单胺氧化酶的突变体及其在制备巴洛西韦中的应用的制作方法

本申请涉及酶工程及生物制药领域，具体涉及一种单胺氧化酶的突变体及其在制备巴洛西韦中的应用。

背景技术：

1、巴洛西韦(boceprevir)是首个用于治疗慢性丙型肝炎病毒(hepatitis c virus,hcv)感染的口服药物，其被建议作为peg-干扰素和利巴韦林治疗hcv基因型1患者的标准方案的补充治疗方案。巴洛西韦属于一种hcv蛋白酶ns3抑制剂，具体表现为：巴洛西韦包含一个酮酰胺基，其与ns3能够结合形成一个共价可逆的加合物，从而抑制ns3活性，减弱ns3对hcv成熟的促进作用。iii期临床试验结果显示，对受试者施用有效量的巴洛西韦能够将持续病毒应答水平提升2.3倍以上，标志着治疗丙肝病毒感染的重大进展。

2、巴洛西韦的关键结构特征是手性二甲基环丙基脯氨酸类似物，即如下式(ⅰ)所示的p2片段：

3、

4、酶不对称合成法是已知合成p2片段的方法之一，酶不对称合成法的关键步骤在于：在单胺氧化酶的催化作用下，利用氧化剂将前手性胺底物(例如6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷)氧化形成亚胺，从而拆分和去除外消旋手性胺。但是，现有的酶不对称合成法仍存在缺陷：(1)由于现有的野生单胺氧化酶活性较低，所以反应体系中需加入大量酶液，使得反应结束后大量的游离蛋白质残存于反应体系中，不利于产物的分离纯化，并且提高了生产成本；(2)单胺氧化酶催化前手性胺底物氧化形成亚胺的反应通常在水中进行，而单胺氧化酶的生物催化活性具有高度的对映选择性，单胺氧化酶在水中具有稳定性较差的问题。

5、因此，研发一种新型单胺氧化酶对提高巴洛西韦的产率和降低巴洛西韦的生产成本具有重要意义。

技术实现思路

1、本申请提供了一种单胺氧化酶的突变体及其在制备巴洛西韦中的应用，以改善现有技术中采用单胺氧化酶合成巴洛西韦的中间体所存在的酶活低和酶稳定性差的问题。

2、第一方面，本申请提供了单胺氧化酶的突变体，所述突变体是具有如seq id no：1所示氨基酸序列的单胺氧化酶发生部分位点突变而形成的，所述部分位点为：e145、i246、y188、e348或l314中的至少一种；所述突变体具有单胺氧化酶活性。

3、进一步地，所述部分位点的突变选自：e145v、i246n、y188g、e348h或l314q中的至少一种。

4、进一步地，所述突变体相对于氨基酸序列为seq id no：1的单胺氧化酶存在以下任意一种突变：

5、(1)e145v；

6、(2)i246n；

7、(3)y188g；

8、(4)e348h；

9、(5)e145v和i246n；

10、(6)y188g和e348h；

11、(7)e145v、y188g和e348h；

12、(8)e145v、i246n、y188g和e348h；或

13、(9)e145v、i246n、y188g、l314q和e348h。

14、进一步地，所述突变体的氨基酸序列选自如seq id no：3、seq id no：5、seq idno：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17或seq idno：19任一所示的氨基酸序列。

15、第二方面，本申请提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括用于编码如第一方面中任意一种所述的突变体的核苷酸序列。

16、进一步地，所述核苷酸序列选自如seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seqid no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18或seq id no：20任一所示的核苷酸序列。

17、第三方面，本申请提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括载体，以及如第二方面中任意一种所述的核酸分子；所述载体选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

18、第四方面，本申请提供了一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包括宿主，以及引入至所述宿主体内的如第二方面中任意一种所述的核酸分子或如第三方面中任意一种所述的重组表达载体；所述宿主选自真核生物或原核生物。

19、第五方面，本申请提供了一种单胺氧化酶的突变体的制备方法，通过培养如第四方面中任意一种所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得所述的突变体。

