用于食管鳞状细胞癌检测的特异性引物组、试剂盒及方法

1.本发明涉及用于食管鳞状细胞癌检测的特异性引物组、试剂盒及方法,属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.食管癌是一种具有高发病率、高死亡率及高复发率等特征的消化道肿瘤。据2020年全球癌症统计数据显示，食管癌发病率位居全球第七，死亡率位居第六位，是世界范围内严重威胁人类健康的高发恶性肿瘤之一。食管癌病理类型主要包括鳞状细胞癌和腺癌，在南非、东非、东亚等食管癌高发区，90％的病理类型为食管鳞状细胞癌。我国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家，由于我国人口基数大，病程进展迅速等因素，我国每年食管癌新发病例和死亡病例分别占据全球的53.7％和55.7％左右，给我国带来了严重的疾病负担。随医学技术的快速发展在食管癌治疗方面虽取得一定改善，如开胸手术到微创食管癌手术，再到免疫抑制治疗等，但患者5年生存率仍低于15％。目前，对于食管鳞状细胞癌的术后高复发及高转移也仍缺少有效的控制手段。因此，阐明食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制，寻找调控食管鳞状细胞癌发生、侵袭转移及凋亡的新靶点，在此基础上构建最优早期筛检体系，制定靶向干预策略有望，为食管鳞状细胞癌治疗带来新的选择。
3.环状rna(circular rna，circrna)是一类具有共价闭合结构的非线性非编码rna，既无5’端帽子也无3’端polya尾巴结构，其稳定性超过其他线性rna分子，且不易被rna核酸外切酶和rna酶降解，从而使其具有高度的保守性、稳定性及组织特异性。近年来，circ rna与癌症的关系已成为癌症研究领域的重点问题，数百个circ rna已被证明包括食管鳞状细胞癌在内的各种人类癌症中异常表达，主要在mirna分子海绵，调控宿主基因表达，调控可变剪接等方面发挥作用，进而参与调控肿瘤细胞增殖、上皮间充质转化、肿瘤细胞侵袭和转移。但目前，大部分circrna在食管细胞癌变过程调控作用尚不清晰，又因其缺少开放阅读框，缺少蛋白翻译能力，致使蛋白质印迹检测其体内外表达水平受限。因此，进一步系统挖掘食管鳞状细胞癌中发挥作用的circ rna，设计其特异性检测引物及检测试剂盒，为环状rna表达规律分析提供方法和基础，在临床医学中可用于检测包括食管鳞状细胞癌在内肿瘤样品癌基因的表达情况，并为临床应用带来新的视角和方向。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种食管鳞状细胞癌hsa_circ_0063865检测的特异性引物组、试剂盒及方法,主要解决包括食管鳞状细胞癌在内肿瘤样品检测癌基因的表达情况。
5.本发明的第一个方面提供了一种食管鳞状细胞癌hsa_circ_0063865环状结构组成及特异性引物。
6.优选地，环状rna hsa_circ_0063865，其是一种环状rna，位于染色体22q13.31位点的一种原癌基因；
7.优选地，环状rna hsa_circ_0063865具有rnase r耐受性和内源稳定性；
8.优选地，所述环状rna hsa_circ_0063865特异性引物组主要在包括肿瘤在内的表达水平检测应用，其特征在于所述应用产品包括试剂、试纸、芯片、试剂盒。
9.优选地，所述试剂盒含有能扩增出环状rna hsa_circ_0063865的引物，所述引物的碱基序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
10.优选地，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
11.优选地，本发明还提供了一种检测食管组织样本hsa_circ_0063865的方法,包括以下步骤：
12.1)采集食管鳞状细胞癌癌组织和癌旁组织(距癌组织》5cm)，并对组织样本进行处理，提取组织rna；
13.2)使用mmlv逆转录酶对步骤1)组织rna逆转录成cdna；
14.3)根据hsa_circ_0063865特异性引物对步骤2)cdna进行rt-qpcr扩增，收集荧光，计算熔解曲线；
15.4)以β-actin为内参基因，根据步骤3)所得δct值，并按照δct值越大，表明实际表达量越低原则，进行配对t检验统计学分析，并计算差异倍数。
