一种可以用于血液检测的PCR反应液及其试剂盒的制作方法

一种可以用于血液检测的pcr反应液及其试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体一种可以血液为模板直接进行pcr检测的反应液及其试剂盒。
2.

背景技术：

3.聚合酶链反应(pcr)是一种敏感的dna扩增程序，可以从复杂混合物中检测特定的核酸。反应体系中包含核酸模板，特异性引物、dna聚合酶及相应的缓冲体系及离子。在核酸扩增过程中，目的基因、引物和聚合酶混合物在不同的温度下经受连续热循环过程（25～35），扩增新的互补目标序列。自20世纪80年代中期以来，pcr已成为检测微量核酸的标准。
4.对于临床诊断和法医检测来说，样本中的抑制物是造成pcr反应中假阴性和低灵敏度的主要问题。
5.做为临床上非常重要的血液样本pcr的分析，与人类健康相关的遗传疾病诊断测试中最大的一部分疾病、病毒和微生物感染、血型和安全血库有非常大的相关性。
6.血液对pcr的抑制作用尚未明确，部分研究表明抑制扩增的主要原因是dna聚合酶的失活和/或者捕获或降解目标dna和原分子。人血液中pcr的几种主要抑制剂如血红蛋白、免疫球蛋白g和乳铁蛋白另外血液蛋白酶活性也可能导致pcr效率的降低(5,9
–
12)。外源性的抗凝剂包括edta、肝素等，对pcr扩增也有一定的抑制作用。
7.除了上述物质可以抑制pcr反应外，在全血样本的特异性检测中，通常会有其它的非特异扩增，与靶基因共同竞争导致目的基因产物不纯或者无法扩增。
8.为了降低血液成分对pcr的抑制作用，人们开发了多种dna提取方法。这些预处理步骤通常是耗时、劳动密集型和样本特异性的。此外，即使在提取dna时使用试剂盒，一些pcr抑制剂可能仍然无法完全消除。例如，乙肝病毒检测使用血液dna纯化试剂盒约有14%的人可能是假阴性。
9.目前广泛使用的dna聚合酶，如taq dna polymerase和热启动型taq gold，都可以使用低于0.2%的浓度全血进行pcr扩增。一些非taq dna聚合酶，如rtth，tfl，hottub和pwo，能耐受较高浓度的血液。部分taq突变体，如kt10，t36等可以耐受10-20%血液。通过研究发现一些试剂加入体系后会降低血液对taq酶的抑制，使taq酶可以在含2%血液体系中进行扩增，但是这种效果同样具有样本特异性。这些试剂包括，甜菜碱、单链结合蛋白、或者某些蛋白的混合物。


