求64所述的方法，其中所述非常规特征是核酸损伤。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述核酸损伤由氧化过程或与紫外光接触引起。

69.根据权利要求67所述的方法，其中所述核酸损伤由外源试剂形成聚化加合物或碱基烷基化引起。

70.根据权利要求64所述的核酸结合分子，其中所述损伤是8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)、一个或多个脱碱基位点、顺铂交联、苯并(a)芘二醇环氧化物(bpde)-加合物、环丁烯嘧啶二聚体(cpd)、嘧啶-嘧啶酮(6-4)光产物(6-4pp)、6-o-甲基鸟嘌呤(o6-medg)或o6-(羧甲基)-2’-脱氧鸟苷(o6-cmdg)。

71.根据权利要求64所述的方法，其中所述非常规特征是结构元件。

72.根据权利要求71所述的方法，其中所述结构元件是发夹、环、z-dna结构、g-四链体、三链体、i-基序、凸起、三链体、三向接合、十字形结构、四环、核糖拉链或假结。

73.根据权利要求54-72中任一项所述的方法，其中所述核酸结合分子与底物表面连接，并且在空间上与其它核酸结合分子分离，使得每个靶核酸只能接触一种靶核酸结合分子。

74.根据权利要求54-73中任一项所述的方法，其中通过将条形码或其互补序列共价连接至靶核酸的5’端或3’端，将核酸条形码转移至靶核酸。

75.根据权利要求54-73中任一项所述的方法，其中通过单链连接、夹板连接、引物延伸或双链连接将核酸条形码酶促转移至靶核酸。

76.根据权利要求54-73中任一项所述的方法，其中通过化学连接将核酸条形码转移至靶核酸。

77.根据权利要求54-76中任一项所述的方法，其中所述修饰包括将核酸结合分子经光化学或化学连接至靶核酸。

78.根据权利要求54-77中任一项所述的方法，其中所述结合结构域在促进与所述核酸靶共价反应的方向上展示化学交联部分。

79.根据权利要求54-77中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在核酸结合分子与靶核酸结合的位点处或附近编辑碱基。

80.一种检测和/或定量多个靶核酸中的两种或多种非常规特征的方法，所述方法包括：

81.根据权利要求80所述的方法，其包括在测序前扩增条形码编码的靶核酸或其拷贝。

82.根据权利要求80或81所述的方法，其中所述靶核酸包括dna、rna或其混合物。

83.根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中至少一种非常规特征是修饰的核苷。

84.根据权利要求83所述的方法，其中所述修饰的核苷是3-甲基胞苷(m3c)、5-甲基胞苷(m5c)、n4-乙酰胞苷(ac4c)、假尿苷(ψ)、1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)、肌苷(i)、7-甲基鸟苷(m7g)、二氢尿苷(d)、3-甲基尿苷(m3u)、5-甲基尿苷(m5u)、1-甲基鸟苷(m1g)、n2-甲基鸟苷(m2g)、5-甲基脱氧胞苷(m5dc)、n4-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷(5-hmc)、5-羟甲基脱氧胞苷(5hmdc)、5-羧基脱氧胞苷(5cadc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-甲酰脱氧胞苷(5fdc)、6-甲基脱氧腺苷、n7-甲基鸟苷(m7g)、2,7,2’-甲基鸟苷或核糖甲基化(nm)。

85.根据权利要求82所述的方法，其中所述非常规特征是核酸损伤。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述核酸损伤由氧化过程或与紫外光接触引起。

87.根据权利要求85所述的方法，其中所述核酸损伤由外源试剂形成聚化加合物或碱基烷基化引起。

88.根据权利要求82所述的核酸结合分子，其中所述损伤是8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)、一个或多个脱碱基位点、顺铂交联、苯并(a)芘二醇环氧化物(bpde)-加合物、环丁烯嘧啶二聚体(cpd)、嘧啶-嘧啶酮(6-4)光产物(6-4pp)、6-o-甲基鸟嘌呤(o6-medg)或o6-(羧甲基)-2’-脱氧鸟苷(o6-cmdg)。

