来源欧洲芜菁ECD04的BraA08g039212E基因在根肿菌抗性改良中的应用

hortic sci,2012,81:184
–
190)。hatakeyama等人从“siloga”中克隆出crr1，而该位点存在两个抗病基因crr1a和crr1b。crr1a为主效基因，单独存在时只能对生理小种起到微效抗性作用；与crr2基因互作时，可以对根肿菌4号生理小种起到较强的抗性(suwabe k,tsukazaki h,iketani h,hatakeyama k,fujimura m,nunome t,fukuoka h,matsumoto s,hirai m.identification of two loci for resistance to clubroot(plasmodiophora brassicae woronin)in brassica rapa l.theor appl genet,2003,107:997
–
1002)。
6.植物具备先天免疫系统，分别为病原相关分子模式激发的免疫反应(pti)和效应蛋白激发的免疫反应(eti)。抗病基因中最大的基因家族为nbs-lrr(nucleotide-blinding site and leucine rich repeat)基因家族。cra和crr1均具备典型的tir-nbs-lrr结构域，属于nbs-lrr抗病基因家族。这一类抗病基因家族的功能通常具有专一性，针对某一或者一类生理小种具备强大的抗性。nbs-lrr基因家族发挥其功能往往需要lrr结构域识别病原效应因子从而激活植物的免疫反应(porter b w，paidi m，ming r，et al.genome-wide analysis of carica papaya reveals a small nbs resistance gene family[j].molecular genetics and genomics，2009，281(6)：609-626)，使得n端的tir/cc结构域去激活下游的免疫反应(meyers b c，kozik a，griego a，et al.genome-wide analysis of nbs-lrr-encoding genes in arabidopsis[j].the plant cell，2003，15(4)：809.)。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种来源欧洲芜菁ecd04的braa08g039212e基因在根肿菌抗性改良中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明以甘蓝型油菜j9707为转化受体，克隆并验证了一个对中国根肿菌4号优势生理小种具备有效抗性的基因braa08g039212e，提供了一个依托该抗性基因braa08g039212e，为通过分子标记辅助选择和基因工程方法改良油菜、白菜和甘蓝等芸薹属植物的根肿病抗性的育种方法。
[0008]
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0009]
本发明提供一种braa08g039212e基因在赋予根肿菌抗性中的应用，所述braa08g039212e基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。其中，seq id no.1所示核苷酸序列为gdna序列，包括启动子序列、基因全长序列、终止子序列，seq id no.2所示核苷酸序列为cdna序列。
[0010]
进一步地，所述braa08g039212e基因位于欧洲芜菁ecd04的a08染色体上，其物理位置为14863686-14873201。
[0011]
本发明还提供一种braa08g039212e基因在根肿病抗病育种中的应用，所述braa08g039212e基因通过转基因或转育途径用于芸薹属植物的根肿病抗病育种中的应用，所述芸薹属植物包括油菜、白菜、甘蓝或萝卜，所述braa08g039212e基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
[0012]
本发明还提供一种braa08g039212e基因及根据其所开发的标记在芸薹属植物分子标记辅助选择中的应用，所述芸薹属植物包括油菜、白菜、甘蓝或萝卜，所述braa08g039212e基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示。
[0013]
本发明还提供一种braa08g039212e基因的启动子的用途，用于调控braa08g039212e基因的表达，其序列如seq id no.4所示。
[0014]
本发明还提供一种用于扩增braa08g039212e基因全长的引物，包括如seq id no.5所示的正向引物和seq id no.6所示的反向引物。
