融合酶的制备方法及融合酶

1.本发明涉及融合酶构建及发酵技术领域，特别涉及一种融合酶的制备方法。同时，本发明也涉及一种融合酶。


背景技术：

2.惰性碳氢键的选择性单加氧反应是有机合成的主要挑战之一，目前，主要采用化学法和酶法催化，化学催化法往往反应条件苛刻，而酶催化法相对温和。血红素依赖性加氧酶是常用的选择性氧官能化催化剂之一，其中非特异性过氧化酶(unspecific peroxygenase，简称upo)由于电子传递过程简单及经济效益高，已成为催化单加氧反应的高效催化剂。upo来源广泛，其中来自茶树菇(agrocybe aegerita)的非特异性过氧化酶(aaeupo)是一种糖基化(20％-40％)的胞外酶，等电点介于5.2和6.2之间，以h2o2作为共底物，能够催化多种有机化合物的单加氧反应，因其催化活性高、底物谱广且可异源表达而受到广泛关注。
3.在aaeupo的应用中，由于其表达量较低、底物难溶于水；因此，为了提高产物的产率及酶的催化效率，必须提高aaeupo的表达量以及在有机溶剂中的耐受性及稳定性。现有的技术手段是通过对酶分子进行改造，以期提高融合酶的表达量，获取不同功能的融合酶。但是，在现有的技术实践中，缺乏切实可行且行之有效的融合酶的制备和提纯方案；而且，现有的制备方法所获取的酶的催化活性不高，制备过程中反应催化效率也较低。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在提出一种融合酶的制备方法，以便于实现不同功能的融合酶的分离纯化。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.一种融合酶的制备方法，该制备方法包括：
7.构建融合酶质粒；提取融合酶质粒，并将其转入到毕赤酵母中，进行发酵表达；利用毕赤酵母制备粗酶液，并进行融合酶的分离纯化。
8.进一步的，所述构建融合酶质粒包括以下步骤：
9.a1.构建6
×
his-sumo-jawa、6
×
his-sumo-solo、6
×
his-sumo-wampa的融合表达基因；
10.a2.利用限制性内切酶bamhⅰ和notⅰ将融合酶基因序列连接到e.coli dh5α载体上，构建出重组质粒。
11.进一步的，所述提取融合酶质粒为从大肠杆菌中提取，并包括以下步骤：
12.b1.将融合酶质粒从大肠杆菌中提取出来；
13.b2.用sal i内切酶将环形质粒切开；
14.b3.利用dna电泳判断线性化质粒的条带位置；
15.b4.将线性化质粒进行纯化浓缩。
16.进一步的，所述利用毕赤酵母制备粗酶液包括以下步骤：
17.f1.将菌株进行平板活化，并进行过夜培养，再接入新鲜bmgy培养基中，待od
600
达到1.8～2.5时，加入bmmy进行诱导培养；
18.f2.对bmgy培养基进行离心洗涤，收集上清液，即为粗酶液，并于3～5℃条件下存储。
19.进一步的，在步骤f1中，对阳性菌进行诱导表达的时间为144～146h。
20.进一步的，所述进行融合酶的分离纯化的过程中，利用组氨酸标签与镍柱的特异性结合进行分离纯化。
21.进一步的，所述将融合酶质粒转入到毕赤酵母中进行发酵表达包括以下步骤：
22.c.制备毕赤酵母感受态细胞；
23.d.将融合酶质粒电转进入感受态毕赤酵母细胞；
24.e.提取毕赤酵母中的质粒，并验证质粒的转导情况；
25.进一步的，在步骤c中，包括以下步骤：
26.c1.用ypd培养基，从甘油菌接种，对毕赤酵母细胞进行活化；
27.c2.将活化的毕赤酵母细胞重新接种到新的ypd培养基中，等od
600
值达到1.2～1.5时，进行离心；
28.c3.将离心后静置获得的沉淀物用预冷的无菌水吹打混匀，再次离心；
29.c4.用预冷的山梨醇与步骤c3获得的沉淀物混匀，而形成毕赤酵母感受态细胞；
30.且步骤c3重复进行2～4次。
31.进一步的，在步骤e中，采用pcr技术复制从毕赤酵母中提取的质粒，并利于dna电泳验证质粒的转导情况。
32.相对于现有技术，本发明的融合酶的制备方法具有以下技术优势：
33.通过构建融合酶的质粒，可提升融合酶的表达量，利用毕赤酵母对质粒进行发酵表达和复制，从而可有效提高融合酶的数量；用制备形成的粗酶液通过离心等方式进行分离提纯；可适应多种不同功能融合酶的纯化制备。
34.此外，利用sumo标签可将融合酶的表达量提高1.28倍以上，jawa突变体可去处酶的过氧化活性，solo对5