89.根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中至少一种非常规特征是结构元件。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述结构元件是发夹、环、z-dna结构、g-四链体、三链体、i-基序、凸起、三链体、三向接合、十字形结构、四环、核糖拉链或假结。

91.根据权利要求80-90中任一项所述的方法，其中所述核酸结合分子连接至底物表面上，并且在空间上分离，使得每种靶核酸只能接触一种靶核酸结合分子。

92.根据权利要求80-91中任一项所述所述的方法，其中通过将条形码或其互补序列共价连接至靶核酸的5’端或3’端，将核酸条形码转移至靶核酸。

93.根据权利要求80-91中任一项所述的方法，其中通过单链连接、夹板连接、引物延伸或双链连接将核酸条形码酶促转移至靶核酸。

94.根据权利要求80-90中任一项所述的方法，其中通过化学连接将核酸条形码转移至靶核酸。

95.根据权利要求80-94中任一项所述的方法，其中所述修饰包括将核酸结合分子经光化学连接至靶核酸。

96.根据权利要求80-94中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在核酸结合分子与靶核酸结合的位点处或附近编辑碱基。

97.一种检测靶核酸中的非常规特征的方法，所述方法包括：

98.根据权利要求97所述的方法，其中所述非常规特征是修饰的核苷。

99.根据权利要求98所述的方法，其中所述修饰的核苷是3-甲基胞苷(m3c)、5-甲基胞苷(m5c)、n4-乙酰胞苷(ac4c)、假尿苷(ψ)、1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)、肌苷(i)、7-甲基鸟苷(m7g)、二氢尿苷(d)、3-甲基尿苷(m3u)、5-甲基尿苷(m5u)、1-甲基鸟苷(m1g)、n2-甲基鸟苷(m2g)、5-甲基脱氧胞苷(m5dc)、n4-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷(5-hmc)、5-羟甲基脱氧胞苷(5hmdc)、5-羧基脱氧胞苷(5cadc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-甲酰脱氧胞苷(5fdc)、6-甲基脱氧腺苷、n7-甲基鸟苷(m7g)、2,7,2’-甲基鸟苷或核糖甲基化(nm)。

100.根据权利要求97所述的方法，其中所述非常规特征是核酸损伤。

101.根据权利要求100所述的方法，其中所述核酸损伤由氧化过程或与紫外光接触产生。

102.根据权利要求100所述的方法，其中所述核酸损伤由外源试剂形成聚化加合物或碱基烷基化引起。

103.根据权利要求100所述的方法，其中所述损伤是8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)、一个或多个脱碱基位点、顺铂交联、苯并(a)芘二醇环氧化物(bpde)-加合物、环丁烯嘧啶二聚体(cpd)、嘧啶-嘧啶酮(6-4)光产物(6-4pp)、6-o-甲基鸟嘌呤(o6-medg)或o6-(羧甲基)-2’-脱氧鸟苷(o6-cmdg)。

104.根据权利要求100所述的方法，其中所述非常规特征是结构元件。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述结构元件是发夹、环、z-dna结构、g-四链体、三链体、i-基序、凸起、三链体、三向接合、十字形结构、四环、核糖拉链或假结。

106.根据权利要求97-105中任一项所述的方法，其中所述转移包括将条形码或其互补序列共价连接至靶核酸的5’端或3’端。

107.根据权利要求97-105中任一项所述的方法，其中通过单链连接、夹板连接、夹板延伸、模板延伸或双链连接将核酸条形码转移至靶核酸。

108.根据权利要求97-105中任一项所述的方法，其中通过化学连接将核酸条形码转移至靶核酸。

109.根据权利要求97-108中任一项所述的方法，其中步骤(i)-(iii)重复至少一次。

110.根据权利要求97-109中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括修饰条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝。

111.根据权利要求97-109中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括扩增条形码编码的靶核酸或其拷贝。

112.根据权利要求97-109中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括对条形码编码的靶核酸进行测序。