16.本发明的第二个方面提供了一种hsa_circ_0063865促进剂，所述用途包括但不局限于hsa_circ_0063865在各种细胞模型及动物模型的功能验证。
17.优选地，所述促进剂在验证hsa_circ_0063865对食管鳞状细胞癌细胞增殖，迁移及侵袭功能中的应用；
18.优选地，所用食管鳞状细胞癌细胞是在含100nmol/l微囊藻毒素(mc-lr)+100nmol/l甲基苄基亚硝胺(nmbza)培养基对het-1a进行35代染毒形成的t-het-1a细胞。
19.本发明的优点和有益效果
20.本发明发现hsa_circ_0063865在食管鳞状细胞癌及癌组织的差异表达，并通过构建hsa_circ_0063865过表达细胞模型，验证其在食管鳞状细胞癌细胞中的功能，发现了过表达hsa_circ_0063865促进食管鳞状细胞癌细胞增殖、侵袭及迁移等肿瘤细胞生物学表型。在此基础上提供了一种用于食管鳞状细胞癌hsa_circ_0063865检测的特异性引物组、试剂盒及方法,为环状rna表达规律分析提供方法和基础，在临床医学中可用于检测包括食管鳞状细胞癌在内肿瘤样品癌基因的表达情况，并为临床应用带来新的视角和方向。
21.下面结合附图和具体实施方式进一步详细说明，以使本发明公开的各个方面及其优势显而易见，从而更容易被理解，并非对本发明的限制。凡依照本发明公开内容进行的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
22.图1为hsa_circ_0063865的生物合成及结构示意图；
23.图2为hsa_circ_0063865 cdna和dna pcr产物凝胶电泳图及divergent和convergent引物pcr扩增产物sanger测序结果图；
24.图3为食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织hsa_circ_0063865差异表达水平；
25.图4为hsa_circ_0063865细胞内rnase r耐受性及内源稳定性检测；
26.图5为稳转het-1a中hsa_circ_0063865表达水平；
27.图6为微囊藻毒素和亚硝胺联合染毒hsa_circ_0063865过表达het-1a细胞35代平
板克隆实验、软琼脂克隆实验及裸鼠皮下移植瘤解剖结果图；
28.图7为hsa_circ_0063865促进剂调控细胞增殖、侵袭及迁移结果图；
29.图8为hsa_circ_0063865促进剂在裸鼠皮下移植瘤细胞增殖能力及转移能力结果图。
具体实施方式
30.结合实施例对本发明作进一步详细说明，可以理解为该实施例仅为解释本发明的内容。但需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
31.实施例1：普通pcr扩增验证hsa_circ_0063865引物组特异性
32.1、hsa_circ_0063865特异性引物设计
33.1)针对hsa_circ_0063865接口序列设计pcr divergent与convergent引物，设计原则如图2a；
34.2)divergent包括d-hsa_circ_0063865-f和d-hsa_circ_0063865-r引物，d-hsa_circ_0063865-f的核苷酸序列为cctcagatgtaaagtgttatgaccagc(seq id no.2)d-hsa_circ_0063865-r的核苷酸序列aatgcatagaagggcaaatccatgatc(seq id no.3)；
35.3)convergent包括c-hsa_circ_0063865-f和c-hsa_circ_0063865-r引物，c-hsa_circ_0063865-f的核苷酸序列为ctgaggcggaggaaccctaagg(seq id no.4),c-hsa_circ_0063865-r的核苷酸序列agcatcccagcaccaaatacagac(seq id no.5)；
36.2、食管鳞状细胞癌组织样本dna提取
37.1)在经东南大学医学伦理委员会批准，患者/家属知情同意后，选取2009-2012年于江苏省淮安市第一人民医院诊断为食管鳞状细胞癌的患者96例，共收集96例癌组织及对应癌旁组织；
38.2)剪取约0.05cm3的组织放入1.5mlep管，加入50μl pbs，使用组织研磨器将组织打碎制成匀浆；
39.3)12000
×
g离心1min，去上清，后续步骤按照组织基因组dna提取试剂盒(dp304)说明书进行；