’‑
羟基丙酸(5
’‑
ohp)的催化效率较upo可提高2个数量级，且ee》99％。而wampa本身在有机溶剂中具有良好的稳定性，能够高效地在有机试剂中催化反应。将jawa、solo、wampa融合6
×
his-sumo标签后能够利用组氨酸与金属离子ni
2+
的螯合作用进行分离纯化，可使分离纯化后的酶催化活性大大提高。
35.本发明的另一目的在于提出一种融合酶，该融合酶由6
×
his-sumo标签与非特异性过氧化酶的突变体jawa、solo、wampa相结合而成。
36.相对于现有技术，本发明的融合酶分别由upo的突变体jawa、solo、wampa与c端的6
×
his-sumo标签构成，将其导入进毕赤酵母中进行发酵表达，可使分离纯化后的酶催化活性大大提高。
附图说明
37.构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
38.图1为本发明实施例所述的融合酶的制备原理示意图；
39.图2为本发明实施例1所述的融合酶的质粒构建图；
40.图3为本发明实施例1所述的融合酶质粒的dna电泳图；
41.图4为本发明实施例2所述的md平板筛选阳性菌的平板培养基图；
42.图5为本发明实施例2所述的由毕赤酵母提取质粒的dna电泳图；
43.图6为本发明实施例3所述的诱导表达时间的优化趋势图；
44.图7为本发明实施例3所述的不同有机溶剂中upo与6
×
his-wampa稳定性的对比图；
45.图8为本发明实施例3所述的upo与6
×
his-wampa催化萘转化为1-萘酚的对比图；
46.图9为本发明实施例3所述的不同有机溶剂中upo与6
×
his-wampa稳定性的对比图；
具体实施方式
47.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
48.本实施例中采用的时间单位中，h代表小时，d代表天，min代表分钟。
49.另外，除本实施例特别说明之外，本实施例中所涉及的各术语及工艺依照现有技术中的一般认知及常规方法进行理解即可。
50.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
51.本实施例涉及一种融合酶的制备方法，其一种示例性的制备原理图如图1所示；该制备方法主要包括以下三个步骤：
52.一、构建融合酶质粒；
53.二、提取融合酶质粒，并将其转入到毕赤酵母中，进行发酵表达；
54.三、利用毕赤酵母制备粗酶液，并进行融合酶的分离纯化。
55.该融合酶的主体是upo的突变体jawa、solo、wampa与c端的6
×
his-sumo标签，利用组氨酸与金属离子的特异性亲和作用使得该酶的分离纯化过程简便且高效。
56.基于本实施例上述的融合酶的制备和纯化方法的总体设置原则，在制备时，可参照下述的具体步骤进行。
57.一、构建融合酶质粒；主要可分为如下步骤：
58.a1.构建6
×
his-sumo-jawa、6
×
his-sumo-solo、6
×
his-sumo-wampa的融合表达基因；
59.a2.利用限制性内切酶bamhⅰ和notⅰ将融合酶基因序列连接到e.coli dh5α载体上，构建出重组质粒。
60.二、提取融合酶质粒，并将其转入到毕赤酵母中，进行发酵表达；主要可分为如下步骤：
61.(一)提取融合酶质粒采用大肠杆菌进行，即从中提取大肠杆菌中提取融合酶质粒，并包括以下具体步骤：
62.b1.将融合酶质粒从大肠杆菌中提取出来；
63.b2.用sal i内切酶将环形质粒切开；
64.b3.利用dna电泳判断线性化质粒的条带位置；
65.b4.将线性化质粒进行纯化浓缩。
66.(二)将融合酶质粒转入到毕赤酵母中进行发酵表达主要包括以下步骤
67.c.制备毕赤酵母感受态细胞；
68.d.将融合酶质粒电转进入感受态毕赤酵母细胞；
69.e.提取毕赤酵母中的质粒，并验证质粒的转导情况。
70.其中，在步骤c中，优选采用如下的步骤：
71.c1.用ypd培养基，以1％的接种量从甘油菌接种，对毕赤酵母细胞进行活化；
72.c2.将活化的毕赤酵母细胞以1％的接种量重新接种到新的ypd中，等od
600
值到1.5，将其在4℃条件下离心5min；
73.c3.离心后倒去上清，留下沉淀。用预冷的无菌水将沉淀吹打混匀。再次离心，重复此操作2-3次；