[0015]
本发明还提供一种用于构建braa08g039212e基因遗传转化载体的引物，包括如seq id no.7所示的正向引物和seq id no.8所示的反向引物。
[0016]
本发明还提供一种用于braa08g039212e基因阳性检测的引物，包括如seq id no.9所示的正向引物和seq id no.10所示的反向引物。
[0017]
本发明还提供一种用于braa08g039212e基因rt-qpcr的引物，包括如seq id no.11所示的正向引物和seq id no.12所示的反向引物。
[0018]
本发明公开了以下技术效果：
[0019]
本发明公开了来源于欧洲芜菁ecd04的braa08g039212e基因对中国根肿菌4号生理小种具有抗性功能，包括该braa08g039212e基因抗病区间的精细定位和其在欧洲芜菁ecd04的a08染色体上的物理位置，并以甘蓝型油菜j9707为背景对其基因组序列进行克隆、遗传转化，从而验证braa08g039212e基因对根肿菌的抗病功能。本发明可以提供一种braa08g039212e基因对抗根肿菌病基础研究、抗病育种和分子标记辅助选择中的应用，通过该基因所在的定位区间去选育抗根肿菌的品种，从而缩短育种进程。
附图说明
[0020]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]
图1：本发明实施例中braa08g039212e基因在欧洲芜菁ecd04中的定位区间及其相应的物理位置。
[0022]
图2：本发明实施例中用于定位左区间5778标记的20s029重组单株接中国根肿菌4号生理小种表型图，h5r为阳性对照，h5s为阴性对照，r为抗病材料，s为感病材料。
[0023]
图3：本发明实施例中用于定位右区间jf07标记的18cz3886重组单株接中国根肿菌4号生理小种表型图，h5r为阳性对照，h5s为阴性对照，r为抗病材料，s为感病材料。
[0024]
图4：本发明实施例中braa08g039212e基因结构域标注。
[0025]
图5：ecd04和其他7个感病材料在braa08g039212e位点附近100kb内的ltr插入示意图。
[0026]
图6-12：ecd04和其他7个感病材料的braa08g039212e位点上游3000bp序列比对图。
[0027]
图13：ecd04和其他7个感病材料的braa08g039212e位点上游3000bp序列比对差异热图，a图为8个材料相互之间序列比对的覆盖程度；b图为8个材料相互之间在序列比对在a图覆盖程度上的差异性。
[0028]
图14：本发明实施例中braa08g039212e基因在改造过的pcambia3301(将bastar抗性改为hygr抗性)植物表达载体上克隆模式图。
[0029]
图15：本发明实施例中braa08g039212e基因从启动子到终止子pcr扩增后的琼脂糖凝胶图，m为1kb dna ladder，1-3为扩增目的条带，条带大小为8713bp。
[0030]
图16：braa08g039212e阳性克隆检测琼脂糖凝胶图，m为dl2000 dna marker，1-6为菌落pcr阳性检测条带，条带大小为711bp。
[0031]
图17：本发明实施例中braa08g039212e基因在甘蓝型油菜受体材料j9707中表达后接中国根肿菌4号优势生理小种表型图，control以j9707受体材料作为感病对照，grade 0、grade 1、grade 2分别为株系接中国根肿菌4号优势生理小种发病的三个等级，grade 0：主根与侧根完全不发病；grade 1：侧根发生根肿现象；grade 2：主根发生明显根肿现象。
[0032]
图18：本发明实施例中braa08g039212e转基因株系的两个株系检测目的基因琼脂糖凝胶图。a图为braa08g039212e-l1株系基因型；b为braa08g039212e-l2株系基因型。a，b图中，m为250bp dna ladder，n为阴性对照，p为阳性对照。
[0033]
图19：本发明实施例中braa08g039212e转基因株系的两个株系目的基因表达量rt-qpcr检测图。
具体实施方式
[0034]
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0035]
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0036]
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0037]
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
[0038]
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0039]
