环丁-1-烯胺类化合物及其制备方法和在药物中的应用

1.本发明涉及有机化学合成领域，具体涉及环丁-1-烯胺类化合物、其制备方法及在抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.官能团化的环丁-1-烯胺是一种重要的结构单元，存在于许多药物活性化合物和天然产物中。另外，由于四元环张力赋予其很好的反应活性，环丁-1-烯胺也常常被用做反应底物来构建其它重要的有机官能团分子。因此，有关环丁-1-烯胺类化合物的合成方法研究一直是化学家们关注的热点。
3.传统的构建环丁-1-烯胺类化合物是通过ficini[2+2]环加成反应实现的，即炔酰胺与环状烯酮发生[2+2]环加成反应生成环丁-1-烯胺。2010年，hsung课题组首次报道了炔酰胺和烯酮在cucl2和agsbf6催化作用下发生分子间ficini[2+2]环加成反应合成环丁-1-烯胺(org.lett.,2010,12,3780-3783)，后来也陆续出现了cu(i)、ru(ii)、rh(i)等催化炔酰胺参与的[2+2]环加成反应构建环丁-1-烯胺，但大多数方法只适合于炔基末端含有取代基的炔酰胺，因为此类炔酰胺比较稳定，而末端不含取代基的高活性炔酰胺几乎无[2+2]环加成产物环丁-1-烯胺的生成；另外，所报道的方法大部分是使用价格昂贵的重金属催化剂，对环境不友好。因此，开发高效、对环境友好及原子经济型的构建环丁-1-烯胺类化合物的方法具有重要的研究意义，尤其是通过末端不含取代基的高活性炔酰胺构建环丁-1-烯胺目前还处于空白的研究状态。


技术实现要素：

[0004]
为了克服上述技术缺陷，本发明目的在于提供一种多取代的环丁-1-烯胺类化合物、其合成方法及在抗病毒和抗肿瘤药物中的应用。
[0005]
为实现本发明目的，本发明采用末端不含取代基的高活性炔酰胺1在加热条件下发生[2+2]环加成反应得到环丁-1-烯胺类化合物2。
[0006]
具体技术方案如下：
[0007]
本发明所述环丁-1-烯胺类化合物，其结构通式为：
[0008][0009]
其中，ewg选自磺酰基，烷基取代的磺酰基或芳基取代的磺酰基；r选自烷基，烷氧基，卤素，硝基。
[0010]
优选：ewg选自磺酰基，c1-3烷基取代的磺酰基或苯基取代的磺酰基；r选自卤素，c1-3烷基或c1-3烷氧基，在苯环上单取代或双取代。
[0011]
本发明还提供了如上所述环丁-1-烯胺类化合物的制备方法，合成路线如下：
[0012][0013]
具体合成步骤如下：
[0014]
在氮气保护下，将炔酰胺原料1加入干燥的反应瓶内，将其加热至熔融状态，在该温度下维持其熔融状态至反应完全，柱层析分离得到环丁-1-烯胺类化合物2。
[0015]
进一步地，在上述技术方案中，所述炔酰胺原料1的合成路线如下：
[0016][0017]
具体合成步骤如下：
[0018]
在氮气保护下，将磺酰胺3和碳酸铯置于圆底烧瓶中，加入无水n,n-二甲基甲酰胺，室温下搅拌；将tms-ebx碘代物4溶于无水二氯甲烷，在0℃且避光的条件下将其加入反应体系，升至室温，再搅拌至反应完全，抽滤，减压浓缩除去溶剂后，直接柱层析分离得炔酰胺原料1。
[0019]
所述步骤中磺酰胺3、碳酸铯和tms-ebx碘代物4的摩尔比为1:1.3:1.5；n,n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷溶剂体积比为1:2.5。
[0020]
进一步地，在上述技术方案中，所述tms-ebx碘代物4的合成路线如下：
[0021][0022]
具体合成步骤如下：
[0023]
1)将邻碘苯甲酸5和高碘酸钠置于圆底烧瓶中，加入冰醋酸水溶液(体积百分比30％)，回流至反应完全，加入冰水避光冷却至室温，滤出白色固体，再用冰水、冰丙酮洗涤，得到1-羟基-1,2-苯并三唑-3-酮化合物6。
[0024]
2)将1-羟基-1,2-苯并三唑-3-酮化合物6溶于二氯甲烷，进行氮气保护，0℃下缓慢加入三氟甲磺酸三甲基硅酯，升至室温搅拌；再加入双(三甲基甲硅烷基)乙炔，室温搅拌至反应完全，向反应体系加入饱和碳酸氢钠溶液至混合物呈澄清状态，加入二氯甲烷萃取水相，有机相用无水na2so4干燥，减压浓缩除去溶剂，得到tms-ebx碘代物4。
[0025]
所述步骤中邻碘苯甲酸5和高碘酸钠的摩尔比为1:1.05，1-羟基-1,2-苯并三唑-3-酮6、三氟甲磺酸三甲基硅酯和双(三甲基甲硅烷基)乙炔的摩尔比为1:1.5:1.1。
[0026]
