本发明涉及含高均一性poly(a)尾的mrna及其制备方法。
背景技术：
1、体外合成的mrna可利用细胞自身的翻译系统，在细胞和动物体内表达不同功能的蛋白质，包括各类天然或非天然的蛋白质产物，例如基因编码的天然蛋白质及其突变形式、抗体、微生物多肽抗原、肿瘤抗原多肽的串联物等。目前，基于mrna技术的新冠疫苗获得fda批准并在全球疫情防控中发挥了重要作用。另有多种传染病疫苗的开发也在进行中，如已进入三期临床试验的流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗和巨细胞病毒疫苗等。同时，mrna技术在肿瘤免疫治疗和罕见病治疗等领域崭露头角，多个产品线进入一期或二期临床试验。
2、mrna分子设计是mrna药物开发的关键技术，mrna稳定性、免疫原性和蛋白质表达效率是决定mrna药物是否成功的重要因素。已有大量研究证明优化mrna分子结构、引入核苷酸修饰和改进纯化方法等，可极大提升mrna的稳定性和翻译效率、降低mrna免疫原性〔pardi,n.,hogan,m.j.,porter,f.w.,&weissman,d.(2018).mrna vaccines-a new erain vaccinology.nature reviews.drug discovery,17(4),261–279〕。poly(a)尾是mrna分子重要功能区域，在mrna的翻译和稳定性方面具有关键作用〔passmore,l.a.,&coller,j.(2021).roles of mrna poly(a)tails in regulation of eukaryotic geneexpression.nature reviews.molecular cell biology,10.1038/s41580-021-00417-y.advance online publication〕，因此，制备poly(a)长度合适且均一的mrna，是mrna制药技术中重要的一环。
3、传统mrna制备方法包括使用poly(a)聚合酶加尾、使用带有poly(a)的dna引物进行pcr扩增、或将poly(a)序列加入直接插入到质粒载体中。但这些策略都具有其内在缺陷。如采用poly(a)聚合酶加尾增加生产成本，且得到的poly(a)尾长度不均一，造成纯化困难和难以进行严格的质量控制。而使用带有poly(a)的dna引物进行pcr扩增制备模板的成本较高，难以广泛应用于工业化大规模生产。质粒载体是目前使用最为广泛的主流方法，但质粒载体在用作体外转录模板前要先进行线性化，因此需要在质粒dna模板的poly(a)序列后引入限制性内切酶切割位点。然而目前已有的绝大部分限制性内切酶切割质粒后会导致在poly(a)序列后形成非a碱基残留，降低体外转录生成的mrna在细胞内的蛋白质表达量〔holtkamp,s.,kreiter,s.,selmi,a.,simon,p.,koslowski,m.,huber,c.,türeci,o.,&sahin,u.(2006).modification of antigen-encoding rna increases stability,translational efficacy,and t-cell stimulatory capacity of dendriticcells.blood,108(13),4009–4017〕。
4、综上所述，本领域亟需优化mrna体外转录的dna模板，以提高mrna分子poly(a)尾的均一性和防止poly(a)后非a碱基残留，从而提高mrna的翻译效率和稳定性，使mrna在细胞内能更高效、持久地表达编码的蛋白质。
技术实现思路
1、本发明第一方面提供一种核酸分子，该核酸分子的3’端具有poly(a)尾和位于该poly(a)尾3’端与该poly(a)尾直接相连的核酶。
2、在一个或多个实施方案中，所述poly(a)尾长50-250个核苷酸。
3、在一个或多个实施方案中，所述核酶是自剪切核酶。
4、在一个或多个实施方案中，所述核酶选自hdv核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。
5、在一个或多个实施方案中，所述核酶是hdv核酶。
6、在一个或多个实施方案中，所述核酸分子从5’端到3’端依次含有启动子序列、5’非翻译区、kozak序列、开放阅读框、3’非翻译区、所述poly(a)尾和所述核酶。
7、在一个或多个实施方案中，所述开放阅读框编码感兴趣的蛋白质或多肽分子。
8、在一个或多个实施方案中，所述感兴趣的蛋白质或多肽分子选自：病原体抗原、肿瘤抗原、细胞因子、激素、抗体、酶和结构蛋白。
9、在一个或多个实施方案中，所述启动子选自：t7启动子、t3启动子、sp6启动子、t7lac启动子、arabad启动子、trp启动子、lac启动子、ptac启动子和pl启动子等。
10、本发明第二方面提供一种核酸构建物，该核酸构建物含有本发明第一方面任一实施方案所述的核酸分子。
11、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为载体。
12、在一个或多个实施方案中，所述载体为质粒，或者pcr扩增的dna片段。
13、本发明第三方面提供一种含mrna分子的制品，该制品由本发明第二方面所述的载体线性化后经体外转录得到。
14、本发明第四方面提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明第三方面所述的mrna分子制品中的mrna分子和药学上可接受的载体。
15、本发明第五方面提供本发明第一方面所述的核酸分子或第二方面所述的核酸构建物在制备mrna中的应用，或在提高mrna在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用。
16、本发明第六方面提供核酶在制备mrna中的应用，或在提高mrna在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用。
17、在一个或多个实施方案中，所述核酶是自剪切核酶。
18、在一个或多个实施方案中，所述核酶选自hdv核酶、发夹状核酶和锤头状核酶。
19、在一个或多个实施方案中，所述核酶是hdv核酶。
20、本发明第七方面提供一种制备翻译效率和/或稳定性提高的mrna的方法，该方法包括对线性化的载体进行体外转录制备所述mrna的步骤，其中，所述线性化的载体含有本发明第一方面所述的核酸分子，或载体为本发明第二方面所述的载体。
21、在一个或多个实施方案中，所述方法还包括制备所述载体的步骤。
1.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的3’端具有poly(a)尾和位于该poly(a)尾3’端与该poly(a)尾直接相连的核酶。
2.如权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述poly(a)尾长50-250个核苷酸。
3.如权利要求1或2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酶是自剪切核酶；优选地，所述核酶选自hdv核酶、发夹状核酶和锤头状核酶；更优选地，所述核酶是hdv核酶。
4.如权利要求1-3中任一项所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子从5’端到3’端依次含有启动子序列、5’非翻译区、kozak序列、开放阅读框、3’非翻译区、所述poly(a)尾和所述核酶。
5.如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，
6.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求1-5中任一项所述的核酸分子；
7.一种含mrna分子的制品，其特征在于，所述制品由权利要求6所述的载体线性化后经体外转录得到。
8.一种药物组合物，其特征在于，该药物组合物含有权利要求7所述的mrna分子制品中的mrna分子和药学上可接受的载体。
9.权利要求1-5中任一项所述的核酸分子或权利要求6所述的核酸构建物在制备mrna中的应用，或在提高mrna在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用，或核酶在制备mrna中的应用，或核酶在提高mrna在体内的翻译效率和/或稳定性中的应用；
10.一种制备翻译效率和/或稳定性提高的mrna的方法，其特征在于，该方法包括对线性化的载体进行体外转录制备所述mrna的步骤，其中，所述线性化的载体含有权利要求1-5中任一项所述的核酸分子，或所述载体为权利要求6所述的载体。