技术实现要素：

10.本发明的一个目的是提供一种全新的可用于血液直扩的pcr反应液（mix2），其最高可以耐受40%血液。本试剂的发明将有利于利用pcr技术对全血样本进行分析检测并克服现有pcr技术存在的上述缺点。
11.本发明所提供的pcr反应液，包括taq dna聚合酶、缓冲体系、二价阳离子、一价阳
离子、dntps、pcr反应增强剂和pcr体系稳定剂。
12.其中，所述的taqdna聚合酶是抗体修饰的热启动dna聚合酶、taqdnapolymerase中的一种或者两种混合。
13.进一步的，所述抗体修饰的热启动dna聚合酶可选自济凡生物科技（北京）有限公司出售的下述至少一种：a110、a112和a113。
14.所述a110：genfqiihotstarttaqdnapolymerase（商品目录号为a110-01或a110-02）；所述a112：genfqhotstarttaqdnapolymerase（商品目录号为a112-1或a112-2）；所述a113：genfqiiihotstarttaqdnapolymerase（商品目录号为a113-1或a113-2）。
15.所述taqdna聚合酶可为济凡生物科技（北京）有限公司的产品genfqtaqdnapolymerase，商品目录号为a111-01或a111-02。
16.根据本发明的一个实施例，所述的taqdna聚合酶可为a110或a111或a113或，a112和a110的混合物(酶活比1:1)，或a110和a113的混合物(酶活比1:1)。
17.所述的缓冲体系可以是tris-hcl缓冲液。
18.所述的二价阳离子可以是mg
2+
、mn
2+
中的一种或者两种混合。具体的，所述mg
2+
可由mgcl2提供；所述mn
2+
可由mncl2提供。
19.所述的一价阳离子可以是k
+
、nh4
+
、na
+
、li
+
中的一种或者几种混合。
20.所述的dntps包括datp、dctp、dgtp和dttp；具体的，所述dntps中，datp、dctp、dgtp、dttp的摩尔比可为0.3mm：0.3mm：0.3mm：0.3mm。
21.所述的pcr反应增强剂可以是甜菜碱、海藻糖、二甲亚砜（dmso）、明胶、甘油、ssb（单链结合蛋白）、sso7d蛋白、牛血清白蛋白(bsa)中的一种或者几种混合。
22.10
×
所述pcr反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱1～5m、dmso0.5～4%（v/v%）、明胶0.05～1%（w/w%）、etssb（极高热稳定性单链dna结合蛋白）0.01～1%（w/w%），溶剂为水。
23.根据本发明的一个实施例，所述10
×
pcr反应增强剂，包括下述终浓度的物质：甜菜碱3m、dmso3%（v/v%）、明胶0.5%（w/w%）、etssb0.5%（w/w%）。
24.所述的pcr体系稳定剂可以是peg2000、peg6000、tween20、np40、tritonx-100、山梨醇中的一种或几种。
25.进一步的，2
×
pcr反应液，包括下述浓度的物质：taqdna聚合酶0.02-0.2u/ul、tris-hcl（ph8.3-9.0）60～400mm、dntps0.2～2mm、mgcl24～20mm、kcl20～200m、(nh4)2so410～80mm、10
×
pcr反应增强剂2%～20%（v/v%）和pcr体系稳定剂0.01%～5%（w/w%）。
26.本发明中所述2
×
pcr反应液中的溶剂为水，更进一步可为双蒸水（ddh2o）。
27.根据本发明的一个实施例，所述2
×
pcr反应液，包括下述终浓度的物质：tris-hcl（ph9.0）150mm、(nh4)2so48mm、mgcl24mm、10%tween200.01%（v/v%）、dntps0.4mm、kcl120mm、10xenhancer20%（v/v%）、a1110.1u/μl，溶剂为ddh2o。
28.根据本发明的一个实施例，所述2
×
pcr反应液，包括下述终浓度的物质：tris-hcl（ph8.5）300mm、(nh4)2so420mm、mgcl26mm、10%tween200.01%（v/v%）、dntps0.6mm、kcl
100mm、10xenhancer20%（v/v%）、a112&a110(酶活比1:1)0.1u/μl，溶剂为ddh2o。
29.根据本发明的一个实施例，所述2
×
pcr反应液，包括下述终浓度的物质：tris-hcl（ph8.5）200mm、(nh4)2so430mm、mgcl26mm、10%tween200.01%（v/v%）、dntps0.6mm、10xenhancer20%（v/v%）、a1130.1u/μl，溶剂为ddh2o。
30.根据本发明的一个实施例，所述2
×
pcr反应液，包括下述终浓度的物质：tris-hcl（ph8.5）200mm、(nh4)2so430mm、mgcl26mm、10%tween200.01%（v/v%）、dntps0.6mm、10xenhancer20%（v/v%）、a110&a113(酶活比1:1)0.1u/μl，peg60001%（w/w%）；溶剂为ddh2o。
31.根据本发明的一个实施例，所述2
×
pcr反应液，包括下述终浓度的物质：tris-hcl（ph8.5）150mm、(nh4)2so430mm、mgcl26mm、10%tween200.01%（v/v%）、dntps0.6mm、10xenhancer20%（v/v%）、a1100.1u/μl、peg60001%（w/w%）、山梨醇60mm；溶剂为ddh2o。
32.用于测试本发明提供的pcr反应液对血液耐受度的引物是基于人和猪基因组进行的设计，片段长度从300bp-3kb。
33.具体的，针对人基因组序列设计了10对引物，片段长度300bp-3kb；针对猪基因组序列设计了10对引物，片段长度300bp-2kb。
34.用于测试上述pcr反应液的血液可为猪血或人血，在pcr反应体系中血液的体积含量可为10%～40%。
35.本发明另一个目的是提供上述pcr反应液在血液样本扩增中的应用。
36.根据本发明的实施例，所述血液样本可为人血或猪血。
37.本发明再一个目的是提供一种扩增血液样本的方法。
38.本发明所提供的扩增血液样本的方法，包括使用上述的pcr反应液以血液为模板直接进行pcr反应，以获得经过扩增的血液样本。
39.所述pcr反应的反应体系中，血液的体积含量可为0.08%～40%；具体可为10%～40%。