40.4)取1μl dna样品于紫外分光光度计检测其浓度和纯度，所得dna样品a260/a280比值均在1.6-1.8之间。
41.3、食管鳞状细胞癌组织样本rna提取及逆转录
42.1)取上述96例癌组织及对应癌旁组织各0.1cm3，剪刀剪碎后放入1.5ml ep管，加入1ml trizol、3颗研磨钢珠，70hz研磨10min(研磨盒提前预冷)，后续按照trizol试剂常规提取步骤进行操作；
43.2)取1μl rna样品于紫外分光光度计检测其浓度和纯度，所得rna样品a260/a280比值均在1.8-2.0之间。
44.3)使用mmlv逆转录酶将rna逆转录成cdna，逆转录反应体系及条件如下：
45.rna1μgrandom primer1μl补无酶水至15μl
46.反应条件：70℃，10min，冰浴2min。
[0047][0048][0049]
反应条件：37℃反应60min，90℃10min，4℃保持。
[0050]
4、普通pcr扩增：反应体系如下
[0051]
dna(cdna)模板1μg2.5mm dntp4μl10
×
la pcr buffer ii(mg2+plus)10μl上、下游引物各1μltakara la taq0.5μl补水至50μl
[0052]
反应条件：94℃预热5min，94℃30s，60℃30s，72℃30s，反应35个循环，72℃延伸10min。
[0053]
5、pcr产物琼脂糖凝胶电泳
[0054]
1)量取100ml 1
×
tbe溶液，加入3g琼脂粉，微波炉加热后向溶液中加入5μl gelred，摇晃均匀，将溶液倒入准备好的制胶器中，室温冷却30min；
[0055]
2)将pcr产物与6
×
loading buffer按照5:1混匀加入胶孔中；
[0056]
3)90v电泳10min，之后110v电泳，至溴酚蓝指示线跑过整胶2/3位置，结束电泳，紫外线下观察条带并拍照；
[0057]
4)基于3)中pcr产物，使用普通凝胶dna回收试剂盒操作进行回收；
[0058]
5)凝胶回收产物sanger测序在abi 3730测序仪完成。
[0059]
6、实验结果与分析
[0060]
依据circrna的逆转录cdna使用convergent和divergent引物均可以进行pcr扩增，而dna则只能使用convergent引物进行pcr扩增的原理。使用circrna的cdna使用hsa_circ_0063865-divergent引物扩增产物进行sanger测序，结果显示扩增产物条带单一(图2-b)，无杂峰，扩增产物与hsa_circ_0063865接口序列一致(图2-c)。
[0061]
实施例2：hsa_circ_0063865检测试剂盒在食管鳞状细胞癌中的应用
[0062]
该试剂盒主要包括hsa_circ_0063865特异性引物d-hsa_circ_0063865-f和d-hsa_circ_0063865-r、阴性对照cdna、阳性对照cdna、实时荧光定量检测试剂及检测说明书。
[0063]
实时荧光定量pcr检测方法如下：
[0064]
1、基于实施例1逆转录而成cdna和divergent引物组配置如下反应体系：
[0065]
cdna1μl
sybr green mix5μlplus solution1μl上、下游引物各0.6μl补水至10μl
[0066]
2、rt-qpcr反应条件为：94℃预热5min，94℃30s，60℃30s，反应40个循环，每个循环60℃时收集荧光，60℃～95℃升温，收集荧光，计算熔解曲线。
[0067]
3、数据处理与分析
[0068]
待检样本hsa_circ_0063865表达水平通过其ct值与内参β-actinct值法进行计算得出δct，δct值越大，表明实际表达量越低。通过spss进行t检验，以p《0.05为差异存在统计学意义。
[0069]
4、实验结果与分析
[0070]
在该队列食管鳞状细胞癌患者癌组织hsa_circ_0063865表达水平明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(结果见图3)，提示hsa_circ_0063865可能是食管鳞状细胞癌发生发展过程一重要分子靶点。
[0071]
实施例3 hsa_circ_0063865耐受性及稳定性检测
[0072]
1、rnase r耐受性试验
[0073]
选取培养的het-1a细胞，使用trizol法提取细胞总rna，进行rnase r耐受实验，实验步骤如下：
