人CCR8结合剂

本发明涉及人ccr8(hccr8)结合剂。此类结合剂尤其可用于肿瘤内调节性t细胞的清除和一般的免疫疗法。

背景技术：

1、调节性t(treg)细胞是适应性免疫系统的组成部分之一，它们有助于维持对自身抗原的耐受性并预防自身免疫性疾病。然而，还发现treg细胞在多种不同癌症的肿瘤微环境中高度富集(colombo和piconese，2007；nishikawa和sakaguchi，2014；roychoudhuri等人，2015)。在肿瘤微环境中，treg细胞通过降低肿瘤相关抗原(taa)特异性t细胞免疫而有助于免疫逃逸，从而阻止有效的抗肿瘤活性。因此，treg的高肿瘤浸润性通常与癌症患者的侵入性表型及不良预后相关(shang等人，2015；plitas等人，2016)。

2、由于认识到肿瘤浸润性treg细胞的重要性及其在抑制抗肿瘤免疫中的潜在作用，人们提出了多种策略来调节肿瘤微环境中的treg细胞。多项研究证明，调节treg可提供显著的治疗益处(elpek等人，2007)。

3、然而，与treg调节相关的一个主要挑战是系统性去除或抑制treg细胞可引发自身免疫。因此，为了预防自身免疫，特异性清除肿瘤浸润性treg细胞同时保留肿瘤反应性效应t细胞和外周treg细胞(例如，循环血液treg细胞)至关重要。

4、wang等人(plosone 2012,e30793)报道了ccr8在肿瘤浸润性foxp3+t细胞上的表达增加，并且提示阻断ccr8可以导致抑制treg迁移到肿瘤中。由于ccr8在肿瘤浸润性treg上的高且相对特异性的表达，已经提示抗ccr8的中和性单克隆抗体用于在癌症治疗中调节和清除该treg群体(ep3431105 a1和wo2019/157098a1)。wo2018/181425表明，在小鼠中，中和性抗ccr8 mab能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)清除肿瘤组织中的treg细胞，从而增强肿瘤免疫。通过它们的中和活性，这些抗体抑制treg迁移到肿瘤中、逆转treg的抑制功能并清除肿瘤内treg(wo2019/157098a1)。最近，wang等人(cancer immunolimmonother 2020,https://doi.org/10.1007/s00262-020-02583-y)显示ccr8阻断可能会破坏肿瘤内treg的稳定性，使其变成脆性表型，伴随抗肿瘤免疫的再激活并增加抗pd-1治疗益处。

5、wo2007044756 a2中描述了针对人ccr8的中和性单克隆抗体，包括优选的抗体433h。ep3616720a1显示了在小鼠模型中使用抗鼠ccr8抗体的adcc依赖性treg清除增强了肿瘤免疫。然而，由于该抗体不结合人ccr8，因此不能被开发用于人类癌症治疗。与之相反，来自同一申请人的wo2020138489 a1提供了用于癌症治疗的具有抗人ccr8的adcc活性的中和性抗体。其人源化抗体结合人ccr8并中和ccl1诱导的钙内流。这表明，与人ccr8的n末端区域结合是发挥中和活性的重要因素。有意思的是，现有技术的阻断性抗ccr8抗体，例如wo2007044756 a2和ep3616720 a1，实际上都结合ccr8的n末端区域。

6、需要新的人ccr8结合剂，以便于开发新的癌症治疗方案。

技术实现思路

1、发明人现已鉴定了新的人ccr8(hccr8)结合剂。有意思的是，尽管现有技术教导与ccr8的n末端结合是抗ccr8抗体的中和活性所必需的，本发明的结合剂确实表现出阻断活性，却结合ccr8的胞外环。此外，已经发现这些结合剂与非人灵长类ccr8具有交叉反应性，从而便于在动物模型中进行体内测试。因此，发明人发现可以通过结合ccr8的胞外环而产生交叉反应性中和性结合剂。特别地，已经发现ccr8的胞外环2和3是产生人ccr8结合剂的合适靶标。因此，本发明的目的是提供与非人灵长类ccr8具有交叉反应性的阻断性hccr8结合剂。因此，在第一个实施方案中，本发明提供了一种hccr8结合剂，其中所述hccr8结合剂与非人灵长类ccr8、优选食蟹猴(macaca fascicularis)ccr8或恒河猴(macaca mulatta)ccr8具有交叉反应性。