40.进一步的，所述pcr反应的反应体系中，pcr反应液的体积含量可为60%～99.2%。
41.所述pcr反应的反应体系中还包括引物，所述引物的浓度可为0.2μm～1μm。
42.所述pcr反应的条件具体如下：本发明还保护一种可以用于血液检测的试剂盒。
43.本发明所提供的用于血液检测的试剂盒，其包括上述的可用于血液直扩的pcr反应液。
44.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明采用经过分子进化后的突变体taq中的一种或几种，搭配优化的pcr反应体系和独特的pcr增强剂，可以在体系血液含量达到30～40%时，依然可以有效扩增。现有技术可以达到10～20%。
附图说明
45.图1为采用5个pcr反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：1.1kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指pcr反应体系中血液的体积分数。
46.图2为采用4个pcr反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：334kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指pcr反应体系中血液的体积分数。
47.图3为采用4个pcr反应液扩增不同血液的电泳检测图（猪：2 kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指pcr反应体系中血液的体积分数。
48.图4为采用4个pcr反应液扩增不同血液的电泳检测图（人：1kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指pcr反应体系中血液的体积分数。
49.图5为采用4个pcr反应液扩增不同血液的电泳检测图（人：3kb）；其中，10%、20%、30%、40%均指pcr反应体系中血液的体积分数。
50.图6为mix2与诺唯赞pd103、全式金ad401扩增不同血液电泳检测图（人：1kb）。
具体实施方式
51.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
52.下述实施例中猪：1.1kb、猪：334kb、猪：2 kb、人：1kb、人：3kb，引物序列见下表：下述实施例中dntps由datp、dctp、dgtp和dttp组成，其中，datp、dctp、dgtp、dttp的摩尔比为0.3mm：0.3mm：0.3mm：0.3mm。
53.下述实施例中使用的a110、a111、a112、a113均购自济凡生物科技（北京）有限公司；a110：genfq ii hot start taq dna polymerase（商品目录号为a110-01或a110-02）；a111：genfq taq dna polymerase（商品目录号为a111-01或a111-02）；a112：genfq hot start taq dna polymerase（商品目录号为a112-1或a112-2）；a113：genfq iii hot start taq dna polymerase（商品目录号为a113-1或a113-2）下述实施例中使用的10x enhancer由下述终浓度的物质组成：甜菜碱3m、dmso 3%（v/v%） 、明胶0.5%（w/w%）、et ssb 0.5%（w/w%），溶剂为水。
54.下述对比例中使用的诺唯赞pd103，商品名为：blood direct pcr kit v2，货号：
pd103-01；全式金ad401，商品名为：transdirect
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blood pcr kit，目录号ad401-01。
55.实施例1、2x pcr反应液配制：pcr反应液配制：pcr扩增条件：
各pcr扩增体系下的电泳检测图结果如图1-5所示。
56.由图1可知，在以猪血作为模板时，以1.1kb-f和1.1kb-r为引物，扩增长度为1.1kb片段时，mix4和mix5在≤40%血液范围内可以有效扩增，mix1只能在≤20%范围内有效扩增，mix2和mix3在≤30%血液范围内可以有效扩增。
57.由图2可知，在以猪血作为模板时，以334-f和334-f为引物，扩增长度为334kb片段时，除mix1外，其它几个mix在≤40%血液范围内可以有效扩增，mix1只能在≤30%范围内有效扩增。
58.由图3可知，在以猪血作为模板时，以2kb-f和2kb-r为引物，扩增长度为2kb片段时，mix2和mix4在≤30%血液范围内可以有效扩增，其它几个mix只能在≤20%范围内有效扩增。
59.由图4可知，在以人血作为模板时，以1kb-f和1kb-r为引物，扩增长度为1kb片段时，mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，其它几个mix只能在≤20%范围内有效扩增。
60.由图5可知，在以人血作为模板时，以3kb-f和3kb-r为引物，扩增长度为3kb片段时，mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，其它几个mix只能在≤20%范围内有效扩增。
61.由以上实施例可知，本发明提供了一种可以pcr反应液，可以以全血为模板进行扩增，也可以在血液存在的情况下，扩增其它靶基因，最高可以耐受40%血液。
62.本发明利用济凡公司的酶和试剂设计了5个pcr反应液用于测试，通过对比显示对于猪血而言，mix4性能最佳；对人血而言，mix2性能最佳；其它mix 对血液的耐受程度有差异。
63.对比例1、采用诺唯赞pd103或全式金ad401以人血作为模板的扩增实验将实施例1中的mix2与诺唯赞pd103、全式金ad401，以人血作为模板，以1kb-f和1kb-r为引物，扩增长度为1kb片段，结果见图6。
64.由图6可知，在以人血作为模板，扩增长度为1kb片段时，mix2在≤40%血液范围内可以有效扩增，诺唯赞pd103可以≤20%血液里有效扩增，全式金ad401只在能在≤10%血液有效扩增。
65.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。