一种异基因造血干细胞移植小鼠实验模型的建立方法与流程

文档序号:30705528发布日期:2022-07-09 22:47阅读:504来源:国知局
1.本发明属于动物实验模型的构建
技术领域
:,尤其涉及一种异基因造血干细胞移植小鼠实验模型的建立方法。
背景技术
::2.异基因造血干细胞移植是治疗恶性血液病如白血病、淋巴瘤的有效治疗手段,移植后患者将会面临长期的免疫缺陷,易受机会性感染引起较高风险的死亡率。移植后造血重建及nk细胞数量重建速率较快,数周内就基本恢复正常的造血功能,但t和b淋巴细胞数量及功能的完全重建需要数月至数年。免疫系统的恢复,特别是较低数量的淋巴细胞亚群与移植后较低的全面存活率密切相关。因此,加快骨髓移植后免疫系统重建速率,缩短免疫重建时间,对全面提高移植成功率意义重大。为深入研究骨髓移植后造血和免疫重建的机理,建立小鼠实验动物模型具有非常重要的必要性。3.且异基因造血干细胞移植动物模型的成功建立是后续研究的基础。模型建立成功与否受多种因素影响,其中主要包括移植异体造血干细胞数量、清髓辐照剂量、饲养环境、营养状况、供受体配型等,针对小鼠而言移植细胞数量和清髓辐照剂量是影响建模的关键条件,只有条件恰当才能确保小鼠在移植后正常存活,以满足实验要求。移植后保证小鼠状态良好和正常摄食是建模成功的标志,移植后小鼠状态可通过体貌体征观察、体重检测、运动状况等反应,良好的摄食是确保小鼠能量和营养正常供应的基础。清髓辐照处理导致小鼠机体受损,免疫系统瓦解,所以移植后小鼠在重建造血及免疫系统的同时,还需要修复受损的组织和器官。辐照剂量过大会导致小鼠在移植后不能良好的重建造血和免疫系统,并伴随着机体损伤严重,致使小鼠死亡率大大提高,辐照剂量过低不能达到完全清髓的目的,导致移植物不能在受鼠体内完全定植。因此,合适的辐照剂量在满足完全清髓的条件下,还需要考虑小鼠的耐受力以确保小鼠在移植后长期存活。另外,不同品系的小鼠对辐照的耐受剂量也不相同。移植造血干细胞数量的高低也同样决定移植成功率,在临床中移植造血干细胞的数量相对比较明确,但在小鼠上不同的研究差异较大。因此,需要一种异基因造血干细胞移植小鼠实验模型的建立方法。技术实现要素:4.本发明提供一种通过生存状况、体貌体征及运动状态观察,流式细胞术和组织病理切片等方法评估模型建立状况,筛选最优的建模方案的异基因造血干细胞移植小鼠实验模型的建立方法。5.本发明包括以下步骤:6.a选择近交系c57bl/6和balb/c小鼠分别作为异基因造血干细胞移植的供鼠和受鼠;7.b对所述供鼠进行骨髓单个核细胞采集后进行预处理,对所述受鼠的进行辐照预处理;8.c对所述受鼠辐照后进行所述骨髓单个核细胞移植,设置小鼠辐照剂量为8.0gy辐照,移植细胞数量梯度为5.0×106个供体造血干细胞输注作为建模条件,;9.d饲养并选择表现出异基因造血干细胞移植症状的小鼠作为异基因造血干细胞移植小鼠实验模型。10.进一步地,所述受鼠的预处理的方法为受鼠照射前7天开始饮用加庆大霉素320mg/l灭菌饮用水,将小鼠置于接受全身照射,所述受鼠分别接受8gyγ射线单次全身照射分两次辐照,每次4gy,相隔4h,剂量率为0.89gy/min,tbi后立即补充饮水,辐照4-6h后,移植组小鼠尾静脉输注规定数量的骨髓单个核细胞。11.进一步地,,所述骨髓单个核细胞采集后进行预处理的方法包括a采集供鼠骨髓细胞后放置培养基进行进一步培养,所述培养基配方rpmi-1640、2%胎牛血清以及1%双抗青霉素和链霉素得到骨髓细胞悬液;12.b将所述骨髓细胞悬液以1:1比例缓加入到淋巴细胞分离液表面,通过水平离心器4℃下1600转速离心15min,液体分层后采集单个核细胞。13.进一步地,所述供鼠为6-8周龄的spf级雄性c57bl/6j小鼠,体重为21-23g。14.