一种单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法

1.本发明涉及医疗技术领域，具体是一种单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法。


背景技术：

2.肺巨噬细胞是一种位于组织内的白细胞，源自单核细胞，它广泛分布于肺间质内，存在于细支气管的气道周围和肺泡间隔内角，有的巨噬细胞游走进入肺泡腔内，称为肺泡巨噬细胞，体积较单核细胞大，呈多形性，表面有伪足，细胞核大且不规则，胞楽内有数量不等的溶酶体及吞噬小体，从单核细胞经粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等细胞因子调控剌激分化形成到其调亡可经历个月的生存时间，这种特性也为维持肺组织结构稳定和肺内无菌环境起到了重要作用，由于copd患者的巨噬细胞，主要通过支气管肺泡灌洗法或者手术切除肺组织后获得，而患者本身肺功能较差，通过获取的数量少，同时患者手术切除肺组织通常是因为合并有其他肺部疾病如肺癌等，对患者的研究有影响，因而患者不易获得。有研究显示am和mdm巨噬颗粒能力相似，提示mdm模型可以反映的吞噬反应，同时该研究也指出在患者细胞分化过程中，巨噬细胞巨噬能力出现缺陷，mdm是作为研究copd其潜在机制的重要细胞模型等研究指出相比巨噬细胞集落刺激因子诱导的无论在细胞形态学、功能学、细胞表面受体表达方面均与其十分相似，提示诱导的可以替代作为研究呼吸系统疾病的细胞模型。copd患者的并没有出现在慢性肺部炎症的肺内，也不是从中分化而来，提示了患者循环中的单核细胞没有病原体清除功能是一个固有的缺陷，揭示了是单核细胞成熟后分化形成的巨噬细胞。
3.但是现有的巨噬细胞制备方法使用较为繁复，且结果不够稳定，有些还需要使用到一些较为特殊的设备。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.一种单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法，其制备方法步骤如下：
7.首先在无菌条件下抽取肘静脉血，接着对血液进行肝素钠抗凝剂处理，同时对血液进行稀释；
8.在无菌离心管中加入一定剂量的淋巴细胞分离液，然后用尖吸管将稀释血液轻轻铺在淋巴细胞分离液之上，淋巴细胞分离液与血液之比为1:2，注意两者之间要形成清晰界面，进行两千转二十分钟离心；
9.离心完成后离心血液按密度梯度形成四层：最上层为稀释的血浆层、中间为单个核细胞层，呈白膜状、粒细胞层、红细胞层；此时用尖吸管小心吸取白膜层至另一离心管中进行第一次pbs洗涤，接着进行一千转十分钟离心，得到分离的单个核细胞，同时进行第二次pbs洗涤；
10.将细胞重悬于完全培养基中，通过台盼蓝染色检测细胞活性，如活细胞数达到95％以上则继续下一步；
11.调整细胞密度，接种于96孔细胞培养板，置于37摄氏度5％co2浓度培养箱内培养孵育两小时，弃去未贴壁细胞，rpmi-1640洗涤获得单核细胞，置于含有百分之十的fbs的rpmi-1640完全培养基中，且加入浓度5ng/mlgm-csf进行活体外培养，每96小时进行换液培养12天得到巨噬细胞，采用台盼蓝染色检测存活率95％以上，收集细胞和上清液。
12.作为本发明进一步的方案：所述gm-csf为用于体外诱导造血细胞向巨噬细胞分化的细胞因子。
13.作为本发明再进一步的方案：所述rpmi-1640完全培养基为含有百分之十的fbs的完全培养基。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
15.1、本发明操作简便，结果稳定，且不需要特殊的设备条件，为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。从而建立了一种简单、经济、稳定的诱导单核细胞分化为巨噬细胞的方法，为以后巨噬细胞研究提供很好的模型
16.2、本发明中以gm-csf用于体外诱导造血细胞向巨噬细胞分化的细胞因子。经两次pbs洗涤去除多余成分，最终可获得大量纯化的巨噬细胞样细胞。
