一种紫草根内生菌及其筛选方法、培养方法与应用与流程

1.本发明涉及一种紫草根内生菌及其筛选方法、培养方法与应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.紫草根，是紫草科多年生草本植物新疆紫草新藏、假紫草或滇紫草的干燥根。紫草根的种类主要分为软紫草根和硬紫草根，软紫草根呈不规则的长圆柱形，多扭曲，主要包括内蒙紫草；硬紫草根呈圆锥形或圆柱形，扭曲，包括老条紫草、关紫草、常德紫草等；紫草根具有清热凉血、解读透疹、润肠通便、抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物、镇痛，镇静的功效；据报道，科学家初步证明了紫草根的抗结肠癌作用。
3.中国专利cn201910725295.1公开了一种提取分离紫草根有效成分的方法及其提取物在制备抑制结肠癌细胞生长药物中的应用，报道采用植物提取的方式公开了紫草根提取物具有抗结肠癌的功效，但是紫草根的抗结肠癌的功效来源仍然不明确，而且植物提取耗费大量紫草根药材，且植物种植时间周期长，受季节的影响较大，不利于具有抗结肠癌药物的生产。另外有研究表明，紫草根内生菌是与紫草根有互利共生关系的生态类群，可以促进宿主植物体的生长代谢，增强抗菌能力，是植物微生态系统的天然组成部分，但紫草根内大量的内生菌仍然未被发现。
4.因此，为了探究紫草根的抗结肠癌活性功效来源，减少植物提取的时间成本及不确定因素，本发明提供了一种紫草根内生菌及其筛选方法、培养方法与应用。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种紫草根内生菌，以紫草根为原料，通过培养基培养筛选，并经鉴定，明确紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，其菌种通过扩大培养，获取方式简单，缩短时间，能够广泛应用在制备抗结肠癌药物中。
6.为了实现上述目的，本发明包括如下技术方案：本发明提供了一种紫草根内生菌，所述紫草根内生菌为seq id no:1所示的核苷酸序列。
7.本发明提供了一种紫草根内生菌的筛选方法：以紫草根为原料，依次通过浸泡研磨、培养基培养筛选得到。
8.上述培养基培养包括lb液体培养基振荡培养、lb平板培养基倒置培养、lb固体培养基划线培养和lb液体培养基过夜培养。
9.本发明一种紫草根内生菌的具体筛选包括以下步骤：s1、清洗、研磨：将紫草根清洗、晾干，依次经75%乙醇、无菌水、5%次氯酸钠溶液浸泡，并分别浸泡3min，再用无菌水清洗3~4次，然后将紫草根切成1cm细段，后进行无菌研磨粉碎，获得紫草根粉；s2、lb液体培养基振荡培养：向紫草根粉内加入1ml无菌水混匀，移到5ml lb液体
培养基内，后置于摇床内进行振荡培养，培养温度为37℃，转速为180rpm，培养时间为2~6h，后静置5~10min，取100ul上层液体，使用 lb液体培养基稀释，得到菌体悬液；s3、lb平板培养基倒置培养：取100ul上述的菌体悬液涂布于lb平板培养基上，后倒置在37℃的培养箱内进行培养，培养24~48h；s4、lb固体培养基划线培养：在上述lb平板培养基上有细菌菌落长出时，选取形态和颜色不同的单菌落10个，后挑取至lb固体培养基上进行划线培养，并分别编号标记，经多次划线纯化；s5、lb固体培养基划线培养：将上述lb固体培养基内纯化的单菌落置于2ml lb液体培养基内进行过夜培养，培养温度为37℃，取菌液，得到紫草根内生菌的菌液，再将该菌液冷冻离心，获得紫草根内生菌菌种；s6、保藏：将上述含有紫草根内生菌的菌液置于50%的灭菌甘油中，使紫草根内生菌浓度为15~40%，置于-80℃冰箱进行保藏。
10.本发明还包括了菌株鉴定：取上述保藏在-80℃的紫草根内生菌菌种，按照体积比1%的接种量活化菌种至100ml lb液体培养基内，置于温度为37℃、转速为225rpm的摇床内振荡培养16h，再置于冷冻离心机内离心，收集菌种，采用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组总dna，采用细菌的16srdna通用引物27f/1492r，以提取的基因组为模板，经pcr扩增，后进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，再使用试剂盒进行胶回收，得到pcr产物，并进行基因测序，将pcr产物基因序列导入ncbi数据库进行blast序列相似性分析，确定该菌株的生物学分类为acidibacter ferrireducens strain（还原铁酸杆菌）。
11.上述pcr扩增的条件：依次经95℃变性1min、50~60℃退火30s、72℃延伸2~5min，循环35次。
12.上述1%琼脂糖凝胶电泳的条件：电压为180v，电泳时间为15~20min。
