一种提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法

1.本发明涉及生物质固体废弃物资源化利用技术领域，尤其涉及一种提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法。


背景技术：

2.我国每年使用甘草10亿吨以上，产生甘草药渣2亿吨以上。通常废弃药渣通过填埋、焚烧等常规方式进行处理，不仅占用了土地资源还对空气、土壤、造成了污染。
3.甘草初始加工主要通过水提法提取甘草酸，但其中还有脂溶性成分，例如黄酮、糖类等丰富的高值活性成分未被提取，若直接丢弃会造成资源浪费。因此对甘草渣中的高值活性成分进行有效提取，与我国“低碳、环保”的理念相符。
4.黄酮作为甘草药渣中重要的活性成分之一，具抗炎、解毒、抗溃疡、抗过敏和抗菌等作用，然而，甘草药渣中含有的木质纤维素等成分阻碍了活性成分的有效释放，因此降低了黄酮的提取效率。传统超声辅助、微波辅助提取方法成本较高，而传统有机溶剂提取易造成环境污染。相比较，低共熔溶剂因其具有低成本、可设计性、环境友好型和生物可降解性而被关注与使用，已被用于木芙蓉叶总黄酮(cn110623988a)，菝葜黄酮类化合物(cn109125563a)，皂角刺总黄酮(cn111450139a)等提取。但低共熔溶剂提取物通常为黄酮混合物，因此需要进一步系统分离纯化，来提高分离物的附加值与经济价值。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法，本发明采用发酵预处理优化及使用计算机模拟软件预测低共熔溶剂提取黄酮化合物，并进行分离纯化的方法。
6.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
7.本发明提供一种提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法，包括如下步骤：
8.(1)以甘草药渣为基质进行混菌发酵，得发酵后的甘草药渣；
9.(2)使用cosmologic模拟软件对低共融溶剂进行预测，选择低共融溶剂；
10.(3)通过步骤(2)所得低共融溶剂对步骤(1)所得发酵后的甘草药渣进行黄酮的提取。
11.作为优选，步骤(1)中，所述混菌发酵所用混菌为横梗霉菌和白腐真菌，所述横梗霉菌和白腐真菌的菌株比例为1:1～3:1。
12.作为优选，所述步骤(1)中，进行混菌发酵前，对横梗霉菌和白腐真菌进行培养。
13.作为优选，所述培养的时间为36h，培养的温度为30℃。
14.作为优选，所述步骤(1)中，进行混菌发酵前，对甘草药渣进行预处理，预处理包括如下步骤：将甘草药渣粉碎过90～120目筛，进行静置灭菌处理。
15.作为优选，步骤(1)中，所述混菌发酵的含水量为20～60％，混菌发酵的菌株接种量为5～25％；所述混菌发酵的氮源为尿素和硝酸铵，所述尿素和硝酸铵的质量比为1:1～
3:1；所述混菌发酵的氮源总量为10～50％。
16.作为优选，步骤(2)中，所述低共融溶剂为氢键供体和氢键受体；所述氢键供体为乙二醇、丙酸、乳酸中的一种，氢键受体为四丙基溴化铵、四甲基氯化铵、四乙基溴化铵、四丁基溴化铵中的一种。
17.作为优选，步骤(3)中，所述通过步骤(2)所得低共融溶剂对步骤(1)所得发酵后的甘草药渣进行黄酮的提取包括如下步骤：
18.步骤s1：制备低共融溶剂：将氢键供体和氢键受体混合反应，得低共融溶剂；
19.步骤s2：将发酵后的甘草药渣用低共融溶剂进行提取，得黄酮提取液。
20.作为优选，步骤(3)中，所述氢键供体和氢键受体混合反应的温度为70～100℃，氢键供体和氢键受体混合反应的时间为100～130min；所述氢键供体和氢键受体的摩尔比为1:1～2；所述低共融溶剂的含水量为15～20％。
21.作为优选，步骤(3)中，所述发酵后的甘草药渣与低共融溶剂质量体积比为1g:3～19ml；所述提取的温度为53～80℃，提取的时间为41～139min。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明有益效果如下：
23.本发明采用混菌发酵对甘草药渣进行预处理，随后结合cosmologic模拟计算预测得到最佳低共熔溶剂，对甘草药渣中总黄酮进行响应面优化的提取设计，实现了甘草药渣中主要成分的高效的提取，提取过程中减少了对环境的污染，提取率较传统溶剂高75％；经系统分离后，甘草素纯度高达95％以上，且使用提取、分离溶剂简单易获得，可以广泛应用于药材有效成分的提取及分离纯化。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
