一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法与流程

一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法
技术领域
1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法。


背景技术：

2.在世界范围内，乳腺癌的发病率和死亡率居高不下。因此，探索有效的乳腺癌治疗药物 仍然十分重要。在这过程中，为抗癌药物的安全性和有效性测试提供重要参考结果的研究工 具的需求也越来越大。
3.传统上，可以使用动物模型和二维培养系统作为标准，检测抗癌药物对肿瘤的抑制作用。 然而，动物模型需要牺牲大量动物，不适合进行高通量抗癌药物筛选，而二维培养系统产生 的结果往往与临床结果相似性较低。由于三维培养系统可以模拟肿瘤微环境，正逐渐取代动 物和二维培养模型，用于筛选处于开发初期的抗肿瘤药物。研究表明，与二维培养的癌细胞 相比，三维模型中的癌细胞往往表现出更强的耐药性，可以解释实验与临床上药物反应的差 异。同时，扩大这项技术的应用范围也有益于减少为研究而牺牲的动物数量。
4.至2009年sato等首先使用小鼠肠道干细胞培育出肠类器官3d细胞模型起，3d培养 技术逐渐发展出多种培养方法。目前常规培养3d细胞有多种方法，包括微流体培养法、胶 原凝胶培养法、微载体珠法、支架基培养法和悬滴培养等。微流体培养法能够精细控制细胞 培养的微环境，但操作复杂，需要特定仪器与定制耗材；基于matrigel的3d培养模型主要 适用于肠类器官等培养，形成的3d细胞往往是非球形，也缺乏均匀性；微载体珠法操作相 对简单且培养基利用率较高，但形成的3d肿瘤细胞缺少中间坏死区等结构；在以固体支架 为基础的细胞培养系统中，支架可以促进细胞之间的增殖、细胞粘附和信号传导活动，但需 要特定支架，造价不菲；悬滴培养由于难以更换培养基，培养时间有较大限制。
5.专利cn 112760289 a公开了一种乳腺癌类器官专用培养基及3d培养方法。该培养基包 括基础培养基和特异性添加因子，培养方法包括：将分离的乳腺癌组织进行预处理后消化并 过滤，得到细胞沉淀；将细胞沉淀裂解，然后与matrigel胶混匀并接种，待混合胶凝固后加 入上述培养基，并于37℃、5％co2浓度下培养7～14天。该专利虽然得到了球形规则，且大 小较为均一的肿瘤类器官细胞球，但需要使用特制的培养基(需要添加特异性添加因子，还 包括重组蛋白)，培养基成本高，且操作复杂。
6.因此，本领域期待提供一种新的方法来培养3d乳腺癌细胞，尤其能显著提高3d乳腺癌 细胞培养效率、操作简单且成本较低的技术途径。