进一步地,,所述受鼠为6-8周龄的spf级雄性balb/c小鼠,体重21-23g。15.进一步地,在步骤d中移植后每天更换含庆大霉素320mg/l灭菌饮用水并保持无菌环境。16.进一步地,利用流式细胞术测定各组小鼠每周外周血淋巴细胞亚群的含量参数,评价免疫重建状况,所述含量参数包括cd3+、cd3+cd4+、cd3+cd8+、b220+、nk1.1+、cd4+cd25+foxp3+。17.本发明的有益效果为:18.本发明选择近交系c57bl/6和balb/c小鼠分别作为异基因造血干细胞移植的供受者,设置建模条件,通过生存状况、体貌体征及运动状态观察,流式细胞术和组织病理切片等方法评估模型建立状况,筛选最优的建模方案。附图说明19.图1为本发明的移植后14、21天各组小鼠外周血供体嵌合率示意图;20.图2为发明的移植后14、21天各组小鼠外周血供体h-2kb、h-2kd表达情况流式细胞图;具体实施方式21.以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。22.如图1所示,在本实施例子中包括以下步骤:23.1、实验动物24.供鼠为6-8周龄的spf级雄性c57bl/6j小鼠(h-2kb),体重21-23g;受鼠为6-8周龄的spf级雄性balb/c(h-2kd)小鼠,体重21-23g。25.2、实验分组26.为了确定最佳照射剂量和细胞输注数量,分别包括7.5gy和8.0gy两个照射剂量及5.0×106和2.0×107个造血干细胞输注。具体分组如下:分别是正常组(con)6只、照射不移植组(rnt)12只(7.5g、8.0gy各6只)、照射移植组包括rltl(7.5gy+5.0×106),rlth(7.5gy+2.0×107),rhtl(8.0gy+5.0×106),rhth(8.0gy+2.0×107),各组分别15只小鼠。27.3、骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,bmncs)的制备28.腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠(0.6ml/鼠),将其放入75%的酒精中进行消毒数分钟。29.(1)事先准备好已灭菌的剪刀和镊子,剪刀除去皮毛,取下小鼠后腿,剔除所有肌肉组织后,不可剪坏骨头,要保证其完整性,将其放入含有生理盐水的试管中浸泡,等待骨髓细胞分离。30.(2)将试管转移至细胞房,将骨头取出,放入无菌培养皿中,加入适量培养液浸泡。用骨钳将股骨及胫骨两端剪开,用事先配置好的培养基冲洗骨髓腔,直到骨髓腔发白。31.培养基配置:rpmi-1640+2%胎牛血清+1%双抗(青霉素+链霉素)32.(3)充分吹打骨髓细胞悬液后,以1:1比例缓慢贴壁加入到淋巴细胞分离液表面,水平离心器4℃离心(1600,15min),随后液体分层,中间白膜层为单个核细胞。33.(4)将白膜层液体转移至另外一无菌离心管中,加入白膜层5倍体积的pbs溶液,充分混匀,水平离心器4℃离心(1600r,10min)pbs洗涤2次,调整细胞浓度并及计数。34.4、受鼠balb/c(h-2kd)移植前预处理35.受鼠照射前7天开始饮用加庆大霉素320mg/l灭菌饮用水,直至实验结束。将小鼠置于有机玻璃盒中接受全身照射。照射组小鼠分别接受8gy或7.5gyγ射线单次全身照射分两次辐照,每次4gy,相隔4h)或(第一次4gy,第二次3.5gy,相隔4h)剂量率为0.89gy/min。tbi后立即补充饮水。辐照4-6h后,移植组小鼠尾静脉输注规定数量的骨髓单个核细胞。36.5、异基因造血干细胞移植37.受鼠balb/c(h-2kd)随机分为三大组,分别是正常组、照射不移植组、照射移植组。