进一步地，在上述技术方案中，所述环丁-1-烯胺类化合物在抗病毒和抗肿瘤药物中的应用，其显示出抗sars-cov-2、5637、hela、sw480、hep g2、a549和mcf-7活性，可将其应用于抗新型冠状病毒、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、肺癌和乳腺癌药物的制备研究。
[0027]
与现有技术相比，本发明提供的环丁-1-烯胺类化合物，具有如下优势：1、该类化
合物具有抗sars-cov-2、5637、hela、sw480、hep g2、a549和mcf-7活性，将其应用于制备抗新型冠状病毒、膀胱癌、宫颈癌、结肠癌、肝癌、肺癌和乳腺癌药物中，具有很好的应用前景。2、本发明合成方法原料易得，且反应过程中无需催化剂和溶剂，后处理简单，对环境友好，底物普适性广。3、反应路径短，产物收率高，达76％
–
91％，能够快速实现一系列多取代的环丁-1-烯胺类化合物的高效合成。
附图说明
[0028]
图1是本发明化合物2a的1h nmr谱图；
[0029]
图2是本发明化合物2a的
13
c nmr谱图；
[0030]
图3是本发明化合物2c的1h nmr谱图；
[0031]
图4是本发明化合物2c的
13
c nmr谱图；
[0032]
图5是本发明化合物2e的1h nmr谱图；
[0033]
图6是本发明化合物2e的
13
c nmr谱图；
[0034]
图7是本发明化合物2f的1h nmr谱图；
[0035]
图8是本发明化合物2f的
13
c nmr谱图；
[0036]
图9是本发明化合物2g的1h nmr谱图；
[0037]
图10是本发明化合物2g的
13
c nmr谱图；
[0038]
图11是本发明化合物2i的1h nmr谱图；
[0039]
图12是本发明化合物2i的
13
c nmr谱图；
[0040]
图13是阳性对照物瑞德西韦抗sars-cov-2活性柱状图；
[0041]
图14是本发明化合物2a的细胞毒性柱状图；
[0042]
图15是本发明化合物2a抗sars-cov-2活性柱状图；
[0043]
图16是本发明化合物2b的细胞毒性柱状图；
[0044]
图17是本发明化合物2c的细胞毒性柱状图；
[0045]
图18是本发明化合物2d的细胞毒性柱状图；
[0046]
图19是本发明化合物2e的细胞毒性柱状图；
[0047]
图20是本发明化合物2e抗sars-cov-2活性柱状图；
[0048]
图21是本发明化合物2f的细胞毒性柱状图；
[0049]
图22是本发明化合物2f抗sars-cov-2活性柱状图；
[0050]
图23是本发明化合物2g的细胞毒性柱状图；
[0051]
图24是本发明化合物2g抗sars-cov-2活性柱状图；
[0052]
图25是本发明化合物2h的细胞毒性柱状图。
具体实施方式
[0053]
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。若未特别指明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0054]
主要仪器与化学试剂
[0055]
核磁共振波谱仪：bruker ascend
tm 400；高分辨质谱仪：bruker microtof-q ii质
谱仪；红外光谱仪：知微smart傅立叶变换红外光谱仪(天津港东科技股份有限公司)；三用紫外线分析仪：zf-6型(上海高鹏科技有限公司)；测定用熔点仪：xt4a显微熔点测定仪(北京科仪电光仪器厂)。
[0056]
本发明实施过程中所用的原料、溶剂均为商业途径购进。
[0057]
实施例1：tms-ebx碘代物4的合成
[0058][0059]
tms-ebx碘代物4具体合成步骤如下：
[0060]
1)将邻碘苯甲酸5(7.44g,30mmol)和高碘酸钠(6.74g,31.5mmol)溶于30％(v:v)的冰醋酸水溶液(50ml)中回流4.0h至反应完全，向反应体系中加入冰水(30ml)，避光的条件下，冷却至室温，过滤出白色固体，并用冰水(60ml)和冰丙酮(60ml)洗涤，在避光下室温干燥，得到1-羟基-1,2-苯并三唑-3-酮化合物6(7.13g,27mmol)，产率为90％。
[0061]