2、优选地，hccr8结合剂结合hccr8的胞外环。优选地，hccr8结合hccr8的胞外环2。

3、在其他实施方案中，hccr8结合剂包含结合hccr8的单域抗体部分。

4、在另外的实施方案中，结合hccr8的单域抗体部分包含三个互补决定区(cdr)，即cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr3选自：(a)nararlwsvfdy(seq id no:10)的氨基酸序列；(b)naktvtrtggvitgsrieydy(seq id no:11)的氨基酸序列；(c)ysksligtsryei(seq id no:12)的氨基酸序列；(d)nvktikrtggiltgskieydy(seq id no:13)的氨基酸序列；(e)与seqid no:10、11、12或13具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及(f)与seq idno:10、11、12或13具有3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。

5、优选地，cdr1选自：(a)gfsfssfa(seq id no:1)的氨基酸序列；(b)

6、grafssyn(seq id no:2)的氨基酸序列；(c)rsiynvla(seq id no:3)的氨基酸序列；(d)rsiynvra(seq id no:4)的氨基酸序列；(e)gstfsiks(seq id no:5)的氨基酸序列；(f)与seq id no:1、2、3、4或5具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；以及(g)与seq idno:1、2、3、4或5具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列；并且cdr2选自：(a)itttgat(seq idno:6)的氨基酸序列；(b)isssgt(seq id no:7)的氨基酸序列；(c)vwssgnt(seq id no:8)的氨基酸序列；(d)itrgagi(seq id no:9)的氨基酸序列；(e)与seq id no:6、7、8或9具有至少80％氨基酸同一性的氨基酸序列；以及(f)与seq id no:6、7、8或9具有3、2、1个氨基酸差异的氨基酸序列。

7、在另外的实施方案中，单域抗体部分还包含与seq id no:14至20具有至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、还更优选至少80％、更优选至少85％序列同一性的四个框架区(fr)。

8、在另外的实施方案中，单域抗体部分包含seq id no:21或seq id no:22或seq idno:23或seq id no:24或seq id no:25的氨基酸序列。

9、在另外的实施方案中，hccr8结合剂包含结合人ccr8的单域抗体部分，并且还包含至少一个细胞毒性部分。

10、优选地，细胞毒性部分诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)、诱导抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)、诱导补体依赖性细胞毒性(cdc)、结合并激活t细胞或包含细胞毒性有效负载。

11、优选地，细胞毒性部分包含可结晶片段(fc)区部分。

12、更优选地，fc区部分经工程化例如通过无岩藻糖基化或通过包含增加adcc、cdc和/或adcp的突变以增加adcc、adcp和/或cdc活性。

13、本发明的另外的目的是提供编码hccr8结合剂的核酸。

14、本发明的另外的目的是提供hccr8结合剂，其用作药物。

15、本发明的另外的目的是提供hccr8结合剂，其用于治疗肿瘤。优选地，肿瘤选自乳腺癌、子宫体癌、肺癌、胃癌、头颈癌、鳞状细胞癌、皮肤癌、结直肠癌、肾癌和t细胞淋巴瘤。

16、优选地，施用hccr8结合剂导致肿瘤浸润性调节性t细胞(treg)的清除。

17、在其他实施方案中，治疗还包含施用检查点抑制剂。检查点抑制剂是一种阻断检查点蛋白与其伴侣蛋白结合从而激活免疫系统功能的化合物。优选地，检查点抑制剂阻断选自pd-1、pd-l1、ctla-4、tigit、tim-3、lag-3、vista、b7-1和b7-2的蛋白。更优选地，检查点抑制剂阻断pd-1或pd-l1。