实施例1
[0040]
1、精细定位群体构建
[0041]
利用我国甘蓝型油菜常规品种华双5号(brassica napus，aacc，2n＝38)作为受体亲本(又称h5s)，欧洲芜菁ecd04(brassica rapa，aa，2n＝20)作为供体亲本，经过一次杂交和多次回交，并结合分子标记辅助筛选，将ecd04中抗根肿病位点pbba8.1导入到华双5号中，获得了bc1、bc2和bc3材料。后续经过4次自交，并结合分子标记筛选和田间抗病鉴定，成功培育出中国根肿菌4号生理小种抗病品种华双5r(又称h5r)，并得到了bc3f4群体。该群体在病区田间接菌呈现出抗病表型分离，故选用作精细定位群体。
[0042]
目前定位的区间位于欧洲芜菁ecd04的a08染色体的5778和jf07标记之间，物理位
置为14765289和14965054，区间大小为199.77kb。抗根肿病基因braa08g039212e位于该区间中，在a08染色体上物理位置为14863686-14873201(图1)。
[0043]
2、甘蓝型油菜株系接种体系
[0044]
室内接种使用的根肿菌，是中国根肿菌4号生理小种(季海雯,任莉,陈坤荣,徐理,刘凡,孙超超,李俊,刘胜毅,方小平.油菜根肿病病原主要生理小种和品种抗病性鉴定[j].中国油料作物学报,2013,35(03):301-306.)。根肿病抗病性室内接菌鉴定采用的温室菌土法接种(战宗祥，江莹芬，朱紫媛等.与位点pbba8.1紧密连锁分子标记的开发及甘蓝型油菜根肿病抗性育种[j].中国油料作物学报,2015,37(6):766-771.)。首先将冻存于-20℃的菌根置于室温下解冻后，用匀浆机将其磨碎，将菌根和风干的草炭土按1:20的比例混匀，混匀后的菌土放置于25℃黑暗环境下封存48h。播种时将种子播在菌土上并覆土，最后播种好的穴盘放在光照强度是200mmol
·
m-2
·
s-1
，光照/黑暗时间16/8h，温度为25/20℃(昼夜)的条件下进行培养。培养6周后从土中拔出植株，用水清洗根部后调查抗病表型。
[0045]
3、重组单株株系后代接菌表型验证
[0046]
重组单株接种表型鉴定过程中采取了“自交系接菌鉴定表型原则”，即在非病区种植实验对象群体，通过分子标记鉴定筛选出目标单株，再对其进行套袋自交，收获自交系种后，分系进行室内接菌。20s029和18cz3886是用于精细定位在5778标记到jf07标记区间的两个重组单株繁育的株系，将其后代接中国根肿菌4号生理小种后统计抗病表型，20s029后代144株全抗病，而18cz3886后代抗、感表型出现分离，分离比为19：30(图2，图3)。
[0047]
4、重组单株株系后代接菌基因型鉴定
[0048]
对20s029后代接菌后的全部抗病病材料中进行随机取72个单株，对18cz3886后代接菌从各表型中随机选取12棵单株，针对这些单株进行分子标记鉴定。
[0049]
用ctab法对待测样品进行基因组dna提取。
[0050]
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)鉴定定位区间标记基因型，纯合抗病记为b，杂合基因型记为h，纯合感病记为a。
[0051]
结果表明：20s029后代基因型在5778标记及其之前发生分离，而在5778标记之后为纯合抗病基因型(表1)，20s029后代接菌表型为144株全抗病，二者结合来看，该抗病位点定位区间在5778标记之后。18cz3886后代基因型在jf07标记及其之前是分离的状况，而在jf07标记之后为纯合感病基因型(表2)，18cz3886后代接菌表型分离比为19：30，二者相结合说明定位区间定在jf07标记之前。因此，抗病区间位于5778标记与jf07标记之间。
[0052]
表1 20s029自交后代接中国根肿菌4号生理小种基因型鉴定结果
[0053][0054]
注：纯合抗病记为b，杂合基因型记为h，纯合感病记为a，r表示抗病单株，s表示感病单株。
[0055]
表2 18cz3886自交后代接中国根肿菌4号生理小种基因型鉴定结果
[0056]
dna polymerase(南京诺唯赞生物科技公司)进行目的片段扩增。
[0071]
50μl反应体系：2
×
phanta max buffer 25μl、forward primer(10μm)2μl、reverse primer(10μm)2μl、dntp mix(10mm each)1μl、dna模板2μl、ddh2o 19μl。
[0072]
pcr反应条件：预变性95℃ 3min；变性95℃ 15s，复性55℃ 15s，延伸72℃ 8min，34个循环；72℃延伸5min；25℃ 5min。
[0073]
扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小预期为8713bp(图15)。
