用于检测芥菜裂叶基因连锁的KASP标记的核酸及其应用

用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记辅助育种，具体地涉及用于检测芥菜裂叶基因连 锁的kasp标记的核酸及其应用。


背景技术：

2.叶用芥菜是芥菜类蔬菜的一类，属于十字花科(cruciferae)芸薹属 (brassica)，可以用来鲜食或腌制加工成梅干菜，是重要的农副产品。叶缘 出现裂刻在自然界中普遍存在，可作为形态标记，对逆境的适应性较强， 也有利于合理密植。叶用芥菜也存在叶缘裂刻的现象，但是，关于芥菜裂 叶的遗传基础研究报道的较少。
3.kasp是竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr) 的缩写，可在广泛的基因组dna样品中，对snps进行精准的双等位基因 判断。kasp技术比传统的分子标记检测技术更具有高效和灵活的特点 (alvarez-fernandez et al.,2021)。结合kasp技术来进行分子标记辅助育种 可以提高育种效率。利用分子标记结合bsa-rnaseq的方法已经进行了芥 菜裂叶基因定位的初探。但是，由于rnaseq方法和参考基因组组装质量 低的限制等因素，导致关于芥菜裂叶基因的研究较困难。并且，目前也没 有开发出相关的kasp标记可以促进裂叶芥菜的育种进程(heng et al., 2020)。
4.因此，需要进一步研究控制裂叶的基因的分子机制，并且开发出芥菜 裂叶基因紧密连锁的kasp分子标记，以用于高效的辅助裂叶芥菜的育种 工作。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中的技术问题，本发明人通过深入研究，根据裂叶的 自交系20jsz0233和锯齿叶的自交系20jzs0351的重测序数据以及后代f2群体20jzs0771混池的测序数据确定了与芥菜裂叶基因相关的基因，并开 发出该基因上下游区域紧密连锁的kasp标记。具体地，本发明包括以下 内容。
6.本发明的第一方面，提供一种用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标 记的核酸，其包含用于检测由多个snp位点组成的位点集的信息，其中所 述位点集选自由a10_18183785、a10_18413471、a10_18876551、 a10_18911257、a10_18930496、a10_18933850、a10_18962956、 a10_19028312、a10_19184970和a10_19577069组成的组中至少两个位点。
7.根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸， 优选地，所述位点集如表1所示。
8.表1：kasp标记位点的具体信息
[0009][0010]
根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸， 优选地，所述位点位于芥菜a亚基因组10号染色体上。
[0011]
根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸， 优选地，所述位点以芥菜t84-66-v2版本基因组为参考基因组确定。
[0012]
根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸， 优选地，所述核酸包括引物，所述引物由第一正向引物、第二正向引物和 反向引物三条引物组成，以检测所述位点的信息。
[0013]
根据本发明所述的用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸， 优选地，所述引物的序列为seq id no.：1-30。
[0014]
本发明的第二方面，提供含有第一方面所述核酸的检测试剂或试剂盒。
[0015]
本发明的第三方面，提供根据第一方面所述的核酸或第二方面所述的 检测试剂或试剂盒在用于裂叶基因连锁的kasp标记分型中的应用。
[0016]
根据本发明所述的应用，优选地，其包括以下步骤：
[0017]
(1)提取待测芥菜的基因组dna；
[0018]
(2)以步骤(1)中的dna为模板，加入特异的kasp引物，进行pcr 扩增；
[0019]
(3)pcr产物进行荧光检测分析；
[0020]
其中，所述kasp引物包含权利要求5所述的kasp引物。
[0021]
根据本发明所述的应用，优选地，步骤(2)包括构建含缓冲液和溶解于 所述缓冲液的多个引物组的反应体系的步骤，所述反应体系中各引物组的 第一正向引物、第二正向引物和反向引物的终浓度分别为0.1-0.5μmol/l、 0.1-0.5μmol/l、0.2-1μmol/l，还优选为0.1-0.4μmol/l、0.1-0.4μmol/l、 0.2-0.6μmol/l，进一步优选为0.12μmol/l、0.12μmol/l、0.3μmol/l。
[0022]
本发明的第四方面，提供根据第一方面所述的核酸或第二方面所述的 检测试剂或试剂盒在裂叶芥菜育种中的应用。
[0023]
本发明的kasp标记是根据核酸序列单碱基多态性(snp)设计的标记。 通过本发明开发的标记，通过pcr和荧光检测等方法就可以实现快速、有 效的检测，在裂叶芥菜分子标记辅助育种中具有广泛的应用前景。
附图说明
[0024]
图1示出了两个亲本的表型特征和构建f2分离群体的方法。a，b分别 是20jzs0233，20jzs0351的幼苗期。
[0025]
图2为f2群体中3种类型的叶片。
[0026]
图3为bsa初定位裂叶基因结果。
[0027]
图4为精细定位bjurco基因及开发裂叶基因连锁标记。
[0028]
图5为十个裂叶基因连锁的kasp标记分型效果图。
具体实施方式