13.本发明还提供了一种紫草根内生菌的扩大培养方法，具体培养步骤如下：取上述保藏在-80℃的紫草根内生菌菌种，按照体积比1%的接种量活化菌种至100ml lb液体培养基内，置于摇床内进行扩大培养，培养温度为37℃，转速为225rpm，培养时间为12~24h，接着发酵培养液置于冷冻离心机内进行离心，离心温度为4℃，转速为2000~8000rpm，离心时间为5~12min，后去除上清液，后加入30ml的无菌pbs液体，再置于冷冻离心机内离心，去除上清液，使残留的发酵培养液清洗去除，得到紫草根内生菌菌株。
14.本发明提供的一种紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，可在制备抗结肠癌的药物中应用。
15.本发明提供的一种紫草根内生菌在制备抗人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15等的药物中应用。
16.本发明的有益效果：本发明以紫草根为原料，通过经浸泡研磨、培养基培养筛选，得到紫草根内生菌；经鉴定，本发明筛选得到的紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，具有较明显的抗结肠癌效果，具有潜在的药用价值；同时本发明筛选得到的紫草根内生菌能够进行扩大培养获得紫草根内生菌菌株，与紫草根植物提取相比，获取方式简单，缩短时间，同时减少植物栽培过程中受到的天气、地域等不确定因素的影响，降低成本，具有很好的经济效益。
附图说明
17.图1为本发明pcr产物的电泳检测图；图2为本发明pcr产物基因序列的blast序列比对图；图3为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116的增殖影响图；图4为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞dld1的增殖影响图；图5为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-15的增殖影响图；图6为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116的bcl2/bax比率图；图7为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞dld1的bcl2/bax比率图；图8为本发明紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-15的bcl2/bax比率图。
具体实施方式
18.为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
19.本发明所用的完全培养基配方：10%胎牛血清和90% rpmi1640培养基；所用的lb液体培养基配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，其余纯水；所用的lb固体培养基配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂10g，其余纯水；所用的lb平板培养基配方：每升培养基，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，琼脂10g，其余纯水。
20.实施例1
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筛选方法本实施例提供了一种紫草根内生菌的筛选方法：将紫草根用流动自来水清洗干净，使用滤纸吸干或晾干紫草根上的水分，先用经75%乙醇浸泡3min，再经无菌水浸泡三次，每次3min，接着再使用5%次氯酸钠溶液浸泡3min，最后使用无菌水清洗3~4次使消毒液彻底清洗干净，同时取最后一下清洗的无菌水作为对照，然后使用无菌剪刀将紫草根切成1cm左右的细段，后置于灭菌的研钵内进行研磨粉碎，加入1ml无菌水混匀，后移到装有5ml lb液体培养基的摇菌管内，后置于摇床内振荡培养，设置摇床温度为37℃、转速为180rpm，培养2~6h，取出，静置5~10min，取上层液体100μl，稀释成10-3
、10-6
、10-9
三个不同浓度的菌体悬液；取100μl上述不同浓度梯度的菌体悬液以及最后一下清洗的无菌水分别涂布于lb平板培养基上，每个设置三个重复，将涂布好的平板倒置在37℃的培养箱内进行培养，培养24~48h，当有细菌菌落长出时，选取形态和颜色不同的单菌落10个，后挑取至lb固体培养基上进行划线培养，并分别编号标记，经多次划线纯化后，挑取最后的单菌落置于2ml lb液体培养基内进行过夜培养，培养温度为37℃，取菌液，于50%的灭菌甘油中，使菌体浓度为15~40%，置于-80℃冰箱进行保藏。
21.实施例2
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单菌落菌种鉴定取实施例1中已保藏在-80℃冰箱内的菌种，按照体积1%的接种量活化菌种至100ml lb液体培养基内，置于摇床内振荡培养，设置摇床的温度为37℃、转速为225rpm，培养16h，培养后将菌液置于离心管内，经冷冻离心机内离心，收集菌种，采用基因组提取试剂盒提取该菌株基因组总dna，采用针对细菌的16srdna通用引物，以提取的基因组为模板，经95℃变性1min、50~60℃退火30s、72℃延伸2~5min进行pcr扩增，循环35次，pcr扩增结束后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，在180电压下电泳15~20min，电泳测试结果如图1所示，单菌落通过