[0074]
对扩增出来的目的片段使用dna purification kit(天根生化科技有限公司)试剂盒进行pcr原液回收并测量纯化回收后目的片段浓度。
[0075]
酶切改造过的pcambia3301(将basta抗性改为hyg抗性)植物表达载体。
[0076]
酶切体系：buffer 6μl，质粒dna 50μl，ncoi fastdigest enzyme(s)1μl，eco91i fastdigest enzyme(s)1μl，ddh2o 2μl。
[0077]
将上述反应液离心混匀，置于37℃水浴锅中反应30min。反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶用dna purification kit(天根生化科技有限公司)试剂盒回收并测量浓度。
[0078]
使用clonexpress ii one step cloning kit(南京诺唯赞生物科技公司)将目的基因片段和酶切好的植物表达载体进行连接。
[0079]
将连接好的产物转入dh5α大肠感受态细胞：a.在冰上解冻克隆感受态细胞。b.取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min；c.42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。d.加入900μl lb培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250r/min)。e.将kana抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。f.5000r/min离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有kana抗性的平板上轻轻涂匀。g.37℃培养箱中倒置培养12-16h。
[0080]
单克隆阳性鉴定，在转化平板上挑取6个单克隆，于液体lb培养基中过夜培养。第二天直接吸取2μl菌液作为模板，进行阳性检测。
[0081]
阳性检测正向引物序列(seq id no.9)：5
’‑
catggtctacaaggttccatg-3’[0082]
阳性检测反向引物序列(seq id no.10)：5
’‑
tcttcgctattacgccagc-3’[0083]
菌液pcr 12μl反应体系：2
×
taq master mix(dye plus)6μl、forward primer(10μm)1μl、reverse primer(10μm)1μl、菌液2μl、ddh2o 2μl。
[0084]
菌液pcr反应条件：预变性95℃ 3min；变性95℃ 15s，复性55℃ 15s，延伸72℃ 30s，34个循环；72℃延伸5min；25℃ 5min。
[0085]
将pcr反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，条带在711bp为阳性单克隆(图16)，对于阳性克隆，直接将其转化好的dh5α菌液送往武汉擎科生物技术有限公司进行一代测序。
[0086]
选取测序结果与基因组序列完全一致的克隆子扩大培养，使用tianprep rapid mini plasmid kit(天根生化科技有限公司)提取质粒。将质粒体转化到农杆菌gv3101中，具体步骤如下：
[0087]
取gv3101感受态细胞于冰上融化。向100μl感受态细胞中加入500ng重组质粒。冰上放置5min，转至液氮中放置5min，37℃水浴5min，冰上5min，加入400μl无抗lb，28℃摇床孵育1小时。取100μl转化产物涂布于带有kana和gent的抗性lb平板上。29℃培养36-48h。
[0088]
8、将构建好的3301-hygr-212载体通过农杆菌介导的油菜下胚轴稳定遗传转化方
法转化至甘蓝型油菜j9707。
[0089]
9、将成功转入braa08g039212e基因的株系培养至t1代，进行接中国根肿菌4号生理小种处理，观察其根部抗病表型。
[0090]
把接菌后的株系表型分为三个等级，分别为grade 0：grade 1：grade 2(图17)。grade 0：主根与侧根完全不发病；grade 1：侧根发生根肿现象；grade 2：主根发生明显根肿现象。
[0091]
统计braa08g039212e的遗传转化所得株系l1和l2株系(2个独立转基因系)植株的抗病表型发现，l1株系接菌后表型分离比grade 0：grade 1：grade 2＝12：16：7，l2株系接菌后表型分离比grade 0：grade 1：grade 2＝9：16：7(表3)。
[0092]
表3 braa08g039212e转基因株系接“枝江”根肿菌表型分离比
[0093][0094]
