在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法与流程

本技术涉及丙酮酸氧化酶制备，尤其涉及在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法。

背景技术：

1、丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase,pox)是一种四聚酶，属于焦磷酸硫胺素依赖酶，它能催化丙酮酸氧化的脱羧氧化反应，同时需要焦磷酸硫胺素(thdp)作为辅因子(muller y,schulz g.structure of the thiamine-and flavin-dependent enzymepyruvate oxidase[j].science,1993,259(5097):965-967.)。丙酮酸氧化酶由四个亚基构成，亚基分子量为68kda。目前发现的编码pox基因主要分两类，第一类来自大肠杆菌，是需氧呼吸链中的一种外膜黄素蛋白(weidner a,neumann p,pech a,et al.new insightsinto the membrane-binding and activation mechanism of pyruvate oxidase fromescherichia coli[j].journal of molecular catalysis b enzymatic,2009,61(1-2):88-92.)；第二类是来自野生型的植物乳杆菌和绿色气球菌，其单体由3个部分组成，分别命名为core、fad、thdp结构域(juan e c m,hoque m m,hossain m t,et al.the structuresof pyruvate oxidase from aerococcus viridans with cofactors and with areaction intermediate reveal the flexibility of the active-site tunnel forcatalysis.[j].acta crystallographica,2007,63(pt 11):900-907.)。每个亚基的核心支架包含六个平行的被α-螺旋包围的β折叠。二聚体的2个亚基通过晶体学双重对称性关联在一起，一个亚基的thdp域的残基及其相邻亚基的core域的残基构成活性位点。另一个二聚体再次通过晶体学双重对称性关联在一起，完整的四聚体呈222对称。它能在磷酸盐和氧分子存在时,催化丙酮酸脱羧生成乙酰磷酸、co2和h2o2。然后利用过氧化酶催化h2o2和4-氨基安替比林生成红色醌类化合物(fossati p,prencipe l,berti g.enzymic creatinineassay:a new colorimetric method based on hydrogen peroxide measurement.[j].clinical chemistry,1989(8):654.)，其显色机制可用于丙酮酸、丙酮酸激酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、无机磷、唾液酸、唾液酸激酶以及尿素的检测，是重要的医用试剂酶,广泛应用于临床生化检验中(lu,j,zhao,et al.high-level expression ofaerococcus viridansaerococcus viridans pyruvate oxidase in escherichiacoliescherichia coliby optimization of vectors and induction conditions[j].letters inapplied microbiology,2018.)。还可应用于各种发酵生产中做生物传感器，丙酮酸是发酵生产的重要的代谢中间产物，对其定时检测具备较高生产指导意义和经济效益，基于pox的生物传感器还可用于快速检测环境中对水栖化物有害的磷酸盐(nelson tj,kaufman s.two enzymatic methods for determination of the phosphate contentof phosphoproteins.[j].analytical biochemistry,1987,161(2):352-357.)，因此开发具有活性的丙酮酸氧化酶具有重要的实践意义和应用前景。

2、尽管丙酮酸氧化酶具备可观的市场需求和应用前景，但是市场上商品化的丙酮酸氧化酶主要来源于野生型的植物乳杆菌和绿色气球菌，存在产量低，纯度工艺效率低，生产成本高等问题，不能满足中国市场日益增长的需求。

技术实现思路

1、本技术实施例的目的在于提出一种在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法，表达的丙酮酸氧化酶有产量高、生产周期短、活性高，能够工业化生产。

2、为了解决上述技术问题，本技术实施例提供一种在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法，采用了如下所述的技术方案：

3、一种在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法，包括下述步骤：

4、获取绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列seq id no:2，通过大肠杆菌同义密码子优化所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列，构建绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒；

5、将所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒转化至大肠杆菌；

6、挑取所述大肠杆菌中单克隆进行扩大培养和诱导表达，获得表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液；

7、对所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液进行纯化操作，获得绿色气球菌丙酮酸氧化酶。

8、进一步的，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21(de3)。

9、进一步的，所述通过大肠杆菌同义密码子优化所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列，构建绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒的步骤包括：

10、将获取的绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列，经大肠杆菌同义密码子偏好性优化后，连接载体为pet-28a(+)，c端融合表达(his)6标签,合成所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒。

11、进一步的，所述通过大肠杆菌同义密码子优化所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列，优化后的碱基序列seq id no:1为：