16srdna通用引物成功扩增条带，表明单菌落是属于细菌种属，然后使用试剂盒进行胶回收，得到pcr产物，将pcr产物进行基因测定，获得检测序列，核苷酸序列如seq id no:1所示，碱基程度为1239bp，然后将得到的pcr产物基因序列导入ncbi数据库进行blast序列对比，对比结果如图2所示，搜索同源物种，知道最相似的种属，确定该菌株的生物学分类为acidibacter ferrireducens strain，相似性为97.82%。
22.细菌的16srdna通用引物序列为：上游引物：5
’‑
gagtttgatcactggctcag-3’（27f），下游引物：5
’‑
tacggctaccttgttacga-3’（1492r）。
23.经过上述菌株鉴定，本发明以紫草根为原料，经浸泡研磨、lb液体培养基振荡培养、lb平板培养基倒置培养、lb固体培养基划线培养、lb液体培养基过夜培养得到紫草根内生菌，该紫草根内生菌的核苷酸序列seq id no:1所示。
24.实施例3
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菌株的扩大培养方法取实施例1中已保藏在-80℃冰箱内的紫草根内生菌菌种，按照体积比1%的接种量活化菌种至100ml lb液体培养基内，置于摇床内进行扩大培养，设置摇床温度为37℃、转速为225rpm，培养12~24h，后将发酵培养液置于离心管内，使用冷冻离心机内进行离心，离心温度为4℃，转速为2000~8000rpm，离心时间为5~12min，后去除上清液，收集菌株，接着加入30ml的无菌pbs液体，再置于冷冻离心机内离心，去除上清液，使残留的发酵培养液清洗去除，得到紫草根内生菌菌株。
25.为紫草根内生菌的抗结肠癌活性鉴定，本发明将实施例3中得到的紫草根内生菌菌株使用无菌pbs液体配制成10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l不同梯度浓度的紫草根内生菌液体，置于4℃，备用。
26.实施例4
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抗结肠癌活性鉴定选用人结肠癌细胞，购买有人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15，其来源于中国科学院微生物研究所。
27.一、人结肠癌细胞的培养试验对人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15、人结肠癌细胞sw620分别进行传代培养数次后，每个细胞系均经下列处理：取对数生长期细胞3ml，加入0.2%胰酶消化2min，快速加入血清终止消化，移液枪吹打至细胞悬浮，将细胞悬浮液置于转速1000rpm的离心机中离心3~5min，去除上清液，收集细胞沉淀，加入无菌pbs液体，再置于转速1000rpm的离心机中离心5min，去除上清液，收集细胞沉淀，重复2次，得到细胞沉淀，接着向细胞沉淀中加入完全培养基，得到细胞悬液，轻轻混匀，分成6组以每孔6000个/100μl的细胞密度接种至96孔板，将接种好的细胞培养板放入37℃的5%二氧化碳培养箱培养12~16h，待细胞贴壁后，甩去完全培养液，使用无菌pbs液体清洗两次，加入100μl的完全培养液。
28.二、紫草根内生菌对人结肠癌细胞增殖影响试验采用上述实施例3中备用的10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l不同梯度浓度的紫草根内生菌液体分别为10mg/l紫草根内生菌组、20mg/l紫草根内生菌组、50mg/l紫草根内生菌组、100mg/l紫草根内生菌组、150mg/l紫草根内生菌组，以不加紫草根内生菌的液体作为阴性对照组，加紫草根内生菌梯度液体且添加dmso的液体作为dmso组，对上述的
每一种人结肠癌细胞系进行增殖影响试验；紫草根内生菌对上述的每个人结肠癌细胞系免疫如一下处理：将10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l不同梯度浓度的紫草根内生菌液、不加紫草根内生菌的液体分别取20μl，加入上述的6组96孔板板，每组液体设置6个复孔，然后分别置于37℃的5%二氧化碳培养箱培养24h，48h，72h，取这三个时间段的细胞，使用显微镜观察细胞生长状态，甩去完全培养液，使用无菌pbs液体清洗2次，再在每孔加入完全培养液100μl和5mg/ml的mtt溶液20μl，继续置于37℃的5%二氧化碳培养箱培养4h，甩去完全培养液，使用无菌pbs液体清洗两次，每个孔内再加入100ul二甲基亚砜，在37℃摇床震荡培养