[0074]
1)取4μg细胞总rna，加入0.6μl rnaser(20u/μl)，加入1μl 10x reaction buffer，补水至10μl，吹打混匀；
[0075]
2)于梯度pcr仪上37℃反应10min，70℃灭活10min；
[0076]
3)取1μl反应产物进行rt-qpcr，检测样品中hsa_circ_0063865及线性内参基因表达情况。
[0077]
2、放线菌素d抑制试验
[0078]
1)使用无菌水将actinomycin d稀释为1mm，-20℃保存备用；
[0079]
2)按照4μl/ml向细胞培养基中加入稀释好的actinomycin d溶液，使用该培养基培养细胞；
[0080]
3)收集染毒0、1h、4h、8h、12h、24h、48h的细胞，提取细胞总rna，利用rt-qpcr检测样品中hsa_circ_0063865及线性内参基因表达情况。
[0081]
3、实验结果与分析
[0082]
rnase r耐受实验结果显示，hsa_circ_0063865相比较于线性rna具更好的稳定性，rnase r消化之后线性rna几乎全被降解(4a)；使用放线菌素d处理细胞0、4、12、24h以抑制rna合成，结果显示hsa_circ_0063865在rna合成被抑制24h后降解不超过20％，作为对照的线性rna则降解超过了80％(4b)。
[0083]
实施例4 hsa_circ_0063865参与亚硝胺联合藻毒素致食管癌恶性转化
[0084]
1、构建hsa_circ_0063865过表达细胞模型
[0085]
在前期已构建的hsa_circ_0063865过表达载体基础上，进行hsa_circ_0063865过表达慢病毒包装。将3
×
106个293t细胞接种于直径10cm的培养皿，待细胞生长至50～70％融合率时即可用于质粒转染；取10μg hsa_circ_0063865过表达质粒、6.6μgpmdlg/prre质
粒、2.4μgprsv-rev质粒以及3.6μg pmd2g质粒，加培养基稀释至100μl，吹打混匀，室温静置5～10min；取44μl2000，加56μl2000，加56μl培养基吹打混匀，室温静置5～10min；将上述两种混合液混合，吹打混匀，室温静置20min；将上述脂质体-质粒混合物加入5ml培养基吹打混匀；去除293t细胞培养基，pbs清洗两遍，将稀释的混合液全部加入293t细胞培养皿，培养六小时后更换正常含10％血清无双抗培养基培养，24小时后更换完全培养基，一定时间后收获病毒并进行病毒滴度测定。
[0086]
2、hsa_circ_0063865参与亚硝胺联合藻毒素致食管癌恶性转化
[0087]
1)细胞染毒恶性转化：取hsa_circ_0063865过表达(hsa_circ_0063865
high
)及hsa_circ_0063865过表达对照(over-nc)het-1a细胞在含100nmol/l mc-lr+100nmol/l nmbza培养基对其染毒35代，观察并分析hsa_circ_0063865在恶性转化过程中发挥的作用。实验分为处理组和对照组，对照组在培养基中加入相同计量的dmso溶液。
[0088]
2)平板克隆实验：取对数增长期细胞，使用0.25％胰酶消化离心制备单细胞悬液，按照2
×
102/孔密度将细胞种入六孔板，正常培养，隔天观察细胞克隆生长情况，培养2周后将细胞取出，使用结晶紫染色，拍照计数＞50个细胞的克隆，计算克隆形成率。
[0089]
3)软琼脂克隆实验：配制100ml 1.2％和0.7％的琼脂、含20％血清及2
×
抗生素的dmem培养基；按1：1的比例混合1.2％琼脂和配制好的2
×
培养基，将1.5ml混合液迅速加入六孔板，室温静置至胶凝固备用；取对数期生长细胞，0.25％胰酶消化后用2
×
培养基调整浓度至8
×
102/ml，将细胞悬液与0.7％琼脂溶液混匀，迅速滴加在配好的下层胶上，每孔加入1ml，待上层胶凝固，将细胞放入含5％co2培养箱37℃培养3周；间隔三天补加200μl含10％fbs培养基；隔天观察克隆生长情况，培养结束后在显微镜下观察计数克隆形成情况，计数＞50个细胞的克隆，计算克隆形成率。
[0090]
4)裸鼠皮下成瘤实验：在经东南大学动物伦理委员会批准，选用3-4周龄，spf级，balb/c nude crlj雄性裸鼠进行后续实验。取指数增长期has_circ_0006867
high
