靶向人类LTβR基因的反义核酸及其应用

本发明涉及反义核酸(asos)，尤其涉及靶向人类ltbr基因的反义核酸及其在沉默人类ltβr基因表达或反义调节淋巴毒素β受体表达中的应用，属于靶向人类ltβr基因的反义核酸及其应用领域。

背景技术：

1、肿瘤坏死因子(tnf)超家族分子淋巴毒素α1β2和light是多种感染或非感染性炎症活动的重要驱动因素。在炎症过程中，活化的淋巴细胞表达淋巴毒素α1β2和light，二者与淋巴毒素β受体(ltβr，tnf超家族受体成员之一，在上皮细胞、基质细胞和髓样细胞上表达，在淋巴细胞上不表达)相互作用，激活标准或非标准nf-κb信号通路，诱导趋化因子、细胞因子或粘附分子表达，如ccl2、cxcl8和cxcl13等，招募和激活炎性细胞，活化的炎性细胞分泌il6、il13、tgf-β，诱导一系列炎症和组织重塑。阻断ltβr受体被证明可以减轻炎症活动，同时阻止炎症诱导的各种组织纤维化和癌变，降低组织病变和原发性肿瘤的发生。

2、反义核酸(asos)是分子生物学领域的一种强有力的工具，也是研究广泛的治疗药物。asos通过碱基互补配对触发多种调控机制，例如通过rnase h酶切割asos和靶mrna之间的dna-rna双链中的rna链，从而导致靶mrna的降解，实现高度特异性和选择性的基因表达沉默。为了改善asos的药理学特性，对骨架和2’-核糖进行多种化学修饰。硫代磷酸(ps)修饰提高了asos的核酸酶稳定性、分布和细胞摄取效率；2’-ome和2’-moe修饰可进一步提高核酸酶抗性和结合亲和力，并减少免疫刺激，但会阻止rnase h的识别；gamper是两侧各具有3-6个2’-修饰核苷酸的硫代磷酸反义核酸，该策略不仅具有2’修饰的优势，同时可实现rnase h介导的靶mrna切割。

3、ltβr参与多种疾病的发生和发展过程。light等配体通过结合肺上皮细胞组成性表达的ltβr强烈诱导哮喘和特发性肺纤维化等肺部炎症的发展；同时，标准或非标准nf-κb信号通路参与了各种肝病如代谢性肝病、自身免疫性肝病和病毒性肝炎的发病过程；另外，ltβr水平在人体癌细胞系有所升高，在ltβr炎症介导的肿瘤形成过程、akt/β-连环蛋白和notch细胞通路活动中都起到关键作用。因此，ltβr在多种癌症如肝癌、鼻咽癌、前列腺癌等方面也是非常有潜力的治疗靶点。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供靶向人类ltβr基因的反义核酸；

2、本发明的目的之二是将所述的靶向人类ltβr基因的反义核酸应用于制备沉默人类ltβr基因表达的药物或制备反义调节淋巴毒素β受体表达的药物或制剂；

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

4、本发明首先提供了靶向人类ltβr基因的反义核酸，所述反义核酸的核苷酸序列选自(1)或(2)中的任何一种核苷酸序列

5、(1)seq id no.1-seq id no.40中的任何一种核苷酸序列；

6、(2)与ltβr基因相应靶标序列位置至少85％互补的核苷酸序列；优选的，与ltβr基因相应靶标序列位置至少90％互补的核苷酸序列；更优选的，与ltβr基因相应靶标序列位置至少95％互补的核苷酸序列；最优选的，与ltβr基因相应靶标序列位置100％互补的核苷酸序列。

7、优选的，所述的反义核酸的核苷酸序列选自seq id no.5-seq id no.13、seq idno.15-seq id no.29、seq id no.31-seq id no.37、seq id no.39-seq id no.40中的任何一种，更优选的，所述的反义核酸的核苷酸序列选自seq id no.4-8、seq id no.10-11、seq id no.16、seq id no.24、seq id no.28或seq id no.32中的任何一种，最优选的，所述的反义核酸的核苷酸序列为seq id no.8或seq id no.10。