正常组即不做任何处理组,6只;照射不移植组包括7.5gy及8.0gy两小组,每组6只,共12只。照射移植组又分为4小组(7.5gy+5.0×106,8.0gy+5.0×106,7.5gy+2.0×107,8.0gy+2.0×107,每组15只,共60只)。分组后,照射移植组小鼠进行异基因造血干细胞移植,固定小鼠,先用酒精进行全尾消毒,然后用热毛巾热敷鼠尾(更利于细胞进入血管),在此消毒后进行注射细胞。38.6、移植后小鼠饲养39.移植后每天更换含庆大霉素320mg/l灭菌饮用水,并进行彻底消毒。每周更换两次垫料并经常进行鼠房消毒,由于移植后小鼠体制较弱,移植后的第一周将小鼠饲料泡软放入培养皿中,然后放在鼠笼内使得小鼠容易采食。每天自己观察各组小鼠精神状态并做好记录。40.模型评价41.7.1移植后小鼠一般状况及移植物抗宿主病(gvhd)临床表现观察42.观察移植后小鼠生存情况,体重改变,精神状态,进食,活动度,腹泻现象。43.注意事项:1.每天要紧密观察小鼠的生存情况,发现濒死小鼠要及时汇报,采血,取材,及时检测。2.由于照射后小鼠身体虚弱,所以将柔软食物放至笼内喂养。44.观察并记录gvhd指标评分,评分标准如表所示:45.异基因造血干细胞移植后小鼠急性gvhd临床积分评分标准表46.指标0分1分2分体重减轻<10%>10%至<25%>25%姿势正常休息时弓背明显严重弓背姿势,活动受限活动度正常轻到中度活动度下降给予刺激时才活动体毛质地正常轻到中度耸毛严重耸毛皮肤完整性正常爪部或尾部皮损大面积皮损47.7.2移植后小鼠肝脏、脾脏、小肠、皮肤组织病理学检查48.对移植后濒死小鼠及28d良好存活的小鼠,处死后取其皮肤、肝脏、肠道及脾脏4%多聚甲醛固定后制作病理切片,再次判断小鼠gvhd发生情况及小鼠机体病理状态。49.评价指标:gvhd病理学改变如下:(1)皮肤:皮肤基底层细胞变性坏死,大量淋巴细胞浸润。(2)肝脏:肝脏叶间胆小管部位出现变性坏死、汇管区淋巴细胞浸润。(3)肠道:肠道隐窝腺体扩张、上皮细胞变性坏死、淋巴细胞浸润。(4)脾脏结构分界不清,部分脾小结凝固性坏死,可见中性粒细胞浸润,见少量巨核细胞等。50.7.3供者骨髓造血干细胞植入状态评价51.供、受鼠mhc1类抗原分子不同,c57bl/6表达h-2kb,balb/c表达h-2kd。受鼠balb/c小鼠移植前骨髓细胞表达h-2kd,若供鼠c57bl/6小鼠骨髓细胞成功植入,则受鼠骨髓细胞表达h-2kb。52.评价指标:53.1、h-2kb阳性率>90%定义为完全植入;2、h-2kb阳性率<20%定义为移植失败;3、20至90%为混合植入。54.植入检测:55.移植后21天,处死小鼠,采集小鼠外周血标本20ul,使用流式细胞仪(fcm)检测供体嵌合率。测试管加入percp-cy5.5-h-2kb及fitc-h-2kd单抗,对照管加入percp-cy5.5-ig及fitc-ig同型单抗,4℃避光反应30min,之后加入溶血素破红室温避光反应20min,pbs缓冲液1ml洗涤2次,用适量的pbs重悬,上机检测。56.7.4造血及免疫系统重建状况评价57.经过辐照并移植的小鼠每周內眦取血后,利用血细胞计数仪测定外周血各类血细胞数量,评价各组小鼠外周血血细胞变化情况。58.利用流式细胞术测定各组小鼠每周外周血淋巴细胞亚群的含量,评价免疫重建状况,主要包括cd3+、cd3+cd4+、cd3+cd8+、b220+、nk1.1+、cd4+cd25+foxp3+。59.为进一步了解t细胞真实的重建状况,对外周血t细胞受体重排删除环(trec)进行rt-qpcr定量检测,评价各组小鼠近期胸腺输出功能的状况,以反映真实的t细胞重建状况。60.7.5各组小鼠死因和最佳实验条件判断61.对观察到的濒死小鼠及时取血,测定其外周血白细胞计数,如果白细胞计数小于0.5×109/l,则表明死亡小鼠死于造血枯竭。