74.c4.最后用预冷的1m的山梨醇，将其混匀，制备好的毕赤酵母感受态细胞要现做现用。
75.需要指出，在接种到ypd培养基过程中，优选以1％的接种量进行，当然，该接种量的比例值也根据情况适当调整。将活化的毕赤酵母细胞重新接种到新的ypd中时，检测的od
600
的值可设置在1.2～1.5之间，例如选取1.2、1.3或1.5等为参照值。离心的温度和时间优选为4℃和5min；当然也可视情况进行适当调整。
76.在步骤d中，需要将融合质粒电转进入感受态毕赤酵母细胞中，具体可采用如下步骤：
77.d1.提前准备好纯化的融合质粒、感受态酵母细胞、山梨醇。在每管80μl的酵母细胞感受态中，加入10μl纯化的重组质粒，吹打混匀，吸入处理好的电转杯中，在冰上孵育5min，随后进行电转。电转后取出，加入1ml的山梨醇，放入30℃温浴2h。
78.d2.将电转后的部分菌液涂布在含有md培养基平板上进行阳性菌筛选，正面培养并待菌液完全被培养基吸收后，于30℃培养箱中倒置培养3-4d，筛选出阳性的工程菌株，并于-80℃下储存。
79.同样的，上述以及下述的各个具体步骤中，列出的加入量、温度和时间等均为较优的具体参数值，这些参数值可在适当的范围内灵活调整，不可作为对本发明制备方法保护范围的限制。
80.此外，步骤d1电转杯的处理具体包括以下内容：
81.d11.用酒精清洗电转杯3次以上，待其干燥后用超纯水再次清洗3次以上；
82.d12.用紫外灯照射电转杯20min。
83.步骤e设计提取毕赤酵母中的质粒，以及对质粒转导情况的验证，具体可采用如下步骤：
84.e1.提取毕赤酵母中的质粒；
85.e2.采用pcr技术大量复制上述的质粒；
86.e3.利用dna电泳验证质粒的电转成功情况。
87.此间，步骤e1的提取毕赤酵母中的质粒包括：
88.e11.将酵母培养物在12000rpm条件下离心2min，弃掉上清。
89.e12.高速涡旋振荡，打散重悬酵母细胞团。加入300μl酵母裂解液，涡旋振荡混匀。
90.e13.将裂解物放置在70℃水浴15-30min，中间可以涡旋振荡混匀几次帮助裂解。冰上孵育5min使回复到室温。
91.e14.在回复室温的裂解物内加入100μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀20s，随后冰浴5min。
92.e15.13000rpm离心5-10min，将上清吸入一个新的离心管内，加入等体积的室温异丙醇，颠倒30次混匀或者直到出现絮状dna沉淀。12000rpm离心1min，留下沉淀，倒弃上清。
93.e16.加入1ml70％乙醇，颠倒几次漂洗dna沉淀，12000rpm离心1min，倒去上清，控干残留乙醇，空气晾干几分钟。
94.e17.加入40μl dna溶解液重新水化溶解dna沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60min，期间不时的轻弹管壁帮助重新水化dna。
95.e18.加入10-15μl的rnase a(10mg/ml)，或者1-2μl rnase a(100mg/ml)颠倒混匀，37℃温育30-60min去除残留rna。
96.e19.dna可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
97.进一步的，步骤e2的pcr技术验证质粒电转成功包括：
98.e21.利用snapgene软件设计上引物和下引物；
99.e22.pcr体系为：超纯水11.5μl，buffer 4μl，dntp 2μl，上引物和下引物各0.5μl，taq酶0.5μl，dna质粒模板1μl；
100.e23.pcr反应条件：预变性94℃5min，一个循环；变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃2min，30个循环；延伸72℃10min；保温4℃。
101.三、利用毕赤酵母制备6
×
his-jawa、6
×
his-solo、6
×
his-wampa融合酶的粗酶液，并进行融合酶的分离纯化；主要可分为如下步骤：
102.(一)粗酶液的制备：
103.f1.将菌株进行平板活化，并进行过夜培养，再接入新鲜bmgy培养基中，待od
600
达到1.8～2.5时，加入bmmy进行诱导培养；
104.f2.对bmgy培养基进行离心洗涤，收集上清液，即为粗酶液，并于3～5℃条件下存储。