2)在氮气保护下，将1-羟基-1,2-苯并三唑-3-酮6(5.28g,20mmol)置于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(30ml)，0℃下缓慢加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(5.44ml,30mmol)，升至室温搅拌0.5h；再加入双(三甲基甲硅烷基)乙炔(4.99ml,22mmol)，室温搅拌6.0h至反应完全；向反应体系加入饱和碳酸氢钠至溶液呈澄清状态，加入二氯甲烷萃取，有机相用无水na2so4干燥，减压除去溶剂，得到tms-ebx碘代物4(6.81g,19.8mmol)，产率为99％。
[0062]
实施例2：炔酰胺原料1a-1i的合成
[0063]
特别说明，化合物结构中简写：ts代表对甲基苯磺酰基，mbs代表对甲氧基苯磺酰基。
[0064][0065]
以炔酰胺1a具体合成步骤为例，向25ml圆底烧瓶中依次加入磺酰胺3a(123.7mg,0.50mmol)，碳酸铯(211.8mg,0.65mmol)，用密闭良好的翻盖橡胶塞塞紧瓶口并进行氮气保护，再加入干燥过的n,n-二甲基甲酰胺(1.0ml)，室温搅拌0.5h；将tms-ebx碘代物4(258.2mg,0.75mmol)溶于二氯甲烷(2.5ml)，在避光0℃下缓慢加入反应体系，升至室温搅拌0.5h；薄层色谱法监测反应进程，待反应完成后，过硅胶抽滤，减压除去溶剂，所得粗产物以石油醚/乙酸乙酯(10:1～4:1)为洗脱剂柱层析分离得到白色固体原料1a(135.2mg,0.498mmol)，产率为99％。
[0066]
将对应的磺酰胺3b-3i分别按本实施例中上述方法制备化合物1，对应得到化合物1b-1i。
[0067]
[0068]
化合物1a：白色固体，99％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.58(dt,j＝8.6hz,2.0hz,2h),7.33-7.31(m,3h),7.30-7.27(m,3h),7.26-7.24(m,1h),2.84(s,1h),2.44(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ145.3,138.4,133.0,129.7,129.3,128.6,128.4,126.4,76.7,59.1,21.9.
[0069][0070]
化合物1b：白色固体，90％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.59(dt,j＝8.6hz,2.2hz,2h),7.30-7.28(m,2h),7.11(s,4h),2.81(s,1h),2.45(s,3h),2.34(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ145.2,138.8,135.8,133.1,129.9,129.7,128.4,126.4,76.9,58.7,21.9,21.3.
[0071][0072]
化合物1c：白色固体，99％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.59(dt,j＝8.6hz,2.2hz,2h),7.29(d,j＝12.0hz 2h),7.12(dt,j＝10.3hz,3.5hz,2h),6.82(dt,j＝10.3hz,3.5hz,2h),3.80(s,3h),2.80(s,1h),2.45(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ159.7,145.2,133.0,131.0,129.7,128.5,128.1,114.4,77.1,58.4,55.7,21.9.
[0073][0074]
化合物1d：白色固体，88％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.58(d,j＝8.4hz,2h),7.30(d,j＝8.0hz,3h),7.24-7.19(m,2h),7.04-6.99(m,2h),2.84(s,1h),2.45(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ162.4(c-f,1j
c-f
＝246.7hz),145.5,134.3(c-f,4j
c-f
＝3.2hz),132.7,129.8,128.5(c-f,3j
c-f
＝8.9hz),128.4,116.3(c-f,2j
c-f
＝22.9hz),76.6,59.2,21.9.