、over-nc组het-1a-t种板，制备细胞密度为4
×
107/ml单细胞选悬液，加入等体积的matrigel胶；每只裸鼠左腋皮下注射200μl细胞悬液；并每日观察接种后皮下肿瘤生长情况，待出现肿瘤后，每隔3天测量一次，瘤体生成两周后停止饲养，采用颈椎脱臼法处死，取出皮下移植瘤测量肿瘤大小并拍照记录。
[0091]
5)结果显示：hsa_circ_0063865稳转过表达细胞中hsa_circ_0063865表达显著升高，表达是对照细胞的432.69倍(图5)，染毒35代时hsa_circ_0063865过表达细胞克隆数高于对照细胞(图6a)，hsa_circ_0063865过表达染毒细胞形成克隆数目显著高于对照(图6b)，对解剖下来的移植瘤进行体积比较，结果显示hsa_circ_0063865过表达细胞移植瘤体积显著高于对照(图6c)。提示hsa_circ_0063865作为一原癌基因在食管癌发生过程中发挥至关重要应用。
[0092]
实施例5过表达hsa_circ_0063865对食管鳞状细胞癌细胞生物表型影响
[0093]
1)hsa_circ_0063865过表达细胞模型构建：使用hsa_circ_0063865过表达质粒及干扰对照慢病毒转染het-1a-t，使用嘌呤筛选获取hsa_circ_0063865
high
、over-nc细胞株。
[0094]
2)细胞增殖能力检测：以1
×
104/孔细胞接种于96孔板，待细胞长至50％融合度时进行edu孵育2h，后续步骤按照beyoclick
tm edu细胞增殖检测试剂盒说明书进行；最后使用
pbs清洗两遍，每次5min；弃掉清洗pbs，每孔加入50μl新的pbs，荧光显微镜下观察拍照；每孔随机选取5个视野拍摄，计算绿色细胞(增殖细胞)、蓝色细胞(总细胞)数目。
[0095]
3)细胞侵袭能力检测：取对数增长期细胞进行铺板，待细胞融合度70％为宜，将-20℃matrigel基质胶放于4℃冰箱溶解，另将transwell小室放入4℃冰箱预冷；按照1:9的比例使用无血清培养基稀释基质胶，将稀释好的基质胶加入小室，每个小室加50μl；将小室放入37℃培养箱中加热1h，使基质胶凝固，取出小室，吸去上层未凝固液体；消化收集细胞，使用无血清培养基制备单细胞悬液，按照5
×
105/孔，将细胞加入小室内，下室加入600μl含50％fbs的完全培养基；培养24h后，取出小室，用棉签擦去未穿膜的细胞及基质胶，甲醇固定风干后使用0.1％结晶紫进行染色；显微镜下观察，每个小室随机选取5个视野拍照，统计穿膜细胞数。
[0096]
4)细胞迁移能力检测：使用8μm孔径transwell小室进行细胞迁移能力检测，取指数增长期细胞，经胰酶消化制备单细胞悬液，每个小室接种5
×
104细胞，小室上室加无血清培养基补足200μl，下室加入600μl含20％fbs完全培养基。常规培养24h后取出小室，使用枪头吸掉小时残余的液体，用棉签转动擦掉小室内侧为穿过的细胞，使用甲醇浸泡10min，取出小室，待膜自然风干后，使用0.1％结晶紫染液染色，常温染色15min，使用pbs淋洗，自然风干后放回24孔板。显微镜下观察，每个小室随机选取5个视野拍照，统计穿膜细胞数。
[0097]
5)裸鼠移植瘤中hsa_circ_0063865功能分析：于实施例4第4步)获得的裸鼠皮下移植瘤切片。采用免疫组化常规操作步骤进行，所述抗体为裸鼠皮下移植瘤增殖相关基因pcna抗体，裸鼠皮下移植瘤迁移相关基因e-cadherin抗体。
[0098]
6)结果显示：在het-1a-t中hsa_circ_0063865过表达促进了迁移(图7a)，侵袭(图7b)能力，并促进细胞增殖(图7c)。使用免疫组化检测皮下移植瘤中pcna表达，结果显示hsa_circ_0063865过表达细胞中pcna表达显著高于对照(图8a)，细胞中e-cadherin表达显著低于对照(图8b)，提示hsa_circ_0063865在食管鳞状细胞癌发生发展过程中具有重要作用。基于此，本发明涉及到的试剂盒及检测方法可对包括食管鳞状细胞癌在内的肿瘤hsa_circ_0063865的表达进行定量，阐明hsa_circ_0063865在肿瘤发生发展过程中表达规律，并为临床应用带来新的视角和方向。
[0099]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0100]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。