105.其中，活化的菌株优选按1％的接种量接入bmgy培养基，od
600
的参照值可选取1.8、2.0、2.4等，优选采用2.0；存储温度优选为4℃。
106.步骤f1涉及对阳性菌进行诱导表达，具体可采用如下步骤：
107.f11.将于-80℃储存的工程菌株进行ypd平板活化，在30℃的生化培养箱中过夜培养，再挑取单菌落于包含氨苄霉素的ypd液体培养基中，在摇床中过夜培养。
108.f12.按照1％的接菌量将活化的阳性菌菌液依次分装到多个装有新鲜bmgy液体培养基的容器中，进行扩大培养，待扩大培养的菌液od
600
达到2时，收集菌体重悬到诱导表达培养基bmmy中，加入1％的诱导剂甲醇，每隔24h加入一次，30℃诱导培养5-6d。
109.(二)融合酶的分离纯化：
110.g1.配备上样缓冲：20mm咪唑、20mm磷酸二氢钠、0.5m氯化钠及洗脱缓冲：500mm咪唑、20mm磷酸二氢钠、0.5m氯化钠并进行抽滤和超声脱气；
111.g2.将粗酶液用0.22μm的水系滤膜进行过滤；
112.g3.将过滤好的粗酶液注入到akta仪器中，进行上样，上样结束后分别以10％、60％、100％的洗脱缓冲进行洗脱，同时收集相应的各洗脱液；对各洗脱液分别进行酶活测定，收集各洗脱液中酶活最高的洗脱液。此间，融合酶分离纯化的最佳洗脱液浓度为60％。
113.参照上述的制备流程和布置，可获得纯化的融合酶，该融合酶中的6
×
his标签能与金属离子特异性结合从而进行分离纯化，sumo标签可以提高融合酶的表达量，jawa去除了酶的过氧化活性，实现了萘的区域选择性转化为1-萘酚；solo对5
’‑
羟基丙酸(5
’‑
ohp)的催化效率较upo提高了2个数量级；wampa在有机溶剂中具有良好的稳定性。
114.本发明的融合酶由6
×
his-sumo标签与非特异性过氧化酶的突变体jawa、solo、wampa相结合而成；融合酶分别由upo的突变体jawa、solo、wampa与c端的6
×
his-sumo标签构成，可将其导入毕赤酵母中进行发酵表达。sumo标签提高了融合酶的表达量；jawa去处了酶的过氧化活性；solo对5
’‑
羟基丙酸(5
’‑
ohp)的催化效率较upo提高了2个数量级；wampa在有机溶剂中具有更高的稳定性及活性，并且融合酶的分离纯化效果好，特异性强。
115.通过构建融合酶的质粒，可提升融合酶的表达量，利用毕赤酵母对质粒进行发酵表达和复制，从而可有效提高融合酶的数量；用制备形成的粗酶液通过离心等方式进行分离提纯；可适应多种不同功能融合酶的纯化制备。
116.此外，利用sumo标签可将融合酶的表达量提高1.28倍以上，jawa突变体可去处酶的过氧化活性，实现了萘的区域选择性转化为1-萘酚，solo对5
’‑
羟基丙酸(5
’‑
ohp)的催化效率较upo提高了2个数量级，且ee》99％。在不提供抗坏血酸的情况下，solo相对于野生型aaeupo的ttn提高了15倍，而wampa本身在有机溶剂中具有良好的稳定性，能够高效地在有机试剂中催化反应。将jawa、solo、wampa融合6
×
his-sumo标签后能够利用组氨酸与金属离子ni
2+
的螯合作用进行分离纯化，分离纯化后的酶催化活性大大提高。
117.目前分子改造仍是是改善酶类某种特定功能的有效方法。基于本发明的方法，通过理性设计或非理性设计以及高通量筛选技术，可以层层优化酶的特定功能，最终获得一个较为理想状态的酶蛋白。
118.基于以上制备方法的整体介绍，下面将以多个实施例具体说明本发明的固定化的融合酶的制备过程中，关键的步骤环节。
119.实施例1
120.本实施例涉及6
×
his-sumo-jawa、6
×
his-sumo-solo、6
×
his-sumo-wampa融合酶质粒的制备。从大肠杆菌中进行质粒提取、以及后续的线性化和纯化等制备原理如图1所示。
121.(1)构建来自agrocybe aegerita的非特异性过氧化酶(aaeupo)的突变体jawa、solo、wampa，并在其c端融合6
×
his-sumo基因。构建融合酶基因序列，再利用限制性内切酶bamhⅰ和notⅰ将融合酶基因序列连接到质粒ppic9k上，构建出重组质粒ppic9k-6
×
his-sumo-jawa、ppic9k-6
×
his-sumo-solo、ppic9k-6
×
his-sumo-wampa。