10min，后采用酶联免疫检测仪，在od490nm下检测各孔的吸光度值，计算人结肠癌细胞的存活率，所述生存率的计算方式如下：存活率=（紫草根内生菌组吸光度-dmso组吸光度）/（对照组吸光度-dmso组吸光度），通过上述的增殖影响试验，紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15、人结肠癌细胞sw620增殖影响试验的结果如下：1、紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116的增殖影响，结果如图3所示；2、紫草根内生菌对人结肠癌细胞dld1的增殖影响，结果如图4所示；3、紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-15的增殖影响，结果如图5所示；在图3、图4、图5中的*表示紫草根内生菌组与阴性对照组相比p小于0.5。
29.上述紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15、人结肠癌细胞sw620增殖影响试验及其试验结果发现，本发明筛选得到的紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，增加紫草根内生菌浓度，对人结肠癌细胞的存活抑制性增强，人结肠癌细胞的存活数量减少，抑制了人结肠癌细胞的生长增殖，当紫草根内生菌浓度达到100mg/l时，再继续增大其浓度，其对促进人结肠癌细胞的凋亡没有明显变化，故紫草根内生菌浓度为100mg/l时，对人结肠癌细胞的存活抑制性更强，另外，增加紫草根内生菌对人结肠癌细胞的结合时间，人结肠癌细胞的存活量也没有明显变化，因此，紫草根内生菌能够很好地抑制人结肠癌细胞的生长增殖，具有明显的抗人结肠癌细胞效果。
30.实施例5
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紫草根内生菌qpcr验证按照实施例4中紫草根内生菌对人结肠癌细胞增殖影响试验中添加mtt溶液之前的操作方式，在每孔加入完全培养液100μl进行培养细胞，将得到的各组细胞使用pbs清洗3次，加入1mltrizol，冰上反复吹打3~5min，再加入氯仿剧烈震荡30s，室温下放置10~15min，后置于4℃、12000rpm的冷冻离心机离心5~10min，吸取上层水相转移到ep管中，加入相同体积的异丙醇颠倒混匀，室温下放置10min，再置于4℃、12000rpm的冷冻离心机离心5~10min，去除上清液，将细胞沉淀室温干燥10~15min，再加入10~20μldepc水完全溶解，获取各组细胞的总rna，在冰上采用微量分光光度计快速检测提取的总rna浓度，将所提取的rna按照试剂盒进行反转录，得到各细胞的cdna，然后根据qpcr反应试剂盒，以得到的cdna为模板，使用bcl2、bax引物进行pcr扩增，计算bcl2、bax的表达量。
31.bcl2引物序列为：f：ggtggggtcatgtgtgtggr：cggttcaggtactcagtcatcc
bax引物序列为：f：cccgagaggtctttttccgagr：ccagcccatgatggttctgat通过上述的紫草根内生菌qpcr验证，紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15、人结肠癌细胞sw620的bcl2/bax比率的结果如下：1、紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116的bcl2/bax比率，结果如图6所示；2、紫草根内生菌对人结肠癌细胞dld1的bcl2/bax比率，结果如图7所示；3、紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-15的bcl2/bax比率，结果如图8所示；在图6、图7、图8中的*表示紫草根内生菌组与阴性对照组相比p小于0.5。
32.上述紫草根内生菌对人结肠癌细胞hct-116、人结肠癌细胞dld1、人结肠癌细胞hct-15、人结肠癌细胞sw620的qpcr验证及其bcl2/bax比率结果发现，本发明筛选得到的紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，增加紫草根内生菌浓度，对人结肠癌细胞的bcl2/bax比率减小，表明紫草根内生菌能够促进人结肠癌细胞的凋亡，能够抑制人结肠癌细胞的生长增殖，当紫草根内生菌浓度为100mg/l时，对促进人结肠癌细胞的凋亡能力更强，继续在增加紫草根内生菌浓度，人结肠癌细胞的bcl2/bax比率没有明显变化；因此，根据实施例5的qpcr验证及其bcl2/bax比率结果，进一步地表明，紫草根内生菌具有抗结肠癌活性，具有明显的抗人结肠癌细胞效果，同时也说明了，本发明的紫草根内生菌具有潜在的药用价值，可在制备抗结肠癌的药物中应用。
33.最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。