[0029]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对 本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更 详细的描述。
[0030]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于 限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范 围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内 的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的 范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除 在范围内。
[0031]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述 领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方 法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等 同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公 开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时， 以本说明书的内容为准。
[0032]
除非另作说明，否则本发明中的基因位置或位点是指相对于芥菜 t84-66-v2版本基因组而言的位置。
[0033]
用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸
[0034]
本发明提供一种用于检测芥菜裂叶基因连锁的kasp标记的核酸，其包 含用于检测由多个snp位点组成的位点集的信息，其中所述位点集选自由 a10_18183785、a10_18413471、a10_18876551、a10_18911257、 a10_18930496、a10_18933850、a10_18962956、a10_19028312、a10_19184970和a10_19577069组成的组中至少两个位点，例如3、4、5、6、 7、8、9、10个位点所构成的位点集。需要说明的是，本发明的kasp标记 是位于裂叶基因上、下游区域紧密连锁的kasp标记。其中，kasp标记中 的a10_18933850和a10_18962956与裂叶基因共分离，是和芥菜裂叶性状连 锁最紧密的更加优选的多态性标记。优选地，裂叶基因的两侧和优选的标 记的距离为60kb。还优选地，所述标记位于存在于裂叶基因上游的gap区域 外。
[0035]
本发明中，裂叶基因是指定位到标记a10_18930496和a10_19028312之 间的127kb的区域。优选地，裂叶基因是指4个rco基因的同源的串联重复 基因区域中的任意一个基因。还优选地，裂叶基因是指bjuva10g32810、 bjuva10g32820、bjuva10g32840和bjuva10g32850中的任意一个基因。
[0036]
优选地，本发明所述核酸包括引物，所述引物由第一正向引物、第二 正向引物和反向引物三条引物组成，以检测位点集中的位点信息。还优选 地，所述引物的序列由seq id no.：1-30所示的序列组成。需要说明的是， 本发明的用于扩增上述标记的引物为用于kasp的引物，其通过pcr后，仪 器直接读取荧光来来判断样本分型情况，根据不同的荧光信号获得不同的 基因型，检测效率高，避免了酶切、酶切后电泳等繁琐的实验步骤。
[0037]
检测试剂或试剂盒
[0038]
本发明的检测试剂或试剂盒包括能够扩增多个snp位点组成的位点集 的核酸序列。可以理解，本发明的试剂盒进一步包括用于kasp的其他试 剂，所述试剂的实例包括但不限于：通用的荧光引物、内参染料、dna聚 合酶、dntp等。
[0039]
除了上述组分之外，本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式 与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试 剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地 设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。
[0040]
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，核苷酸)可提供为干 粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原 状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、 试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。 试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第 二容器的手段。
[0041]
在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如 水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含 量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存 的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或 使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