20、第六方面，本申请提供了一种如第一方面中任意一种所述的突变体、或如第五方面中任意一种所述的制备方法制得的单胺氧化酶的突变体在制备巴洛西韦中的应用，在如第一方面中任意一种所述的突变体、或如第五方面中任意一种所述的制备方法制得的单胺氧化酶的突变体的催化作用下，底物6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷、氧化剂以及亚硫酸氢盐接触反应生成巴洛西韦中间体(1s,5s)6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-磺酸盐。

21、本申请提供了一种单胺氧化酶的突变体及其在制备巴洛西韦中的应用，具有如下技术效果：

22、本申请中单胺氧化酶的突变体是在如seq id no：1所示氨基酸序列的单胺氧化酶的基础上发生部分位点突变而形成的，所述突变体能够高效催化底物6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷、氧化剂以及亚硫酸氢盐接触发生不对称氧化-加成反应，生成巴洛西韦中间体(1s,5s)6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-磺酸盐，底物转化率可达99.99％。

23、相较于具有如seq id no：23所示氨基酸序列的单胺氧化酶，本申请中单胺氧化酶的突变体具有稳定性理想、底物催化率高的优点，本申请中单胺氧化酶的突变体在不同的底物浓度下(例如9％至20％)对底物的转化率变化幅度极小，均约为99％。

24、将本申请的单胺氧化酶的突变体应用于巴洛西韦的制备工艺中有利于降低生产成本，并简化产物的分离纯化工序，提高产物得率。

技术特征：

1.一种单胺氧化酶的突变体，其特征在于，所述突变体是具有如seq id no：1所示氨基酸序列的单胺氧化酶发生部分位点突变而形成的，所述部分位点为：e145、i246、y188、e348或l314中的至少一种；所述突变体具有单胺氧化酶活性。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述部分位点的突变选自：e145v、i246n、y188g、e348h或l314q中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体相对于氨基酸序列为seq idno：1的单胺氧化酶存在以下任意一种突变：

4.根据权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列选自如seq idno：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：11、seq id no：13、seq id no：15、seq id no：17或seq id no：19任一所示的氨基酸序列。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括用于编码如权利要求1至4任一项中所述的突变体的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列选自如seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：12、seq id no：14、seq id no：16、seq id no：18或seq id no：20任一所示的核苷酸序列。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括载体，以及如权利要求5或6所述的核酸分子；所述载体选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。

8.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包括宿主，以及引入至所述宿主体内的如权利要求5或6所述的核酸分子、或如权利要求7所述的重组表达载体；所述宿主选自真核生物或原核生物。

9.一种单胺氧化酶的突变体的制备方法，其特征在于，通过培养如权利要求8所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得所述的突变体。

10.一种如权利要求1至4任一项中所述的突变体、或如权利要求9所述的制备方法制得的单胺氧化酶的突变体在制备巴洛西韦中的应用，其特征在于，在如权利要求1至4任一项中所述的突变体、或如权利要求9所述的制备方法制得的单胺氧化酶的突变体的催化作用下，底物6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷、氧化剂以及亚硫酸氢盐接触反应生成巴洛西韦中间体(1s,5s)6,6-二甲基-3-氮杂二环[3.1.0]己烷-2-磺酸盐。

技术总结
本申请公开了一种单胺氧化酶的突变体及其在制备巴洛西韦中的应用，所述突变体是具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的单胺氧化酶发生部分位点突变而形成的，所述部分位点为：E145、I246、Y188、E348或L314中的至少一种，所述突变体具有单胺氧化酶活性，所述突变体能够高效催化底物6,6‑二甲基‑3‑氮杂二环[3.1.0]己烷、氧化剂以及亚硫酸氢盐接触发生不对称氧化‑加成反应，生成巴洛西韦中间体(1S,5S)6,6‑二甲基‑3‑氮杂二环[3.1.0]己烷‑2‑磺酸盐，底物转化率可达99.99％，将所述突变体应用于巴洛西韦的制备工艺中有利于降低生产成本，提高产物得率。

技术研发人员：赖敦岳,雷军林,劳淑华,何龙丹
受保护的技术使用者：台州酶易生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13