[0075][0076]
化合物1e：白色固体，93％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.60(dt,j＝8.6hz,2.2hz,2h),7.30-7.28(m,2h),7.22-7.18(m,1h),7.14-7.08(m,2h),7.02-6.99(m,1h),2.82(s,1h),2.45(s,3h),2.32(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ145.2,139.4,138.3,133.2,129.7,129.4,129.0,128.5,127.2,123.4,76.8,58.9,21.9,21.4.
[0077][0078]
化合物1f：白色固体，86％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.62(dt,j＝8.7hz,2.1hz,2h),7.30(d,j＝8.1hz,2h),6.95(s,1h),6.85(s,2h),2.81(s,1h),2.45(s,3h),2.27(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ145.1,139.1,138.2,133.3,130.4,129.6,128.5,124.2,77.0,58.8,21.9,21.3.
[0079][0080]
化合物1g：白色固体，91％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.61(d,j＝8.4hz,2h),7.29(d,j＝8.0hz,2h),7.23-7.19(m,1h),6.87-6.81(m,3h),3.76(s,3h),2.84(s,1h),2.44(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ160.1,145.3,139.4,133.1,129.9,129.7,128.4,118.4,114.5,112.0,76.9,59.3,55.6,21.9.
[0081][0082]
化合物1h：白色固体，72％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.60(dt,j＝8.6,2.2hz,2h),7.32-7.27(m,5h),7.21(dt,j＝7.6,1.9hz,1h),2.88(s,1h),2.45(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ145.6,139.5,134.8,132.8,130.2,129.9,128.7,128.4,126.3,124.4,76.0,60.0,21.9.
[0083][0084]
化合物1i：白色固体，95％产率，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.63(dt,j＝9.9hz,3.0hz,2h),7.35-7.31(m,3h),7.28-7.25(m,2h),6.94(dt,j＝9.9hz,3.1hz,2h),3.88(s,3h),2.84(s,1h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ164.1,138.5,130.7,129.3,128.6,127.6,126.5,114.2,76.9,59.1,55.9.
[0085]
实施例3：化合物2a-2i的合成
[0086][0087]
以化合物2a具体合成步骤为例，在氮气保护下，将炔酰胺1a(81.4mg,0.3mmol)加
入干燥的反应瓶中，将反应体系升温至其呈熔融状态(100℃)，在该温度下维持其熔融状态，通过薄层色谱法监测反应进程，2.0h后反应完成。所得粗产物以石油醚/乙酸乙酯(3.5:1)为洗脱剂柱层析分离得到白色固体产物2a(70.8mg，0.131mmol)，产率为87％。
[0088]
将实施例2中制备得到的炔酰胺中间体1b-1i分别按本实施例中上述方法制备化合物2，对应得到化合物2b-2i(ts代表对甲基苯磺酰基，mbs代表对甲氧基苯磺酰基)。
[0089][0090]
化合物2a：白色固体，87％产率，rf＝0.25[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝86
–
89℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(dt,j＝8.4hz,2.0hz,2h),7.50-7.38(m,5h),7.33-7.26(m,5h),7.24(s,1h),7.18-7.08(m,3h),6.76-6.73(m,2h),5.94(s,1h),4.91(s,1h),2.45(s,3h),2.42(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ153.1,152.0,148.9,146.0,145.5,135.7,133.1,132.9,130.2,130.1,130.02,129.97,129.5,129.4,129.1,128.4,124.8,121.7,118.6,76.0,21.94,21.89；ir(neat)(cm-1
)1769w,1695w,1552s,1486m,1320m,1173s,694s；hrms(esi):m/z calcd for c
30h27
n2o4s2[m+h]
+
543.1407,found 543.1411.
[0091][0092]
化合物2b：白色固体，81％产率，rf＝0.37[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝100
–
101℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(dt,j＝8.6hz,2.1hz,2h),7.48(dt,j＝8.7hz,2.2hz,2h),7.31(d,j＝8.0hz,2h),7.24(s,1h),7.19(d,j＝8.3hz,2h),7.11-7.06(m,3h),7.02-6.99(m,2h),6.64(dt,j＝8.8hz,2.4hz,2h),5.93(s,1h),4.87(s,1h),2.45(s,3h),2.42(s,3h),2.40(s,3h),2.32(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ152.6,151.9,146.4,145.9,145.4,140.4,134.5,133.1,133.0,132.7,130.1,130.0,129.9,129.8,129.7,129.4,128.4,121.7,118.6,76.0,21.94,21.88,21.5,21.1；ir(neat)(cm-1
)1695w,1554s,1450w,1320m,1172s,1137s,667s；hrms(esi):m/z calcd for c
32h31
n2o4s2[m+h]
+
571.1720,found 571.1716.
