作为支架蛋白的过氧化物还原酶家族的多聚体蛋白的制作方法

本发明涉及一种来自过氧化物还原酶(prx)家族的多聚体蛋白作为支架蛋白的用途，其特征在于一种或多种感兴趣的蛋白质连接到所述过氧化物还原酶的一种或多种单体的一个或两个n末端和c末端，所述过氧化物还原酶不具有氧化还原活性。

背景技术：

1、酶是能够加速分子的合成、修饰或分解的生物催化剂，具有在与活体相容的条件下发挥最佳作用的特定特征。它们被应用于许多领域，例如生物塑料、生物燃料或治疗分子的合成。

2、已经进行了许多研究来改变酶的催化能力。因此，基因工程的迅速发展使得能够在某些酶上引入激活突变。三维蛋白质结构分辨率和生物信息学的进步使这些突变能够以合理的方式被引导(goldenzweig等人，2016年，《分子细胞》2016年7月21日；63(2):337-346(goldenzweig et al.,2016,mol cell.2016jul 21；63(2):337-346))。

3、另一种方法涉及通过将反应物、中间体和酶组装在同一复合物中进行局部浓缩，以提高生物化学反应的效率。已经开发了允许人工组装酶的各种方法。例如，酶之间的直接融合已被用于协调白藜芦醇生物合成中两种酶的表达和定位，从而增加细胞中产物的产量(zhang等人，《美国化学会志》128:13030-13031(2006年)(zhang et al.,j.am.chem.soc.128:13030-13031(2006)))。然而，融合在一起的两种酶的结构可能会受到不利影响，从而导致酶的失活。

4、另一种方法是将酶固定在称为支架蛋白的蛋白质支持物上。支架蛋白将使一种或多种酶能够在感兴趣的底物附近局部集中，这特别适用于聚合底物的催化，或者将使属于同一代谢途径的酶能够在空间上接近，因此加速和简化小分子的合成(morais等人，2010年；horn等人，2015年)。

5、一种源自纤维素体的人工多蛋白复合物(其中酶已在特定位点处整合)已被用于改善纤维素的分解(fierobe等人，2001年，《生物化学杂志》276:21257-21261和fierobe等人，2005年，《生物化学杂志》280(16)：16325-34(fierobe et al.2001.j.biol.chem.276:21257-21261and fierobe et al.2005,j biol chem.280(16):16325-34))。还开发了利用蛋白质-蛋白质相互作用结构域的支架蛋白，以提高感兴趣的分子(如甲羟戊酸或葡糖二酸)的生产效率(dueber等人，2009年，《自然－生物技术》27:753-759(dueber etal.2009.nat.biotechnol.27:753-759))。

6、然而，仍然需要开发新的支架蛋白，其在细胞中强表达，同时在不同的环境条件下保持稳定。

7、过氧化物还原酶(prx)是存在于整个活生物体领域(kingdom)(包括极端微生物)中的蛋白质。过氧化物还原酶对高度多样化的ph、温度和盐水浓度条件具有抗性。它们获得了高稳定性，以确保其氧化还原功能，这对于细胞的持续存在是不可或缺的。它们的序列包括一个共同基序，该基序围绕对功能很重要的半胱氨酸组织。围绕该基序的序列的多样性赋予宿主生物适当的理化特性。该蛋白质家族共有基于大约20kda的单体的共同结构，该单体能够多聚化以在大多数情况下形成十聚体环或十二聚体环。由于这种特定的三维排列，prx(例如来自酿酒酵母(s.cerevisiae)的tsa1)表现出位于单体的n末端和c末端位置的浮动末端。

技术实现思路

1、本发明人已经利用了来自过氧化物还原酶家族的多聚体蛋白、来自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的tsa1蛋白或者来自激烈火球菌(pyrococcus furiosus)的过氧化物酶的特性，以开发能够在不同环境条件下使用的支架蛋白。为了抑制prx的固有氧化还原活性并仅保留prx的支持功能，已对活性半胱氨酸进行突变。本发明人已经表明，尽管感兴趣的蛋白质在prx单体的n和/或c末端位置连接，但prx的十聚体结构(decamericstructure)仍然是保守的，并且感兴趣的蛋白质的功能得以维持，使得过氧化物还原酶成为具有特定特性的支架蛋白。

2、本发明涉及一种来自过氧化物还原酶家族的多聚体蛋白作为支架蛋白的用途，其特征在于一种或多种感兴趣的蛋白质连接到所述过氧化物还原酶的一种或多种单体的一个或两个n末端和c末端，所述过氧化物还原酶不具有氧化还原活性。在一个特定的实施方式中，所述一种或多种感兴趣的蛋白质是酶，并且支架蛋白用于增强酶的催化活性，或者所述感兴趣的蛋白质是相同信号传导通路的蛋白质，并且支架蛋白用于增强信号传导的效力。

3、过氧化物还原酶优选地是来自seq id no:1的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的过氧化物还原酶tsa1，并且更特别地包含在序列seq id no:1的位置48和/或位置171处突变的半胱氨酸，优选地各自被丙氨酸或丝氨酸取代。

4、在另一个优选的实施方式中，过氧化物还原酶是来自seq id no:16的激烈火球菌(pyrococcus furiosus)的过氧化物还原酶，并且更特别地包含在序列seq id no:16的位置46和/或位置211处突变的半胱氨酸，优选地各自被丙氨酸或丝氨酸取代。

5、在一个特定的实施方式中，感兴趣的蛋白质经由连接序列融合到所述过氧化物还原酶单体的一个或两个n末端和c末端。

6、在另一个特定的实施方式中，所述过氧化物还原酶单体和感兴趣的蛋白质经由衔接子/肽配体对连接。

7、根据另一个方面，本发明涉及一种来自过氧化物还原酶家族的多聚体蛋白，其包含至少一种与一种或多种不具有氧化还原活性的过氧化物还原酶单体的一个或两个n末端和c末端连接的感兴趣的蛋白质，其特征在于所述过氧化物还原酶单体和感兴趣的蛋白经由衔接子/肽配体对连接。本发明还涉及一种来自过氧化物还原酶家族的多聚体蛋白，其包含至少两种不同的感兴趣的蛋白质，该蛋白质连接到一种或多种不具有氧化还原活性的过氧化物还原酶单体的一个或两个n末端和c末端。过氧化物还原酶优选地是来自seq id no:1的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的过氧化物还原酶tsa1，更特别地包含在序列seq id no:1的位置48和/或位置171处突变的半胱氨酸，优选地各自被丙氨酸或丝氨酸取代。

8、在另一个优选的实施方式中，过氧化物还原酶是来自seq id no:16的激烈火球菌(pyrococcus furiosus)的过氧化物还原酶，并且更特别地包含在序列seq id no:16的位置46和/或位置211处突变的半胱氨酸，优选地各自被丙氨酸或丝氨酸取代。

9、在一个优选的实施方式中，所述过氧化物还原酶单体和感兴趣的蛋白质经由衔接子(adapter)/肽配体对(peptide ligand pair)连接。

10、本发明附加地涉及一种或多种编码如上所述的多聚体蛋白的核苷酸构建体，以及一种包含所述核苷酸构建体的表达载体。本发明还涉及一种包含多聚体蛋白、一种或多种核苷酸构建体或表达载体的宿主细胞，所有这些均如上所述。