8、本发明针对人类ltβr转录本1设计出40条长度为20nt的asos，在ltβr mrna水平对这40条asos进行初步筛选；根据ltbr mrna水平的筛选结果可见，除了seq id no.1、seqid no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.14、seq id no.30以及seq id no.38对于人类ltbr基因的沉默效率较低以外，其它的33条aso序列对于人类ltbr基因均有较好的沉默效率，其中seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq idno.10、seq id no.11、seq id no.16、seq id no.24、seq id no.28以及seq id no.32对于人类ltbr基因的沉默效率均较高，尤其是以seq id no.8以及seq id no.10的沉默效率最佳。

9、为了改善该反义核酸(asos)的药理学特性，本发明对这些反义核酸的骨架和2’-核糖进行多种化学修饰，其中，为了提高这些反义核酸的核酸酶稳定性、分布和细胞摄取效率，本发明对这些反义核酸进行了部分或全部硫代磷酸(ps)修饰；为了提高这些反义核酸的核酸酶抗性和结合亲和力并减少免疫刺激，本发明可以对这些反义核酸的核苷进行各种修饰，包括但不限于，骨架修饰：硫代磷酸(ps、ps2)、肽核酸(pnas)、四甲基胍(tmg)、吗啡啉(ppmo)等；糖环修饰：2’-o-甲基(2’-ome)、2’-甲氧乙基(2’-moe)、2’-氟(2’-f)、锁核酸(lna)、限制性乙烷基(cet)、4’-c-乙烯基桥联(ena)、三环dna(tcdna)、zip核酸(zna)等；碱基修饰：5’-r(卤素、甲基、炔基)修饰的u、3’-甲基修饰的u、5’-甲基修饰的c、6’-甲基修饰的a或肌苷等.

10、进一步的，本发明将进行了硫代磷酸(ps)修饰的反义核酸的两侧各进行3-6个2’-修饰核苷酸，不仅具有修饰反义核酸的结合力的优势，同时可实现rnase h介导的靶mrna切割。

11、作为本发明的一种优选的具体实施方案，本发明将seq id no.8或seq id no.10进行了硫代磷酸(ps)修饰分别得到了ps-8或ps-10，将ps-8或ps-10的5’和3’端各6个碱基再进行2’-ome修饰，命名为gapmer-8和gapmer-10，把ps-8和gapmer-8的第8位g突变为a，第10位g突变为c，第12位g突变t，作为错配序列ps-8-mis(seq id no.41)和gapmer-8-mis(seq id no.42)。根据试验结果可见，ps-8、ps-10、gapmer-8和gapmer-10对ltβr基因mrna表达沉默具有明显的时间效应，ps-8、gapmer-8在80nm转染浓度下，随着孵育时间的延长，沉默效果逐渐增强，在24小时达到最大沉默效果。ps-10、gapmer-10起效较快，在转染6小时后即可达到最大沉默效果。；ps-8、gapmer-8和ps-10也具有明显的浓度效应，在孵育48h后，随着转染浓度由20nm提高至40nm、80nm，沉默效果逐渐增强，gapmer-10在此浓度区间无浓度效应。

12、由此，本发明提供的靶向人类ltβr基因的反义核酸能够应用于制备沉默人类ltβr基因表达的药物或者应用于制备反义调节淋巴毒素β受体表达的药物，这些药物能够阻断ltβr受体，可以减轻炎症活动，同时阻止炎症诱导的癌变，降低原发性肿瘤的发生。

13、按照本领域的常规制剂手段，可以将本发明提供的靶向人类ltβr基因的反义核酸制备成相应的沉默人类ltβr基因表达的药物或阻断ltβr受体的临床制剂。