[0093][0094]
化合物2c：白色固体，76％产率，rf＝0.13[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝95
–
97℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(d,j＝8.2hz,2h),7.48(d,j＝8.4hz,2h),7.32-7.27(m,3h),7.24(s,1h),7.05(s,2h),6.90-6.86(m,2h),6.82(dt,j＝9.9hz,3.3hz,2h),6.71(dt,
j＝9.6hz,2.9hz,2h),5.96(s,1h),4.86(s,1h),3.84(s,3h),3.79(s,3h),2.45(s,3h),2.42(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ160.6,157.1,151.99,151.95,145.9,145.4,142.1,133.1,132.8,131.4,130.0,129.9,129.4,128.4,127.9,123.0,118.5,114.4,114.3,76.0,55.63,55.58,21.93,21.87；ir(neat)(cm-1
)1768w,1555s,1501s,1242s,1170s,1082m,668s；hrms(esi):m/z calcd for c
32h31
n2o6s2[m+h]
+
603.1618,found 603.1614.
[0095][0096]
化合物2d：白色固体，87％产率，rf＝0.37[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝90
–
91℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.76(d,j＝8.2hz,2h),7.50(d,j＝8.1hz,2h),7.33-7.27(m,4h),7.16-7.05(m,4h),7.00-6.94(m,2h),6.73-6.68(m,2h),5.95(s,1h),4.89-4.87(m,1h),2.45(s,3h),2.43(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ163.3(c-f,1j
c-f
＝250.1hz),160.3(c-f,1j
c-f
＝242.2hz),153.0,151.9,146.3,145.6,144.9(c-f,4j
c-f
＝2.9hz),132.9,132.8,132.1(c-f,3j
c-f
＝9.1hz),131.5(c-f,4j
c-f
＝3.2hz),130.1,129.9,129.5,128.3,123.0(c-f,3j
c-f
＝8.0hz),118.2,116.5(c-f,2j
c-f
＝23.0hz),115.8(c-f,2j
c-f
＝22.3hz),75.9,21.91,21.87；ir(neat)(cm-1
)1695w,1558s,1498s,1219m,1082m,1017w,668s；hrms(esi):m/z calcd for c
30h25
f2n2o4s2[m+h]
+
579.1218,found 579.1221.
[0097][0098]
化合物2e：白色固体，91％产率，rf＝0.40[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝77
–
78℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(dt,j＝8.6hz,2.1hz,2h),7.50(dt,j＝8.7hz,2.1hz,2h),7.33-7.30(m,2h),7.27-7.26(m,2h),7.25-7.24(m,2h),7.18-7.14(m,1h),6.98-6.89(m,3h),6.54-6.51(m,2h),5.90(s,1h),4.90(s,1h),2.46(s,3h),2.43(s,3h),2.35(s,3h),2.31(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ152.9,151.9,148.9,145.9,145.4,139.5,138.9,135.5,133.2,133.0,130.9,130.7,130.1,129.9,129.4,129.0,128.9,128.5,127.0,125.6,122.4,118.7,118.6,76.1,21.93,21.88,21.6,21.5；ir(neat)(cm-1
)1769w,1595w,1551s,1370m,1172s,1136s,670s；hrms(esi):m/z calcd for c
32h31
n2o4s2[m+h]
+
571.1720,found 571.1718.
[0099][0100]
化合物2f：白色固体，87％产率，rf＝0.50[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝132
–
134
℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(dt,j＝8.3,1.9hz,2h),7.51(dt,j＝8.3,1.9hz,2h),7.31(d,j＝8.0hz,2h),7.27(s,1h),7.25(s,1h),7.06(s,1h),6.78-6.72(m,3h),6.30(s,2h),5.88(s,1h),4.89(s,1h),2.46(s,3h),2.43(s,3h),2.29(s,6h),2.26(s,6h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ152.8,151.9,148.9,145.8,145.2,139.1,138.7,135.3,133.3,133.0,131.8,130.1,129.8,129.4,128.6,127.6,126.4,119.4,118.8,76.1,21.92,21.88,21.5,21.4；ir(neat)(cm-1
)2920w,1594w,1553s,1318m,1147s,1082m,683s；hrms(esi):m/z calcd for c
34h35
n2o4s2[m+h]
+
599.2033,found599.2031.