17.3、本发明中外周血单核细胞，在gm-csf刺激下诱导分化为巨噬细胞，具有良好的吞噬功能，并且具备巨噬细胞的形态特征，特有的生物学活性，从而解决巨噬细胞获取的问题。
附图说明
18.图1为单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法的制备流程结构示意图。
19.图2为单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法中细胞鉴定的流程结构示意图。
20.图3为单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法中培养过程的流程结构示意图。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.请参阅图1～3，本发明实施例中，一种单核细胞来源的巨噬细胞的制备方法，其制备方法步骤为：
23.首先在无菌条件下抽取肘静脉血，接着对血液进行肝素钠抗凝剂处理，同时对血液进行稀释；
24.在无菌离心管中加入一定剂量的淋巴细胞分离液，然后用尖吸管将稀释血液轻轻铺在淋巴细胞分离液之上，淋巴细胞分离液与血液之比为1:2，注意两者之间要形成清晰界面，进行两千转二十分钟离心；
25.离心完成后离心血液按密度梯度形成四层：最上层为稀释的血浆层、中间为单个核细胞层，呈白膜状、粒细胞层、红细胞层；此时用尖吸管小心吸取白膜层至另一离心管中
进行第一次pbs洗涤，接着进行一千转十分钟离心，得到分离的单个核细胞，同时进行第二次pbs洗涤；
26.将细胞重悬于完全培养基中，通过台盼蓝染色检测细胞活性，如活细胞数达到95％以上则继续下一步；
27.调整细胞密度，接种于96孔细胞培养板，置于37摄氏度5％co2浓度培养箱内培养孵育两小时，弃去未贴壁细胞，rpmi-1640洗涤获得单核细胞，置于含有百分之十的fbs的rpmi-1640完全培养基中，且加入5ng/ml浓度gm-csf进行活体外培养，每96小时进行换液培养12天得到巨噬细胞，采用台盼蓝染色检测存活率95％以上，收集细胞和上清液。
28.实施例一
29.所述gm-csf为用于体外诱导造血细胞向巨噬细胞分化的细胞因子。
30.实施例二
31.所述rpmi-1640完全培养基为含有百分之十的fbs的完全培养基。
32.实施例三
33.采用人外周血分离单核细胞(pbmc)，建立在rhgm-csf刺激下诱导体外培养人单核细胞分化为巨噬细胞的方法，获得单核细胞来源的巨噬细胞，且具有良好的吞噬功能，并且具备巨噬细胞的形态特征，特有的生物学活性。
34.本发明的工作原理是：首先在无菌条件下抽取肘静脉血，接着对血液进行肝素钠抗凝剂处理，同时对血液进行稀释；在无菌离心管中加入一定剂量的淋巴细胞分离液，然后用尖吸管将稀释血液轻轻铺在淋巴细胞分离液之上：淋巴细胞分离液与血液之比为一比二注意两者之间要形成清晰界面，进行两千转二十分钟离心；离心完成后离心血液按密度梯度形成四层：最上层为稀释的血浆层、中间为单个核细胞层，呈白膜状、粒细胞层、红细胞层；此时用尖吸管小心吸取白膜层至另一离心管中进行第一次pbs洗涤，接着进行一千转十分钟离心，得到分离的单个核细胞，同时进行第二次pbs洗涤；将细胞重悬于完全培养基中，通过台盼蓝染色检测细胞活性，如活细胞数达到要求则继续下一步；调整细胞密度，接种于孔细胞培养板孔，置于37摄氏度5％co2浓度培养箱内培养孵育两小时，弃去未贴壁细胞，rpmi-1640洗涤获得单核细胞，置于含有百分之十的fbs的rpmi-1640完全培养基中，且加入5ng/ml浓度gm-csf进行活体外培养，每96小时进行换液培养12天得到巨噬细胞，采用台盼蓝染色检测存活率95％以上，收集细胞和上清液。
35.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
36.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。