25.图1为本发明所述提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法的流程图；
26.图2为本发明所得黄酮提取液的液质测定结果图；
27.图3为本发明所得黄酮提取液的核磁测定结果图。
具体实施方式
28.本发明提供一种提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法，包括如下步骤：
29.(1)以甘草药渣为基质进行混菌发酵，得发酵后的甘草药渣；
30.(2)使用cosmologic模拟软件对低共融溶剂进行预测，选择低共融溶剂；
31.(3)通过步骤(2)所得低共融溶剂对步骤(1)所得发酵后的甘草药渣进行黄酮的提取。
32.在本发明中，步骤(1)中，所述混菌发酵所用混菌为横梗霉菌和白腐真菌，所述横梗霉菌和白腐真菌的菌株比例优选为1～3:1，进一步优选为2:1。
33.在本发明中，所述步骤(1)中，进行混菌发酵前，对横梗霉菌和白腐真菌进行培养。
34.在本发明中，所述培养的时间为36h，培养的温度为30℃。
35.在本发明中，所述步骤(1)中，进行混菌发酵前，对甘草药渣进行预处理，预处理包括如下步骤：将甘草药渣粉碎过90～120目筛，进行静置灭菌处理；所述甘草药渣优选为粉碎过90～120目筛，进一步优选为粉碎过100目筛。
36.在本发明中，步骤(1)中，所述混菌发酵的含水量优选为20～60％，进一步优选为30～40％；混菌发酵的菌株接种量优选为5～25％，进一步优选为10～20％；所述混菌发酵的氮源为尿素和硝酸铵，所述尿素和硝酸铵的质量比优选为1～3:1，进一步优选为2:1；所述混菌发酵的氮源总量优选为10～50％，进一步优选为20～40％。
37.在本发明中，步骤(2)中，所述低共融溶剂为氢键供体和氢键受体；所述氢键供体优选为乙二醇、丙酸、乳酸中的一种，进一步优选为乙二醇或丙酸；氢键受体优选为四丙基溴化铵、四甲基氯化铵、四乙基溴化铵、四丁基溴化铵中的一种，进一步优选为四丙基溴化铵或四甲基氯化铵。
38.在本发明中，步骤(2)中，利用cosmologic软件对甘草药渣中主要提取物甘草素为主的黄酮类化合物进行计算模拟，计算其sigma-profile,sigma-surface，以及预测其活度系数，预测低共融溶剂。
39.在本发明中，步骤(3)中，所述通过步骤(2)所得低共融溶剂对步骤(1)所得发酵后的甘草药渣进行黄酮的提取包括如下步骤：
40.步骤s1：制备低共融溶剂：将氢键供体和氢键受体混合反应，得低共融溶剂；
41.步骤s2：将发酵后的甘草药渣用低共融溶剂进行提取，得黄酮提取液。
42.在本发明中，步骤(3)中，所述氢键供体和氢键受体混合反应的温度优选为70～100℃，进一步优选为80～90℃；氢键供体和氢键受体混合反应的时间优选为100～130min，进一步优选为110～120min；所述氢键供体和氢键受体的摩尔比优选为1:1～2，进一步优选为1:1.5；所述低共融溶剂的含水量优选为15～20％，进一步优选为18％。
43.在本发明中，步骤(3)中，所述发酵后的甘草药渣与低共融溶剂质量体积比优选为1g:3～19ml，进一步优选为1g:10～15ml；所述提取的温度优选为53～80℃，进一步优选为60～70℃；提取的时间优选为41～139min，进一步优选为80～100min。
44.在本发明中，所述提取甘草药渣黄酮及分离纯化的方法中还包括对黄酮提取液的提纯，具体步骤为：将黄酮提取液分别通过大孔树脂、mcl、ods、sephadex lh-20凝胶柱色谱分离。
45.在本发明中，所述提纯包括如下步骤：
46.将固体粗产品经大孔树脂进行吸附，用水进行洗脱杂质，以除去糖、盐等，后用乙醇与水(体积比为20～99:1～80)进行梯度洗脱，选取目标馏分；
47.使用mcl凝胶柱将大孔树脂目标馏分进行有效吸附，后用乙醇与水(体积比为20～99:1～80)进行梯度洗脱，选取目标馏分；
48.使用ods填料将mcl凝胶目标馏分进行有效吸附，后用乙醇、水、三氟乙酸(体积比为20～99:1～80:0.05)进行梯度洗脱，选取目标馏分；
49.使用sephadex lh-20凝胶色谱柱将ods目标馏分进行有效吸附，后用乙醇与水(体积比为20～99:1～80)进行梯度洗脱，得到最终目标化合物甘草素。
50.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
51.以下实施例所用试剂均购自麦克林。