[0101][0102]
化合物2g：白色固体，90％产率，rf＝0.19[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝76
–
77℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(d,j＝8.3hz,2h),7.53(d,j＝8.4hz,2h),7.32(d,j＝8.0hz,2h),7.29-7.27(m,2h),7.25-7.24(m,1h),7.19-7.15(m,1h),6.99(dd,j＝8.0hz,2.1hz,1h),6.74(s,1h),6.68-6.65(m,2h),6.31-6.29(m,2h),5.92(s,1h),4.94(s,1h),3.78(s,3h),3.76(s,3h),2.45(s,3h),2.42(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ160.3,160.1,153.3,152.0,150.3,146.0,145.4,136.5,133.2,133.1,130.0,129.9,129.81,129.76,129.5,128.5,122.0,118.7,116.0,113.8,110.5,107.6,76.1,55.7,55.4,21.92,21.88,其中，在129.9ppm处有一个碳信号重叠；ir(neat)(cm-1
)1700w,1551s,1449w,1370m,1135s,1040m,673s；hrms(esi):m/z calcd for c
32h31
n2o6s2[m+h]
+
603.1618,found 603.1622.
[0103][0104]
化合物2h：白色固体，91％产率，rf＝0.35[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝82
–
83℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.75(d,j＝8.3hz,2h),7.53(d,j＝8.2hz,2h),7.46-7.43(m,1h),7.37-7.29(m,5h),7.20(t,j＝8.0hz,1h),7.13-7.07(m,3h),6.66-6.63(m,1h),6.60(t,j＝2.0hz,1h),5.91(s,1h),4.91(s,1h),2.47(s,3h),2.44(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ153.8,151.9,150.1,146.5,145.8,136.6,134.9,134.6,132.9,132.8,130.5,130.3,130.17,130.16,130.13,129.9,129.6,128.4,124.8,121.6,120.0,118.4,75.9,21.95,21.92,其中，在130.16ppm处有一个碳信号重叠；ir(neat)(cm-1
)1696w,1550s,1288m,1175m,1081m,1021w,667s；hrms(esi):m/z calcd for c
30h25
cl2n2o4s2[m+h]
+
611.0627,found 611.0628.
[0105]
[0106]
化合物2i：白色固体，82％产率，rf＝0.12[石油醚/乙酸乙酯(2:1)]；mp＝94
–
97℃；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.84(dt,j＝9.9hz,2.8hz,2h),7.52(dt,j＝10.0hz,2.8hz,2h),7.46-7.38(m,3h),7.30-7.26(m,2h),7.17-7.09(m,3h),6.98(dt,j＝9.4hz,2.6hz,2h),6.90(dt,j＝9.7hz,2.8hz,2h),6.79-6.77(m,2h),5.93(s,1h),4.91(s,1h),3.87(s,3h),3.84(s,3h)；
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ164.5,164.3,153.3,152.2,148.9,135.7,132.2,130.6,130.11,130.07,129.3,129.1,127.3,124.8,121.8,118.2,114.5,114.0,76.1,55.9,55.8,其中在129.1ppm处有一个碳信号重叠；ir(neat)(cm-1
)1697w,1592m,1551s,1260s,1136s,1083s,832s；hrms(esi):m/z calcd for c
30h27
n2o6s2[m+h]
+
575.1305,found 575.1303.