技术实现要素：

7.针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种3d乳腺癌细胞 的体外快速培养方法。本发明方法在现有的通用肿瘤细胞培养技术的基础上，对有关技术进 行改进，以适应对3d乳腺癌细胞的体外快速培养的需要，配合使用超低吸附细胞培
养板培 养细胞，实现3d乳腺癌细胞的体外快速培养。
8.本发明目的通过以下技术方案实现：
9.一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，包括如下步骤：
10.(1)复苏mcf-7贴壁细胞：将液氮储存的mcf-7细胞经解冻后加入完全培养基混匀， 得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液转移到培养皿中，放入二氧化碳培养箱培养；
11.(2)消化贴壁细胞：将步骤(1)培养后的细胞用pbs溶液清洗，然后加入消化液消化， 使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3d培养基，所得细胞混悬液转移到 超低吸附细胞培养板上，放入二氧化碳培养箱培养；
12.(3)3d细胞培养：每天观察细胞状态，每1～2天更换1/2的3d培养基，培养至显微镜 下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的mcf-7细胞球，确认3d乳腺癌细胞的 体外培养成功。
13.进一步地，步骤(1)中所述解冻程序为：立即放入37℃的水浴中，轻轻旋转小于1分 钟快速解冻细胞。
14.进一步地，步骤(1)中所述加入完全培养基混匀前，先加入适量预热的完全培养基，吹 打悬匀，以800r/min离心5～10分钟，去上清液。
15.进一步地，步骤(1)中所述二氧化碳培养箱培养的条件为：5％co2(v/v)，37℃，饱 和湿度。
16.进一步地，步骤(1)和步骤(2)中所述完全培养基是以dmem高糖培养基为基质配制 并包含：体积分数10％胎牛血清、1％双抗。进一步地，步骤(2)中所述pbs溶液清洗次数 为2次。
17.进一步地，步骤(2)中所述加入消化液消化的流程为：在培养皿侧面加入消化液，轻轻 摇动培养皿，以获得完全覆盖的细胞层，室温下静置2分钟。
18.进一步地，步骤(2)中所述离心是指以800r/min离心5～10分钟。
19.进一步地，步骤(2)中所述超低吸附细胞培养板为商品化产品(美国康宁公司)，其上 覆盖低细胞结合特性的生物材料，可以防止细胞粘附在表面，使细胞自发形成球体。
20.进一步地，步骤(2)和步骤(3)中所述3d培养基是以完全培养基为基质配制并添加 体积分数0.5％～2.0％的matrigel胶。
21.进一步地，步骤(3)中所述培养的时间为5～7天。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.(1)快速：支架基培养法和悬滴培养等3d细胞培养方法的培养时间均在14天或以上， 本发明提供的3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法可以把时间大大缩短至5～7天即可。
24.(2)简单：微流体培养法等操作繁琐并且容易污染，胶原凝胶培养法操作相对简单但需 要先在培养板上铺胶原凝胶并且培养基配方复杂，本发明提供的3d乳腺癌细胞的体外快速 培养方法，基于肿瘤细胞培养技术，操作与培养基配方都接近普通肿瘤细胞培养，简单易行。
25.(3)便宜：微流体培养法等方法需要特定仪器与定制耗材，造价不菲，本发明提供的 3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，采用商品化的超低吸附细胞培养板，可以大大降低实验 成本。
26.(4)本专利技术采用常规培养基(以完全培养基为基质配制并添加体积分数0.5％
后加入适量完全培养基以800r/min离心10分钟；去上清液，加入3d培养基(以完全培养基 为基质配制并添加体积分数2.0％的matrigel胶)，细胞混悬液转移到超低吸附细胞培养板上， 放入二氧化碳培养箱培养。
39.(3)3d细胞培养：每天观察细胞状态；每天更换1/2培养基。第5天可以显微镜下观 察到mcf-7细胞已经形成紧密的细胞球，大小相对均一，细胞间间隔不明显。
40.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)复苏mcf-7贴壁细胞：将液氮储存的mcf-7细胞经解冻后加入完全培养基混匀，得到细胞混悬液，然后将细胞混悬液转移到培养皿中，放入二氧化碳培养箱培养；(2)消化贴壁细胞：将步骤(1)培养后的细胞用pbs溶液清洗，然后加入消化液消化，使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3d培养基，所得细胞混悬液转移到超低吸附细胞培养板上，放入二氧化碳培养箱培养；(3)3d细胞培养：每天观察细胞状态，每1～2天更换1/2的3d培养基，培养至显微镜下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的mcf-7细胞球，确认3d乳腺癌细胞的体外培养成功。2.根据权利要求1所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述解冻程序为：立即放入37℃的水浴中，轻轻旋转小于1分钟快速解冻细胞。3.根据权利要求2所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述加入完全培养基混匀前，先加入适量预热的完全培养基，吹打悬匀，以800r/min离心5～10分钟，去上清液。4.根据权利要求3所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述二氧化碳培养箱培养的条件为：5％co2，37℃，饱和湿度。5.根据权利要求1～4任一项所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述完全培养基是以dmem高糖培养基为基质配制并包含：体积分数10％胎牛血清、体积分数1％双抗。6.根据权利要求1所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述pbs溶液清洗次数为2次。7.根据权利要求6所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述加入消化液消化的流程为：在培养皿侧面加入消化液，轻轻摇动培养皿，以获得完全覆盖的细胞层，室温下静置2分钟。8.根据权利要求7所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心是指以800r/min离心5～10分钟。9.根据权利要求6～8任一项所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述3d培养基是以完全培养基为基质配制并添加体积分数0.5％～2.0％的matrigel胶。10.根据权利要求9所述的一种3d乳腺癌细胞的体外快速培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养的时间为5～7天。

技术总结
本发明属于细胞培养技术领域，公开了一种3D乳腺癌细胞的体外快速培养方法。将液氮储存的MCF-7细胞经解冻后加入完全培养基混匀，然后转移到培养皿中放入二氧化碳培养箱培养；将培养后的细胞用PBS溶液清洗，加入消化液消化，使细胞脱落后加入完全培养基离心，去上清液，再加入3D培养基，转移到超低吸附细胞培养板上放入二氧化碳培养箱培养至显微镜下观察到形成大小均一，细胞间间隔不明显，紧密的MCF-7细胞球，3D乳腺癌细胞的体外培养成功。本发明培养方法基于肿瘤细胞培养技术，采用商品化的超低吸附细胞培养板，寻找到了显著提高3D乳腺癌细胞培养效率、操作简单且成本较低的技术途径。径。径。


技术研发人员：焦春伟 谢意珍 梁慧嘉 陈家明 邓初夏
受保护的技术使用者：广东粤微食用菌技术有限公司
技术研发日：2022.02.21
技术公布日：2022/5/25