对braa08g039212e转基因株系接种表型抗感分离情况进行卡方(chi-square)检验，l1株系x2＝1.67(x2《x
20.05
＝3.84),l2株系x2＝0.25(x2《x
20.05
＝3.84)，均符合3：1孟德尔分离定律。
[0095]
计算接菌后株系的发病率和病情相关指数，公式如下：
[0096]
株系发病率＝(感病株数/调查总株数)
×
100％
[0097]
株系病情指数＝[∑(各级病株数
×
相应级数)/调查总株数
×
最高级别值]
×
100％
[0098]
l1株系接菌后，发病率为65.70％，病情指数为42.90％；l2株系接菌后，发病率为71.80％，病情指数为46.90％(表4)。
[0099]
表4 braa08g039212e转基因株系接中国根肿菌4号生理小种的发病率以及病情指数
[0100][0101]
10、将接中国根肿菌4号生理小种的braa08g039212e转基因株系进行基因型鉴定。
[0102]
将l1和l2株系的样品用ctab法提取dna，用阳性检测引物。
[0103]
12μl pcr扩增体系，2
×
taq master mix(dye plus)6μl、forward primer(10μm)1μl、reverse primer(10μm)1μl、1μl、dna模板1μl、ddh2o 3μl。
[0104]
pcr反应条件：预变性95℃ 3min；变性95℃ 15s，复性55℃ 15s，延伸72℃ 30s，34
个循环；72℃延伸5min；25℃ 5min，最后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，711bp位置为目的条带(图18a，b)。
[0105]
统计l1和l2株系基因型结果，l1株系基因型分离比为26：9，x2＝0.04(x2《x
20.05
＝3.84)，l2株系基因型分离比为23：9，x2＝0.17(x2《x
20.05
＝3.84)，均符合3：1孟德尔分离定律(图18a，b)。
[0106]
11、braa08g039212e基因在l1和l2株系接菌后的表达情况
[0107]
使用super总rna提取试剂盒(普洛麦格(北京)生物技术有限公司)对l1和l2株系接菌后根部样品的总rna进行提取并进行rna浓度测量。
[0108]
根据样品rna的浓度，以rna含量1000ng为基准，用rnase-free ddh2o调整样品浓度使得rna进样总体积为16μl，加入4
×
gdna wiper mix，用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。
[0109]
在上述反应管中直接加入5
×
hiscript ii qrt supermix ii，用移液器轻轻吹打混匀，然后进行逆转录反应：50℃ 15min，85℃5s。此时就得到了l1和l2株系接菌后的cdna样品。
[0110]
rt-pcr分析braa08g039212e基因的表达量，利用ce design设计braa08g039212e基因的定量引物，定量引物序列如下：
[0111]
正向定量引物(seq id no.11)：5
’‑
tggctgctcaaaccttc-3’[0112]
反向定量引物(seq id no.12)：5
’‑
acctcaacctgcgacaa-3’[0113]
qpcr反应体系：qpcr sybr green master mix 11.8μl，f/r primer 0.6μl，模板cdna2μl，ddh2o to 15μl。
[0114]
qpcr反应程序：95℃ 5min，95℃ 10s，52℃ 20s，72℃ 20s，40个循环，溶解曲线阶段默认设置1。
[0115]
braa08g039212e在转基因株系中的表达情况，该基因在j9707受体材料中稳定表达并且转基因材料的相对表达量均比9707受体材料高(图19)。
[0116]
braa08g039212e基因能够在受体材料j9707中稳定表达，并且能发挥其抗病功能，赋予感病材料9707抗根肿菌的能力。
[0117]
braa08g039212e基因在根肿病抗性育种和分子标记辅助选择中的应用
[0118]
braa08g039212e基因作为nbs-lrr基因，使得油菜转基因材料获得更好的根肿病抗性，可以抵御中国根肿菌4号生理小种的侵染，有效保护根肿菌污染田块中油菜的产量。braa08g039212e除了对甘蓝型油菜有抗根肿效应，对其他农艺性状影响不大，表明该基因可以作为抗性基因通过转基因手段进行油菜、白菜和甘蓝等芸薹属植物的抗性育种。根据基因全长序列(包含上游序列和编码区)及与本基因连锁的其它序列所开发的标记进行的分子标记辅助育种，也可以大大加速根肿病抗性育种进程。
[0119]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。