113.一种以接近或处于单碱基分辨率确定靶核酸中非常规特征的位置的方法，所述方法包括：

114.根据权利要求113所述的方法，其中防止聚合酶旁路包括将所述核酸结合分子与所述靶核酸化学或光化学连接。

115.根据权利要求113所述的方法，其中防止聚合酶旁路包括化学修饰所述结合结构域以在靶核酸复制期间诱导截短。

116.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述非常规特征是修饰的核苷。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述修饰的核苷是3-甲基胞苷(m3c)、5-甲基胞苷(m5c)、n4-乙酰胞苷(ac4c)、假尿苷(ψ)、1-甲基腺苷(m1a)、n6-甲基腺苷(m6a)、肌苷(i)、7-甲基鸟苷(m7g)、二氢尿苷(d)、3-甲基尿苷(m3u)、5-甲基尿苷(m5u)、1-甲基鸟苷(m1g)、n2-甲基鸟苷(m2g)、5-甲基脱氧胞苷(m5dc)、n4-甲基脱氧胞苷、5-羟甲基胞苷(5-hmc)、5-羟甲基脱氧胞苷(5hmdc)、5-羧基脱氧胞苷(5cadc)、5-甲酰胞苷(5fc)、5-甲酰脱氧胞苷(5fdc)、6-甲基脱氧腺苷、n7-甲基鸟苷(m7g)、2,7,2’-甲基鸟苷或核糖甲基化(nm)。

118.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述非常规特征是核酸损伤。

119.根据权利要求118所述的方法，其中所述核酸损伤由氧化过程或与紫外光接触引起。

120.根据权利要求118所述的方法，其中所述核酸损伤由外源试剂形成聚化加合物或碱基烷基化引起。

121.根据权利要求118所述的方法，其中所述损伤是8-氧代鸟嘌呤(8-oxog)、一个或多个脱碱基位点、顺铂交联、苯并(a)芘二醇环氧化物(bpde)-加合物、环丁烯嘧啶二聚体(cpd)、嘧啶-嘧啶酮(6-4)光产物(6-4pp)、6-o-甲基鸟嘌呤(o6-medg)或o6-(羧甲基)-2’-脱氧鸟苷(o6-cmdg)。

122.根据权利要求113-115中任一项所述的方法，其中所述非规范特征是结构元件。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述结构元件是发夹、环、z-dna结构、g-四链体、三链体、i-基序、凸起、三链体、三向接合、十字形结构、四环、核糖拉链或假结。

124.根据权利要求113-123中任一项所述的方法，其中所述转移包括将条形码或其互补序列共价连接至靶核酸的5’端或3’端。

125.根据权利要求113-123中任一项所述的方法，其中步骤(i)-(iii)重复至少一次。

126.根据权利要求124所述的方法，其中每次重复步骤(i)-(iii)时使用不同的核酸结合分子。

127.根据权利要求124所述的方法，其中每次重复步骤(i)-(iii)时使用相同的核酸结合分子。

128.根据权利要求113-127中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括修饰条形码编码的靶核酸或其条形码编码的拷贝。

129.根据权利要求113-127中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括扩增条形码编码的靶核酸或其拷贝。

130.根据权利要求113-127中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括对条形码编码的靶核酸进行测序。

131.根据权利要求113-127中任一项所述的方法，其中检测条形码的存在包括对核酸和核酸结合分子的衔接子进行测序。

132.根据权利要求113-131中任一项所述的方法，其中将核酸条形码转移至靶核酸包括将条形码或其互补序列共价连接至靶核酸的5’端或3’端。

技术总结
本文提供了分别用于跨转录组和基因组的RNA和DNA修饰的多路复用分析的组合物和方法。所述方法将靶核酸的非常规特征(例如，碱基修饰、主链修饰、损伤和/或结构元件)的分子识别与使用条形码将来自该识别事件的信息写入靶核酸的邻近遗传序列的步骤相结合。然后将得到的条形码编码的核酸转化成测序文库中，并通过DNA/RNA测序方法读取。该步骤揭示了条形码的序列，该条形码与靶核酸中的非常规特征相关联。本文描述的高通量分析方法允许定位靶核酸中的一个或多个修饰。该方法还允许平行鉴定数个或所有DNA/RNA修饰的性质和位置。

技术研发人员：G·施滕格尔,皇甫钰奾,J·桑托斯,B·珀斯
受保护的技术使用者：阿丽达生物科学公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15