对于照射移植组小鼠而言,反映了造血干细胞移植的失败;针对照射不移植组而言,反应了8.0gy和7.5gy的辐照剂量强度,能够使得小鼠在不接受造血干细胞移植后全部死亡,则是最佳的辐照剂量。62.7.6建模结果及参数确定63.为了确定最佳照射剂量和细胞输注数量,本实验设置两个辐照剂量和细胞输注剂量,包括7.5gy和8.0gy两个照射剂量及5.0×106和2.0×107两个造血干细胞输注数量。分别按照相应的剂量进行实验,所有处理均在同一时间段内完成。具体分组如下:照射不移植(rnt)12只(7.5g、8.0gy各6只)、照射移植组包括rltl(7.5gy+5.0×106),rlth(7.5gy+2.0×107),rhtl(8.0gy+5.0×106),rhth(8.0gy+2.0×ꢀ107),各组分别15只小鼠,具体如表2.1。64.表1实验分组及处理65.tablelgroupingandtreatment[0066][0067]注:r:radiation,t:transplantation,l:low,h:high,n:no;n≥6[0068]移植后14天内照射未移植组(rhnt,rlnt)小鼠全部死亡,提示8.0gy和7.5gy两个辐照剂量均属于致死性辐照,能够达到清髓的目的。在照射移植组中,rhtl组小鼠存活率最高,只有1只小鼠死亡其他均长期存活,rhth、rlth、rltl组小鼠死亡数量分别为4、3、4只。所有死亡小鼠死亡前外周血白细胞计数均小于0.5×109/l,小鼠均死于辐照清髓引起的造血枯竭。rhnt、rlnt组体重一直下降直至死亡,移植组小鼠在移植后7天内体重下降、摄食减少、精神状态衰退,7天后大部分小鼠体重逐渐回升、精神状态逐渐好转、摄食量增加。移植小鼠无皮肤破损、严重弓背和脱毛、腹泻等明显的gvhd现象,部分小鼠有轻微的耸毛和弓背现象但gvhd总体评分较低。移植后21天,各组小鼠无死亡现象出现,体重基本恢复至移植前体重。[0069]为了了解供体造血干细胞植入状况,移植后21天取各组小鼠外周血,流式细胞术分析h-2kd及h-2kb表达情况,移植后14drhth、rhtl组小鼠h-2kb阳性率分别为90.3%和91.7%,显著高于rltl组(p《0.05)。rlth、rltl组小鼠h-2kb阳性率分别是86.3%及81.7%;移植后21天各组小鼠h-2kb阳性率均达到90%。根据上述评价体系,rhtl、rhth组小鼠在移植后14天供体造血干细胞已经达到完全植入状态,而rlth、rltl组小鼠属于混合植入状态。因此,rhtl、rhth组小鼠的移植处理方案是较好的候选建模方案。结合各组死亡状况,rhtl组的处理方案即8.0gy辐照和5.0×106个供体造血干细胞输注是最优的移植方案。[0070]通过上述建模体系,比较rltl(7.5gy+5.0×106),rlth(7.5gy+2.0×107),rhtl(8.0gy+5.0×106),rhth(8.0gy+2.0×107)组小鼠生存状况。最终确定最优的辐照剂量和细胞输注数量的移植方案。本实验最优的移植方案是8.0gy辐照和5.0×106个bmncs输注。[0071]本实验选择近交系c57bl/6和balb/c小鼠分别作为异基因造血干细胞移植的供受者,设置两个辐照剂量(7.5gy,8.0gy)和两个移植细胞数量梯度(5.0×106,2×107)进行建模条件摸索。通过生存状况、体貌体征及运动状态观察,流式细胞术和组织病理切片等方法评估模型建立状况,筛选最优的建模方案。[0072]以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本
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