[0042]
在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单 独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包 含各多种组分的组合。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。
[0043]
应用
[0044]
本发明进一步提供检测试剂或试剂盒在用于裂叶基因连锁的kasp标 记分型中的应用，其包括以下步骤：
[0045]
(1)提取待测芥菜的基因组dna；
[0046]
(2)以步骤(1)中的dna为模板，加入特异的kasp引物，进行pcr 扩增；
[0047]
(3)pcr产物进行荧光检测分析，其中所述kasp引物包含本发明所述 的kasp引物。
[0048]
步骤(1)中，用于提取待测芥菜的基因组dna的方法不特别限定，可使 用本领域已知的方法进行，基因组dna提取方法可参考已知的教科书，例 如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。用于提取的芥 菜样本可以是叶用芥菜的任意部位，优选为叶片。
[0049]
步骤(2)中，基于多个snp位点组成的位点集信息，通过竞争性等位基 因特异性pcr进行待测芥菜基因组snp位点的检测。在具体实施方案中， 本发明通过将深裂叶池和锯齿叶池进行重测序和bsa分析，实现了裂叶基 因的初定位。重测序采用dna重测序，从而有利于发现更多的变异来开发 密度高的标记，以便于基因的精细定位。
[0050]
本发明进一步通过定位的a10染色体的候选区域，选取分布均匀的 snp位点进行kasp标记设计。优选地，候选区域是指a10_18930496和 a10_19028312之间的区域。还优选地，选择a10_18930496和a10_19028312 两个标记之间发生了染色体交换的单株进行后续研究。
[0051]
优选地，步骤(2)包括构建包含缓冲液和溶解于所述缓冲液的多个引物 组的反应体系的步骤。在具体实施方案中，所述反应体系中各引物组的第 一正向引物、第二正向引物和反向引物的终浓度分别为0.12μmol/l、 0.12μmol/l、0.3μmol/l。在使用前通过按规定比例稀释储存液后与其他成 分混合得到反应体系作为工作液。例如，可将各引物组中第一正向引物、 第二正向引物和反向引物的浓度制备为10μmol/l作为储存液。三种引物可 以制备为三种不同的储存液，也可将三种引物制备为同时含三种引物的同 一储存液。在构建反应体系时，可将第一正向引物溶液、第二正向引物溶 液和反向引物溶液以特定的体积比，例如1:1:2.5的体积比混合。
[0052]
本发明进一步提供根据本发明所述的检测试剂或试剂盒在裂叶芥菜育 种中的应用。
[0053]
本领域技术人员应理解，只要能够实现本发明的目的，在上述步骤(1)-(3) 前后，或步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本 发明所述的方法。
[0054]
实施例
[0055]
一、材料和方法
[0056]
1.植物材料和遗传分析
[0057]
通过一个裂叶的自交系20jsz0233(图1a)和一个锯齿叶的自交系 20jzs0351(图1b)杂交，产生一个f1杂合群体20jzh0073。其中一个f1单 株自交产生一个包含330个单株的f2群体20jzs0771。在第六片真叶期， 使用照相机对f2群体单株的叶片进行拍照观察，并且和叶片形状的标准品 进行比较。利用卡方检验，判定观测到的叶片形状的分离比是否符合孟德 尔分离定律。所有的植物材料均于2020年种植在中国农业科学院蔬菜花卉 研究所的南区温室。
[0058]
2.基于重测序的分离群体极端池分析(bsa-reseq)
[0059]
在本研究中构建了裂叶池和锯齿叶池两个极端混合池。每一个池分别 包含40个单株等量的叶片。使用ctab法提取极端混合池的dna。构建 四个dna文库包括两个亲本和两个极端池，送交天津诺禾致源公司进行二 代重测序。原始重测序数据利用软件fastp进行过滤，利用软件bwa将过 滤后的数据比对到芥菜的参考基因组t84-66-v1.5上，然后使用软件gatk 获取四个文库的snp和indel变异。以3mb的滑动窗口，300kb的步长计 算给定基因组中裂叶区域的平均变异指数。并计算两个极端池的变异指数 的差值(δvariation-index)。
[0060]
3.候选基因的精细定位和共分离的kasp分子标记的开发
[0061]
使用磁珠法提取f2群体330份单株的叶片的dna。在bsa-reseq定位 到的候选基因区间中，使用在两个亲本中有差异的snp位点及其上下游序 列和网页版软件premier3plus(http://www.primer3plus.com/)来设计kasp分 子标记，利用软件blast将设计的引物序列比对到芥菜的参考基因组 t84-66-v1.5上来确保序列的特异性。多态性标记用于进一步缩小裂叶基因 的定位区间。在两个亲本和f2群体间，使用设计的标记进行kasp基因分 型，pcr参照lgc公司(lgc,http://www.lgcgenomics.com/)推荐的方法。使 用成都瀚辰光翼公司的矩阵扫描仪进行pcr扩增后的荧光值读取和基因分 型。
[0062]
4.数据分析
[0063]
根据基因分型结果，计算kasp标记和裂叶性状之间的遗传距离，寻 找距离裂叶基