52.甘草素液质及核磁测试方法：acquity uplc超高效液相色谱仪、xevo tq-s三重四级杆串联质谱仪、masslynx工作站，waters acquity uplc beh c18柱(50mm
×
2.1mm，1.7μm)；流速:0.3ml/min；进样量:1μl；柱温箱：30℃，流动相：甲酸(0.1％)-水(a)：乙腈(b)梯度洗脱顺序为0-3min(从80％和20％至2％和98％b),4-6min(从2％和98％至80％和20％b)在0.3毫升/分钟的流量，流速0.3ml/min。离子源为电喷雾离子源(esi)，采用多反应检测模式(mrm)进行含量测定，脱溶剂气温度：450℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气体流速：800l/h；锥孔气：150l/h；毛细管电压3000v。以正离子模式进行子离子扫描(母离子为257.17)，扫描范围：m/z 50～260。
53.核磁共振(nmr)(brukeravanceiii hd 400mhz)，以d6-dmso溶剂作为内参，对所制备的提取物进行鉴定。
54.实施例1
55.1)将所述的白腐菌、横梗霉菌接种至pdb培养基，进行常规培养36h，30℃，并将灭菌后的甘草残渣(总质量为1.0g，直径为100目)放置烧瓶中进行。
56.2)向甘草药渣发酵基质中加入氮源(尿素与硝酸铵)20％、氮源(尿素：硝酸铵)1:2、接种量的菌株(白腐菌：横梗霉菌)1:1、含水量50％、菌株接种比例10％，发酵至第四天，30℃放置培养箱。
57.3)将上述甘草药渣基质加入柠檬酸钠缓冲液3ml(5mmol/l,ph 5.0)，将样品充分混合后，在220rpm和4℃条件下摇匀120min，最后通过离心(1500rpm,25℃条件下10min)和过滤得到酶提取物。
58.4)将上述酶提取物吸取1.5ml,将反应混合物(whatman 1和1.5ml的酶提取物)在50℃下孵育50min，然后加入2ml的柠檬酸钠缓冲液(5mmol/l,ph 5)和1.5ml的3,5-二硝基水杨酸(dns)，然后将混合物煮沸15min，冷却以停止反应，最后用od520分光光度计测定还原糖的浓度。
59.5)将上述酶提取物吸取0.5ml，后将反应混合液中含有0.5ml酶提物和1.5ml 1％(w/v)果胶(tris-hclbuffer,ph 7.5)。50℃孵育50min后，加入1.5mldns溶液。然后将混合物煮沸15min，冷却以停止反应。用分光光度计在od540下测定生成的d-(+)-半乳糖醛酸。
60.6)将上述酶提取物吸取1ml，反应混合物包含1ml 0.1m乙酸钠缓冲液和1ml稀释酶提取样品。37℃孵育10min后，加入2ml 0.5mmabts。一分钟后，在od420下用分光光度计(ε
420
＝3.6
×
10-4
m-1
×
cm-1
)测量混合物。测定酶活最高为发酵第4d，外切葡聚糖酶、果胶酶、漆酶活性最高分别为60.31u/g、65.99u/g、62.30u/g，测得总黄酮得率高于未发酵甘草药渣总黄酮得率的75％。
61.实施例2
62.利用cosmologic软件进行计算机模拟的低共融溶剂的设计，包括以下步骤：
63.1)先对水、甘草素进行化学参数的计算，得到化学模型和参数。
64.2)对两种物质进行sigma-profile、sigma-surface进行计算，预测得出目标化合物在乙二醇和四丙基溴化铵中，含水量20％、摩尔比1:1中的溶解度最佳。
65.实施例3
66.按表1中所示氢键受体(hba)和氢键供体(hbd)及其摩尔比制备低共熔溶剂(根据
abbott et al.chemical communications 2003,9:70-1方法)，之后根据响应面优化设计，对甘草药渣中总黄酮进行提取，在提取时间60min、提取温度80℃、固液比1：6时，计算总黄酮得率最高为15.15
±
0.08mg/g。
67.表1氢键供体与氢键受体含水量及摩尔比优化
[0068][0069]
实施例4
[0070]
将5kg的甘草药渣用低共熔溶剂的提取后，过滤、浓缩，d101大孔树脂进行吸附、装柱，用水洗脱糖、盐等可溶性杂质，分别用乙醇：水(20:80-99:1)进行逐步洗脱，每个梯度洗脱剂为1bv，流速为1.5bv/h，选择含目标化合物馏分。然后将上组馏分依次用mcl凝胶柱、ods柱、sephadex lh-20葡聚糖凝胶柱进行吸附，分别用乙醇：水进行逐步洗脱，每个梯度洗脱剂为1bv，流速为1.5bv/h，得到甘草素化合物。经液质及核磁测定，纯度达到97％。
[0071]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。