12、atgagcgataacaaaattaacattggcctggcggtgatgaaaattctggaaagctggggcgcggataccatttatggcattccgagcggcaccctgagcagcctgatggatgcgatgggcgaagaggaaaacaacgtgaaatttctgcaagtgaaacatgaagaagtgggcgcgatggcggcggtgatgcagagcaaatttggcggcaacctgggcgtgaccgtgggcagcggcggcccgggcgcgagccatctgattaacggcctgtatgatgcggcgatggataacattccggtggtggccatcctgggcagccgcccgcagcgcgaactgaacatggatgcgtttcaagaactgaatcagaacccgatgtatgatcatattgcggtgtataaccgccgcgtggcgtatgcggaacagctgccgaaactggtggatgaagcggcgcgcatggcgattgcgaaacgcggcgtggcggtgctggaagtgccgggcgattttgcgaaagtggaaattgataacgatcagtggtatagcagcgcgaacagcctgcgcaaatatgaaccgattgcgccggcggcgcaagatattgatgcggcggtggaactgctgaacaacagcaaacgcccggtgatttatgcgggcattggcaccatgggccatggcccggcggtgcaagaactggcgcgcaaaattaaagcgccggtgattaccaccggcaaaaactttgaaacctttgaatgggattttgaagcgctgaccggcagcgcgtatcgcgtgggctggaaaccggcgaacgaaaccattctggaggccgatacggtgctgtttgcgggcagcaactttccgtttagcgaagtggaaggcacctttcgcaacgtggataactttattcagattgatattgatccggcgatgctgggcaaacgccatcatgcggatgtggcgattctgggcgatgcgggcctggcgattgatgaaattctgaacaaagtggataccgtggaagaaagcgcgtggtggaccgcgaacctgaaaaacattgcgaactggcgcgaatatattaacatgctggaaaccaaagaagaaggcgatctgcagttttatcaagtgtataacgcgattaacaaccatgcggatgaagatgcgatttatagcattgatgtgggcaacagcacgcagacgagcattcgccatctggctagcaccccgaaaaacatgtggcgcacgagcccgctgtttgcgaccatgggcattgcgattccgggcggcctgggcgcgaaaaacacctatccggatcgccaagtgtggaacattattggcgatggcgcgtttagcatgacctatccggatgtggttaccaacgtgcgctataacatgccggtgattaacgtggtgtttagcaacaccgaatatgcgtttattaaaaacaaatatgaagataccaacaaaaacctgtttggcgtggattttaccgatgtggattatgcgaaaattgcggaagcgcaaggcgcgaaaggctttaccgtgagccgcattgaagatatggatcgcgtgatggcggaagcggtggcggcgaacaaagcgggccataccgtggtgattgattgcaaaattacccaagatcgcccgattccggtggaaaccctgaaactggatagcaaactgtatagcgaagatgaaattaaagcgtataaagaacgctatgaagcggcgaacctggtgccgtttcgcgaatatctggaagcggaaggcctggaaagcaaatatattaaa。

13、进一步的，所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒转化至大肠杆菌的步骤包括：

14、在冰浴条件下，将1μl所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒加入30μl大肠杆菌感受态bl21(de3)中，冰浴放置20min，42℃水浴热激45s，立刻冰上放置2min；

15、加入400μl不含抗生素的soc培养基，37℃、220rpm振荡培养50min，得到菌液；

16、取100μl菌液均匀涂布到含100μg/ml卡那抗性的lb平板上，37℃培养箱培养过夜，获得转化后的所述大肠杆菌。

17、进一步的，所述挑取所述大肠杆菌中单克隆进行扩大培养和诱导表达，获得表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液的步骤包括：

18、从所述大肠杆菌中挑取单克隆菌落，无菌操作接种于含100μg/ml卡那霉素抗性的tb培养基中，37℃220rpm振荡培养至od600在0.6-0.8之间，iptg进行诱导，放置37℃振荡培养3小时，或者18℃振荡培养过夜，获得表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液。

19、进一步的，所述iptg的终浓度为0.1mm。

20、进一步的，所述对所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液进行纯化操作，获得绿色气球菌丙酮酸氧化酶的步骤包括：

21、tb培养基摇瓶培养1.5l表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的大肠杆菌的菌液；

22、离心，收集到湿重为30g的菌体，称取4g菌体，加入20ml lysis buffer在冰上重悬；

23、超声破碎，20000rpm，4℃离心30min，0.22μm针式过滤器过滤得到上清液；

24、上清液过ni-柱亲和层析，0～60％的buffer b进行线性洗脱，取洗脱主峰，洗脱得到所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶4ml。

25、进一步的，所述lysis buffer包括50mm tris、300mm nacl和5％glycerol，ph8.0。

26、进一步的，所述buffer b包括50mm tris、50mm nacl、5％glycerol和500mmimidazole，ph8.0。

27、与现有技术相比，本技术实施例主要有以下有益效果：

28、本技术采用了基因工程重组融合表达丙酮酸氧化酶，在大肠杆菌体系中实现绿色气球菌丙酮酸氧化酶的大量可溶性表达，且保持了对底物丙酮酸的生物催化活性，表达的丙酮酸氧化酶具有产量高、生产周期短、活性高、成本低等优点，可实现丙酮酸氧化酶的工业化生产。