[0107]
实施例4：本发明实施例3所合成的代表性化合物的抗病毒活性研究
[0108]
化合物储存液配置及保存：dmso稀释至10mm或20mm，-20℃保存；储存液解冻后，用细胞培养基dmem/10％fbs/1％pen/strep稀释。
[0109]
4.1化合物2a-2i抗病毒活性检测
[0110]
表1化合物2a,2d-2h病毒基因组envelope基因mrna相对量
[0111][0112]
病毒含有gfp，利用荧光显微镜观察gfp的产生代表病毒复制，本发明化合物中除了2i之外，化合物2a-2h在5μm浓度均显示出对病毒gfp产生抑制，即具有抗病毒活性。接着以瑞德西韦作为抗sars-cov-2阳性对照药，利用qrt-pcr半定量检测病毒envelope gene的表达，对化合物2a-2h进行抗病毒活性的确证，实验步骤如下：
[0113]
1)-1天，细胞caco-2-n(每孔6x104个)铺于24孔板，加入300μl培养基：dmem/10％fbs/1％pen/strep；
[0114]
2)第0天，换液加入200μl，5μm化合物溶液；孵育1h后，加入30μl病毒；感染(sars-cov-2gfp/
△
n trvlp)；化合物终浓度为5μm；
[0115]
3)细胞培养24h后，换液洗去游离病毒；细胞继续培养24h后，消化细胞提取rna，反转录为cdna；qrt-pcr半定量检测病毒envelope gene的表达；
[0116]
4)计算病毒相对复制能力见表1和表2。
[0117]
表2化合物2c作用下病毒基因组envelope基因mrna相对量
[0118][0119]
由于化合物2b细胞毒性较大，细胞死亡，无荧光，因此表中没有化合物2b病毒相对复制能力数据。由表1和表2化合物2a-2h作用下提取的病毒基因组envelope基因mrna相对量数据得出化合物抗病毒活性次序为2e,2f》2a》2g》2d》2c》2h，即环丁-1-烯胺2苯环上不含取代基或者苯环间位含有给电子取代基的化合物2a、2e、2f和2g抗病毒效果较好，可进行下一步抗病毒剂量依赖效应检测。
[0120]
4.2化合物2a-2h的细胞毒性检测
[0121]
使用mtt比色法检测化合物2a-2h的细胞毒性，实验步骤如下：
[0122]
1)-1天，细胞caco-2-n(每孔8x103个)铺于96孔板，加入100μl培养基：dmem/10％fbs/1％pen/strep；
[0123]
2)第0天，加入100μl化合物溶液；化合物终浓度为25μm，5μm，1μm，0.2μm，同时设置不含化合物的对照；
[0124]
3)细胞培养48h后，弃100μl上清，加20μl mtt(5mg/ml)，37℃培养4h；
[0125]
4)弃100μl上清，加入100μl dmso，摇床震荡至formazen溶解；
[0126]
5)酶标仪检测595nm吸光度，参考波长630nm；
[0127]
6)计算细胞的存活率见表3。
[0128]
由表3化合物2a-2h作用下细胞caco-2-n的存活率可知：化合物2a、2e、2f、2g和2h细胞毒性相对较小，即环丁-1-烯胺2中苯环上不含取代基的化合物2a和苯环间位含有取代基的化合物2e、2f、2g、2h毒性小于苯环对位含有取代基的化合物2b、2c、2d，而且化合物2a、2g和2h浓度为25μm时细胞存活率高达90％以上。但是由表1知化合物2h抗病毒活性差，化合物2a和2g抗病毒效果较好，为了计算化合物2a和2g的半数毒性浓度cc
50
，依据上述实验步骤继续检测化合物2a和2g终浓度为450μm、150μm、50μm时的细胞毒性，并计算细胞的存活率见表4。
[0129]
表3化合物2a-2h不同浓度下的细胞存活率
[0130][0131]
表4化合物2a和2g高浓度下的细胞存活率
[0132][0133]
4.3化合物2a、2e、2f和2g抗病毒剂量依赖效应检测
[0134]
表5化合物2a、2e、2f和2g抗病毒剂量依赖效应
[0135][0136]
通过前面化合物2a-2h抗病毒活性检测得出化合物2a、2e、2f和2g抗病毒效果较好，接着进行化合物2a、2e、2f和2g的抗病毒剂量依赖效应检测。以瑞德西韦作为抗sars-cov-2阳性对照药，倍比稀释化合物浓度(5μm，1μm，0.2μm，0.04μm)，利用qrt-pcr半定量检测病毒envelope gene的表达，进行化合物2a、2e、2f和2g抗病毒剂量依赖效应检测，实验步骤如下：