122.构建的质粒示意图如图2所示。如下的表1列出了融合酶的蛋白序列
123.表1.融合酶的蛋白序列
[0124][0125]
(2)将上述构建完成的质粒转入感受态的e.coli dh5α菌株中，取出部分菌液涂布在含有氨苄霉素的lb培养基平板上，正面培养半个小时，待菌液完全被培养基吸收后于37℃培养箱中倒置培养12-16h。筛选出阳性并保存菌种储存于-80℃。
[0126]
(3)将e.coli dh5α/ppic9k-6
×
his-sumo-jawa、e.coli dh5α/ppic9k-6
×
his-sumo-solo、e.coli dh5α/ppic9k-6
×
his-sumo-wampa从-80℃冰箱中取出，进行含氨苄霉素的ypd培养基(10g/l蛋白胨、5g/l酵母膏、10g/l nacl和2％琼脂粉)活化，在摇床中(37℃，180r/min)过夜培养。
[0127]
(4)取1-4ml过夜培养基进行离心，收集菌体，按照试剂盒说明提取大肠质粒并对其进行线性化。线性化后的质粒进行dna电泳，通过条带位置判断dna大小是否正确。融合酶质粒的dna电泳图如图3所示。
[0128]
(5)对提取的线性化质粒进行纯化，提高其浓度。收集的线性化质粒储存在-80℃备用。
[0129]
实施例2
[0130]
本实施例涉及将融合质粒电转进入感受态毕赤酵母细胞并获得阳性菌。阳性菌在md平板上的菌落图如图4所示。阳性菌的质粒提取图、pcr验证电泳图分别如图5中的a、b所示。
[0131]
(1)首先用ypd培养基对毕赤酵母进行活化，以1％的接种量从甘油菌中接种到培养基。
[0132]
(2)继续以1％接种量接种到两个新的ypd中，对毕赤酵母进行扩大培养养，等到od
600
到1.2，将菌液进行离心。离心条件为5000rpm、5min、4℃。离心后倒去上清，留下沉淀。用预冷的无菌水10-15ml将沉淀吹打混匀，继续离心，重复操作2-3次。最后用预冷的山梨醇将其重悬。制备好的毕赤酵母感受态要及时使用。
[0133]
(3)提前准备好纯化的融合质粒、感受态酵母细胞、山梨醇。在每管80μl的酵母细胞感受态中，加入10μl纯化的重组质粒，吹打混匀，吸入处理好的电转杯中，在冰上孵育5min，随后进行电转。电转后取出，加入1ml的山梨醇，放入30℃温浴2h。
[0134]
(4)将电转后的部分菌液涂布在含有md培养基平板上进行阳性菌筛选，正面培养并待菌液完全被培养基吸收后，于30℃培养箱中倒置培养3-4d，筛选出阳性的工程菌株，并于-80℃下储存。由于md培养基无法为微生物提供组氨酸，所以电转成功的毕赤酵母能自己提供组氨酸，从而在md平板上生长。毕赤酵母菌落在md平板上的形态如图3所示，菌落乳白色，边缘光滑，中间微微隆起。
[0135]
(5)利用酵母培养物提取毕赤酵母中的质粒，首先将其在12000rpm条件下离心2min，弃掉上清。高速涡旋振荡，打散重悬酵母细胞团。加入300μl酵母裂解液，涡旋振荡混匀。将裂解物放置在70℃水浴15-30min，中间可以涡旋振荡混匀几次帮助裂解。冰上孵育5min使回复到室温。在回复室温的裂解物内加入100μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀20s，随后冰浴5min。13000rpm离心5-10min，将上清吸入一个新的离心管内，加入等体积的室温异丙醇，颠倒30次混匀或者直到出现絮状dna沉淀。12000rpm离心1min，留下沉淀，倒弃上清。加入1ml70％乙醇，颠倒几次漂洗dna沉淀，12000rpm离心1min，倒去上清，控干残留乙醇，空气晾干几分钟。加入40μl dna溶解液重新水化溶解dna沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60min，期间不时的轻弹管壁帮助重新水化dna。加入10-15μl的rnase a(10mg/ml)，或者1-2μl rnase a(100mg/ml)颠倒混匀，37℃温育30-60min去除残留rna。dna可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃以下。
[0136]
