一种鉴定罗汉果性别的RAPD分子标记引物、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及rapd分子标记技术，更具体地说，涉及一种鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物、试剂盒及应用。

背景技术：

1、罗汉果(siraitia grosvenorii)是我国特有的一种同时兼备了食用和药用功能的葫芦科罗汉果属植物，具有清热润肺，止咳祛痰，滑肠通便等作用。罗汉果是雌、雄异株植物，目前生产上的栽培品种需要人工授粉才能结果。其种子雌、雄杂合，种子萌芽后雄株占70-80％，雌株占20-30％。随着市场的需要，生产上急需优良的罗汉果品种。但是罗汉果雌、雄株从生长到开花期仍需要一定的时间，在开花前没有明显的差异，所以寻找与罗汉果性别相关的分子标记，无论是在生产上，还是在遗传育种上都有重要意义。

2、zl201310108992.5公开了一种鉴别罗汉果性别的scar分子标记，通过提取dna、引物设计、pcr反应和检测步骤将罗汉果雌雄区别开来。该方法首先利用随机引物p7扩增出雄株特异性条带，而在实验中以fn(雌)和fnm(雄)基因池为模板，用p7进行扩增时并没有出现任何目的条带。其次专利以罗汉果基因组为模板，用引物z1200-f1与引物z1200-r1进行扩增，雄株可扩增出特异性片段，扩增目的片段大小为648bp，而在实验中以雌、雄单株为模板，用z1200-f1与z1200-r1进行扩增时，雄株在约250bp有特异性条带，雌株在约200bp有特异性条带，但是整体的扩增效果不好，无法作为罗汉果雌雄株鉴别的有效工具。

3、专利号201811180050.7公开了一种基于特异性分子标记的罗汉果雌雄株快速鉴定的方法，该方法首先利用随机引物rp2和rp8扩增各得到一条雄株特异性片段，得到长度为1400bp左右的序列，而在实验中以fn和fnm基因池为模板，用rp2和rp8进行扩增时，rp2没有扩增到性别特异性条带，rp8并没有出现任何目的条带。其次以罗汉果基因组为模板，用引物dm3f与引物dm3r进行扩增，雄株可扩增出特异性片段，扩增目的片段大小为463bp，而在实验中以fn、fnm和lu、lum单株为模板，用dm3f与dm3r进行扩增时，并没有得到较好的结果。

4、综上所述两个专利所提到的scar引物及鉴定方法均无法扩增出雄性特异性条带，无法鉴别罗汉果性别，所以需要提供一种能扩增出雄性特异性条带的分子标记引物及鉴定方法，对罗汉果性别进行鉴别。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物。所选的rapd分子标记引物对于罗汉果雄株有高度特异性，能扩增出与雌株有明显差异的特异性条带，从而能鉴别罗汉果性别。

2、实现本发明目的之一的技术方案是：鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物，其核苷酸序列为：acagcctgct。

3、本发明的目的之二提供鉴定罗汉果性别的试剂盒。

4、具体地，提供包含鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物的试剂盒，其中，rapd分子标记引物的核苷酸序列为：acagcctgct。

5、本发明的目的之三提供上述鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物的应用。

6、具体地，提供上述鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物在制备scar引物中的应用。

7、本发明的目的之四提供利用上述鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物的鉴定罗汉果性别的方法。

8、具体地，利用上述鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物的鉴定罗汉果性别的方法，包括以下步骤：

9、(1)取罗汉果器官组织提取总dna；

10、(2)取rapd分子标记引物与所述总dna进行pcr扩增反应；

11、(3)对所述步骤(2)得到的pcr产物进行电泳，若所得电泳条带中在2400bp附近出现特异性强带，则为罗汉果雄株。

12、所述步骤(1)中，罗汉果器官包括叶、果实、花朵、根或茎。

13、所述步骤(2)中，所述pcr体系为25μl，ddh2o 17μl，罗汉果总dna 2μl，dntp 1μl，rapd分子标记引物2μl，ex taq聚合酶3μl。

14、所述步骤(2)中，所述pcr反应的条件为：95℃5min，然后95℃30sec，35℃30sec，72℃30sec，重复30次，最后72℃10min。

15、有益效果

16、1.本发明提供的罗汉果性别的rapd分子标记引物，对罗汉果雄株具有高度特异性，能扩增出与雌株有明显差异的特异性条带，可高效第区分罗汉果性别。

17、2.本发明提供的rapd分子标记引物为随机引物，没有严格的种属界限，具有广泛性和通用性且不需要预先知道基因组信息，能快速简单地实现罗汉果性别的鉴定。

18、3.本发明的rapd实验中dna用量很少，纯度要求不高，实验过程简单，工作进度快且成本较低。

技术特征：

1.鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物，其特征在于，其核苷酸序列为：acagcctgct。

2.包含权利要求1所述的鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物的试剂盒。

3.权利要求1所述的鉴定罗汉果性别的rapd分子标记引物在制备scar引物中的应用。

4.利用权利要求1所述的rapd分子标记引物鉴定罗汉果性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的rapd分子标记引物鉴定罗汉果性别的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，罗汉果器官包括叶、果实、花朵或茎。

6.根据权利要求4所述的rapd分子标记引物鉴定罗汉果性别的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，，所述pcr体系为25μl，ddh2o17μl，罗汉果总dna 2μl，dntp 1μl，rapd分子标记引物2μl，ex taq聚合酶3μl。

7.根据权利要求6所述的罗汉果性别的rapd分子标记鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述pcr反应的条件为：95℃ 5min，然后95℃ 30sec，35℃ 30sec，72℃ 30sec，重复30次，最后72℃ 10min。

技术总结
本发明公开了鉴定罗汉果性别的RAPD分子标记引物。所述RAPD分子标记引物的核苷酸序列为ACAGCCTGCT。本发明公开了包含所述的罗汉果性别的RAPD分子标记引物的试剂盒及其应用。本发明还公开了应用所述的RAPD分子标记引物鉴定罗汉果性别的方法，利用所述RAPD分子标记引物与罗汉果总DNA进行PCR扩增，电泳获得相应条带后，进行罗汉果性别鉴定。本发明提供的RAPD分子标记引物为随机引物，具有高度雄株特异性，可以高效快速将罗汉果雄株与雌株区分开来，且在鉴定试验中DNA用量很少，纯度要求不高，实验过程简单，工作进度快且成本较低。

技术研发人员：张玉华,兰玉,陈可乐,刘月,陆雨梅
受保护的技术使用者：桂林莱茵生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13