因最近的紧密连锁的两个标记，并且挑选出交换单株。利用 软件synorth(cheng et al.,2012)在芥菜基因组缩小的区间和拟南芥基因组之 间进行共线性基因分析。使用软件tbtools在芥菜参考组t84-66-v1.5和长 读长组装的芥菜参考基因组t84-66-v2之间进行共线性基因分析并进行结 果的可视化。最后，将裂叶基因连锁的kasp标记重新锚定到芥菜参考基 因组t84-66-v2上，明确标记在参考基因组t84-66-v2上的物理位置及与 裂叶基因的相对位置。
[0064]
二、实验结果
[0065]
1.f2群体中的裂叶基因的分离
[0066]
通过将裂叶芥菜20jzs0233和锯齿叶芥菜20jzs0351杂交产生的f1单 株自交，构建f2分离群体。从f2分离群体中选择有代表性的不同裂刻的叶 片，可以看出，叶片的裂刻程度的变化是连续的。但是，为了定位到调控 裂叶性状的主效基因，根据叶片顶端的不同裂刻程度将植株分为3个类型： 锯齿叶、半裂叶和深裂叶(图2)。按照以上标准，将f2群体中的单株划分为 不同的叶片类型。在330个f2分离群体单株中，我们辨识出79个深裂叶的 单株、164个半裂叶的单株和87个锯齿叶的单株。最后，经过卡方检验显 示，观测到的深裂叶芥菜数、半裂叶芥菜数和锯齿叶芥菜数的比率符合 1:2:1(χ2＝0.4,p＝0.82)分离比，符合孟德尔遗传定律。表明控制裂叶性状的主 效基因是一个不完全显性基因。f2分离群体中的裂叶性状的遗传分析如表2 所示。
[0067]
表2 f2分离群体中的裂叶性状的遗传分析
[0068][0069]
p值大于0.05被认为符合孟德尔遗传定律。
[0070]
2.裂叶基因的初定位
[0071]
将深裂叶池(图3a)和锯齿叶池(图3c)进行重测序和bsa分析，其中， 半裂叶类型的单株(图3b)不作为选择目标。将裂叶基因初定位到a10染色 体末端(图3d)。在对a10染色体放大的图中(图3e)，a10染色体的 18.1mb～19.5mb的区域峰值最高，并且几乎不发生同源染色单体交换。因 此，将裂叶基因定位到a10染色体的18.1m～19.5m的区域。
[0072]
3.精细定位裂叶基因bjurco及开发基因连锁标记
[0073]
在a10染色体18.1m～19.5m的候选区域，选取分布均匀的15个snp 位点设计15个kasp标记。其中，有10个多态性良好的标记，可以用于 缩小定位区间(表3，图5)。利用10个kasp标记对f2群体进行基因分型。 根据f2群体的基因分型结果结合表型测定的结果，将裂叶基因定位到两个 标记a10_18930496和a10_19028312之间的区域(图4a)，并且筛选出5株 在这两个标记之间发生了染色体交换的单株(图4b)以备后续的裂叶基因相 关研究分析。在参考基因组t84-66-v1.5上，两个标记之间的物理距离97kb， 共注释出13个基因(图4a)。通过芥菜基因组上这两个标记之间的区域和拟 南芥基因组进行共线性基因分析，有一个叶片形态建成的相关基因 lmi1(bjua040054)，其余12个基因的注释结果均未报道与叶片形态有关。 lmi1基因在碎米荠中的同源基因rco已被验证与叶缘裂刻有关(danielavlad,2014)。在芸薹属的甘蓝、油菜、芥菜中均有报道该基因的同源基因和 裂叶有关(heng et al.,2020；hu et al.,2020；zhang et al.,2021)。因此，认为控 制芥菜深裂叶的基因为
rco同源基因，命名其为bjurco基因。
[0074]
在10个标记中，有2个标记a10_18933850和a10_18962956和330个 f2单株的裂叶性状表现出共分离现象，并且分布在bjurco基因的两侧， 分型结果图如图4c和图4d所示。将亲本重测序数据的bjurco基因比对到 参考基因组t84-66-v1.5上，结果显示在bjurco基因的上游有一个gap， 是由于该区域的基因组没有组装完整导致(图4e)。为了填补gap，利用软件 tbtools在芥菜参考基因组t84-66-v1.5和芥菜参考基因组t84-66-v2之间 进行共线性基因分析。结果表明，gap区域在对应的芥菜参考基因组 t84-66-v2上，有4个注释的基因。其中，有3个基因是rco基因的同源 基因。该3个rco同源基因和原有的1个rco同源基因串联在一起，在 芥菜参考基因组t84-66-v2上，分别是bjuva10g32810、bjuva10g32820、 bjuva10g32840和bjuva10g32850(图4e)。bjurco基因是4个rco同源 基因中的一个。在参考基因组t84-66-v2上，标记 a10_18930496(chr10_18392805)和标记a10_19028312(chr10_18520435)之 间的距离为127kb。bjurco基因两侧和其共分离的标记之间的距离为60kb (图4f)。
[0075]
经过遗传分析和bsa基因初定位后，利用10个kasp标记结合共线性 基因分析，将芥菜的裂叶基因bjurco定位到4个rco同源的串联重复基 因中。并且，经过f2分离群体的验证，得到两个和裂叶基因共分离的kasp 标记：a10_18933850和a10_18962956。本研究定位裂叶基因bjurco和开 发10个裂叶基因连锁的kasp标记，将为裂叶芥菜育种工作提供极大的帮 助。
[0076]
表3十个kasp标记的30条引物名称及序列信息
[0077]
[0078][0079]
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不 限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可 对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应 基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。