(6)然后，利用pcr技术验证质粒电转成功。首先利用snapgene软件设计上引物和下引物。pcr体系为：超纯水11.5μl，buffer 4μl，dntp 2μl，上引物和下引物各0.5μl，taq酶0.5μl，dna质粒模板1μl。pcr反应条件：预变性94℃5min，一个循环；变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃2min，30个循环；延伸72℃10min；保温4℃。将pcr产物进行dna电泳，通过条带位置判定是否为阳性菌。
[0137]
实施例3
[0138]
本实施例涉及融合酶的制备及其在有机溶剂中稳定性的测定。
[0139]
(1)按照1％的接菌量将活化的阳性菌菌液依次分装到多个装有新鲜bmgy液体培养基的容器中，进行扩大培养，待扩大培养的菌液od
600
达到2时，收集菌体重悬到诱导表达培养基bmmy中，加入1％的诱导剂甲醇，每隔24h加入一次，30℃诱导培养，并对诱导时间进行优化(48-172h)，由图6可知，在144h时比酶活最高，随后不再升高。
[0140]
(2)反应在室温下进行，每个反应混合物含有6u纯化酶、1mm乙苯、20％乙腈和4mm h2o2，在ph值为7.0的100mm磷酸钾缓冲液中(1ml最终体积)。24h后，用20μl 37％盐酸停止反应，并通过gc分析混合物。实验结果如图7所示，jawa生成的苯乙酮仅为4％，而upo生成的苯乙酮高达36％，由此说明jawa有效的去除了酶的过氧化活性。
[0141]
(3)反应在室温下进行，每个反应混合物含有6u纯化酶、1mm萘、20％乙腈和1mm h2o2，在ph值为7.0的100mm磷酸钾缓冲液中(1ml最终体积)。3h后，用20μl 37％盐酸停止反应，并通过gc分析混合物。实验结果如图8所示，solo生成的1-苯酚为87％，而upo生成的1-苯酚仅为34％，由此说明solo有效的提高了酶催化萘的效率。
[0142]
(4)测定upo与wampa在不同有机溶剂中(乙腈、丙酮、dmso、dmf、甲醇)的稳定性。测酶活总体系为1ml，其中包括0.3mm的abts、2mm的过氧化氢，30％的有机溶剂，缓冲溶液为ph 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并加入100μl的酶，在室温下孵育2h。实验结果如图9所示，明显看到wampa在各个有机溶剂中的稳定性都优于upo。
[0143]
实施例4
[0144]
本实施例涉及融合酶的分离纯化。
[0145]
(1)配备上样缓冲：20mm咪唑、20mm磷酸二氢钠、0.5m氯化钠及洗脱缓冲：500mm咪唑、20mm磷酸二氢钠、0.5m氯化钠并进行抽滤和超声脱气。
[0146]
(2)将粗酶液用0.22μm的水系滤膜进行过滤。
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(3)首先用上样缓冲液平衡akta仪器的各个泵和管路，使仪器中充满上样缓冲液，随后连接上镍柱，继续以1ml/min的速度平衡10-15min。
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(4)平衡好后将过滤好的粗酶液注入到akta仪器中，进行上样，上样结束后以10％、60％、100％的洗脱缓冲进行洗脱，同时收集洗脱液。对洗脱液测定酶活，收集高酶活的洗脱液。
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在实际操作中，酶液主要在60％洗脱液洗脱时收集，此时收集的酶活很高，说明纯度很纯。而在其它浓度洗脱液洗脱下来的液体几乎没有酶活。分离纯化后的酶活、蛋白含量及比酶活与粗酶液的比较如下表2所示。
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表2.sumo标签和分离纯化对酶活、比酶活和蛋白含量的影响比较表
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综上所述，通过构建融合酶的质粒，可提升融合酶的表达量，利用毕赤酵母对质粒进行发酵表达和复制，从而可有效提高融合酶的数量；用制备形成的粗酶液通过离心等方式进行分离提纯，可适应多种不同功能融合酶的纯化制备。而且，将其导入进毕赤酵母中进行发酵表达，可使分离纯化后的酶催化活性大大提高。
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。