[0137]
1)-1天，细胞caco-2-n(每孔6x104个)铺于24孔板，300μl培养基：dmem/10％fbs/1％pen/strep；
cov-2病毒所需要的药物浓度。
[0149]
本试验采用本领域技术人员熟知的方法进行，利用caco-2-n细胞来评价本发明所合成的化合物2a-2h对sars-cov-2的抑制活性。实验结果表明环丁-1-烯胺2苯环上不含取代基的化合物2a和苯环间位含有强给电子取代基(甲氧基)的化合物2g均具有较好的抗sars-cov-2活性及很低的细胞毒性，化合物2e和2f虽具有较好的抗sars-cov-2活性但细胞毒性稍强。图15、图20、图22和图24表明化合物2a、2e、2f、2g呈剂量依赖性地抑制了sars-cov-2病毒株的复制。本发明在抗sars-cov-2药物的制备与研究中有很好的应用前景。
[0150]
实施例5：本发明实施例3所合成的代表性化合物的抗肿瘤活性研究
[0151]
化合物2a-2i抗肿瘤活性研究所用的细胞株、细胞培养试剂、实验仪器及来源见表8、表9和表10。
[0152]
表8细胞株种类及来源
[0153][0154]
表9细胞培养试剂及生产厂家
[0155][0156]
表10实验仪器及生产厂家
[0157][0158]
化合物2a-2i的抗癌细胞活性及细胞毒性检测
[0159]
取对数生长期的癌细胞计数，配制成浓度为5
×
104个/ml细胞悬液，震荡混匀后接种于96孔板，每孔加入细胞悬液100μl，37℃、5％co2培养条件下培养4-8h；用新鲜的培养基配置含不同浓度化合物的培养液培养48h；48h后，甩掉96孔板孔内培养液，每孔加入10％cck8溶液100μl，继续培养1-4h，然后在450nm波长下检测吸光度。抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]
×
100％；as:实验孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，化合物培养液处理组)；ac：对照孔吸光度(含细胞、培养基、cck-8溶液，不含化合物培养液处理组)；ab：空白孔吸光度(含培养基和cck-8溶液，不含细胞和化合物)。使用graphpad prism 9.0计算化合物的ic
50
。
[0160]
表11化合物2a-2i对hep g2、a549及mcf-7的抑制活性
[0161][0162]
首先测试化合物2a-2i对3种癌细胞hep g2、a549及mcf-7的抑制活性并计算出ic
50
(表11)。由表11知，结构中含有对甲氧基苯基的化合物2c和2i对癌细胞的抑制活性最强。在此初筛结果的基础上，扩大了细胞株的种类(含11种癌细胞和1种正常细胞)，以vcr(长春新碱)为阳性对照药，对化合物2c和2i抗人膀胱癌细胞5637、人胶质母细胞瘤细胞a172、人恶性黑色素瘤细胞a375、人子宫颈癌细胞c33a、人结肠癌细胞hct 116和sw480、人宫颈癌细胞hela、人胰腺癌细胞cfpac-1、人肝癌细胞hep g2、人肺癌细胞a549和人乳腺癌细胞mcf-7的活性，以及对正常细胞293t(肾上皮细胞)细胞毒性进行了检测，结果如下表12.1和表12.2。
[0163]
表12.1化合物2c和2i对5637、a172、a375、c33a、hct 116及hela的抑制活性
[0164][0165]
表12.2化合物2c和2i对cfpac-1、sw480、hep g2、a549、mcf-7及293t的抑制活性
[0166][0167]
本试验采用本领域技术人员熟知的方法进行，利用12种细胞株(含11种癌细胞和1种正常细胞)来评价本发明所合成的化合物2a-2i的抗肿瘤活性和安全性。实验结果表明环丁-1-烯胺结构中含有对甲氧基苯基的化合物2c和2i对癌细胞的抑制活性最强。与阳性对照药vcr相比，化合物2c对人膀胱癌细胞5637、人宫颈癌细胞hela、人结肠癌细胞sw480、人肝癌细胞hep g2、人肺癌细胞a549和人乳腺癌细胞mcf-7均具有很好的抑制活性，但对正常细胞293t(肾上皮细胞)细胞毒性稍强；化合物2i对人膀胱癌细胞5637、人肝癌细胞hep g2和人乳腺癌细胞mcf-7具有很好的抑制活性，及对正常细胞293t(肾上皮细胞)低的细胞毒性。本发明在抗肿瘤药物的制备与研究中具有很好的应用前景。